陜西省人民醫(yī)院臨床檢驗中心(西安710068)

謝小娟 潘晶晶△ 侯慧蓮 李 旭 陳 葳△▲

?

長鏈非編碼RNA UCA1與miRNA-99b在膀胱癌細(xì)胞株和膀胱癌組織表達(dá)的相關(guān)性分析*

陜西省人民醫(yī)院臨床檢驗中心(西安710068)

謝小娟 潘晶晶△侯慧蓮 李 旭 陳 葳△▲

目的： 驗證LncRNA UCA1與miRNA-99b的相關(guān)性。方法：采用熒光定量PCR法檢測UCA1和miRNA-99b在過表達(dá)和敲低表達(dá)UCA1的膀胱癌細(xì)胞、膀胱癌組織中的表達(dá)。結(jié)果：在敲低UCA1表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞5637中，UCA1表達(dá)下調(diào)60%，而miRNA-99b的表達(dá)上調(diào)250%；在過表達(dá)UCA1的膀胱癌細(xì)胞UMUC2中，UCA1表達(dá)上調(diào)410%，而miRNA-99b的表達(dá)下調(diào)60%；UCA1在膀胱癌中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(P<0.05)，而miRNA-99b在膀胱癌中的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織(P<0.05)；UCA1與miRNA-99b在膀胱癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(R=-0.502,P<0.05)。結(jié)論：UCA1負(fù)向調(diào)節(jié)miRNA-99b的表達(dá),但是它對miRNA-99b的調(diào)節(jié)在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制還需深入研究。

長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,LncRNA),是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt的RNA分子；miRNA是高度保守的小非編碼RNA,長度約20～25nt。最近許多研究表明LncRNA與miRNA之間可通過相互調(diào)控作用來影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本實驗室在2008年發(fā)現(xiàn)了一個與膀胱癌密切相關(guān)的LncRNA：UCA1(urothelial carcinoma associated 1)基因。為了找到UCA1基因可能調(diào)控的miRNA,本實驗室通過對敲低UCA1表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞株5637和對照細(xì)胞進(jìn)行miRNA表達(dá)譜的高通量測序,發(fā)現(xiàn)在2個細(xì)胞差異表達(dá)的miRNA-99b與UCA1負(fù)相關(guān)。本研究采用熒光定量PCR技術(shù)檢測UCA1和miRNA-99b在膀胱癌細(xì)胞和組織水平的表達(dá),進(jìn)一步驗證兩者的相關(guān)性。

材料與方法

1 材 料 膀胱癌細(xì)胞株(過表達(dá)UCA1的UMUC2、敲低表達(dá)UCA1的5637細(xì)胞)來自西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)分子中心；膀胱癌組織選取2006年5月至2011年1月泌尿外科膀胱癌患者手術(shù)切除標(biāo)本，經(jīng)病理證實，膀胱癌和癌旁組織10對。采集前均經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)及患者知情同意。術(shù)中取材,立即放入液氮中保存后,轉(zhuǎn)入-80℃冰箱長期保存。

2 儀器與試劑 CO2培養(yǎng)箱(Model 3111,美國Thermo Forma公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司,7300)；核酸蛋白濃度分析儀(美國Bio-Rad公司,SmartSpec Plus)；高速冷凍離心機(美國ThermoForma公司，D-37520)；-80℃冰箱(日本SANYO公司，MDF-U4186S)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司)；定量PCR試劑(大連TaKaRa公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)。

3 引物設(shè)計 根據(jù)Gene Bank 中公布的基因序列設(shè)計UCA1引物序列(F：5′-CTCTCCATTGGGTTCACCATTC-3′；R：5′-GCGGCAGGTCTTAAGAGATGAG-3′)和內(nèi)參基因β-actin(F：5′-TCCCTGGAGAAGAGCTACGA-3′；R：5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；miRNA-99b和內(nèi)參基因U6的引物由廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計合成,未提供引物序列。

4 方 法 ①細(xì)胞收集：用含10%小牛血清、150 μg/ml G418的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)5637和UMUC2細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞生長良好,覆蓋瓶底部約90%時,用1 ml Trizol溶液消化貼壁細(xì)胞，收集細(xì)胞后-80℃凍存?zhèn)溆谩＂赗NA提?。喊凑誘rizol試劑說明書提取組織和細(xì)胞RNA,-80℃保存?zhèn)溆谩＂勰孓D(zhuǎn)錄cDNA合成：按照Thermo公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，-20℃保存?zhèn)溆?。④熒光定量PCR：UCA1和β-actin基因PCR反應(yīng)體系(25μl)：cDNA 2 μl、F(10mM) 1 μl、R(10mM)1μl、SYBY Green 12.5 μl、dd H2O 8.5 μl；反應(yīng)條件：94℃ 5 min變性，94℃ 30s、59℃ 30s、72℃ 30s循環(huán)30 次，72℃ 5 min，4℃ ∞。miRNA-99b和U6基因PCR反應(yīng)體系(20 μl)：cDNA 2 μl、F(10mM)0.8 μl、R(10mM)0.8 μl、SYBY Green 10 μl、dd H2O 6.4 μl；反應(yīng)條件：94℃ 5 min變性，94℃ 30 s、59℃ 30 s，循環(huán)40 次，溶解曲線生成。每一標(biāo)本重復(fù)操作3次，結(jié)果取均值。⑤基因表達(dá)水平計算：以2-△CT(△CT=標(biāo)本目的基因CT值-標(biāo)本內(nèi)參基因CT值)表示樣本中目的基因的相對表達(dá)量，△CT越高,表達(dá)量越低。

結(jié) 果

1 UCA1與miRNA-99b在敲低UCA1的膀胱癌細(xì)胞5637中的表達(dá) 見圖1。在敲低UCA1表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞5637(siRNA UCA1)及對照細(xì)胞(siRNA Con)中，UCA1表達(dá)下調(diào)60%,而miRNA-99b表達(dá)上調(diào)250%。

圖1 UCA1與miRNA-99b在5637細(xì)胞中的表達(dá)

2 UCA1與miRNA-99b在過表達(dá)UCA1的膀胱癌細(xì)胞UMUC2中的表達(dá) 見圖2。在過表達(dá)UCA1的膀胱癌細(xì)胞UMUC2(pCDNA3.1-UCA1)及對照細(xì)胞(pCDNA3.1)中，UCA1表達(dá)上調(diào)410%，而miRNA-99b的表達(dá)下調(diào)60%。

圖2 UCA1與miRNA-99b在UMUC2細(xì)胞中的表達(dá)

3 UCA1與miRNA-99b在膀胱癌組織中的表達(dá) 見圖3。UCA1在膀胱癌和癌旁組織中的相對表達(dá)量分別為(0.1129±0.1468)和(0.0030±0.0026)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，即UCA1在膀胱癌中的表達(dá)明顯高于癌旁組織；miRNA-99b在膀胱癌和癌旁組織中的相對表達(dá)量分別為(0.0045±0.0043)和(0.0644±0.0676)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-2.74，P<0.05)，即miRNA-99b在膀胱癌中的表達(dá)明顯低于癌旁組織。

圖3 UCA1與miRNA-99b在膀胱癌及癌旁組織中的表達(dá)

4 UCA1與miRNA-99b在膀胱癌組織中的相關(guān)性分析 見圖4。UCA1與miRNA-99b在膀胱組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(R=-0.502，P<0.05)。

圖4 兩者在膀胱癌及癌旁組織中表達(dá)的相關(guān)性

討 論

LncRNA不編碼蛋白,而是以RNA的形式在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多種層面上調(diào)控基因的表達(dá)水平。生物信息學(xué)分析和實驗證實UCA1是一個LncRNA。組織表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)UCA1在人胚胎各組織中均有不同程度表達(dá),而在絕大多數(shù)成人的正常組織中卻不表達(dá)。在泌尿系統(tǒng)中,UCA1僅在膀胱癌組織中表達(dá)增高,在膀胱正常粘膜、前列腺增生組織和腎癌及相應(yīng)的癌旁組織中均不表達(dá),表明UCA1的表達(dá)具有時間及空間的特異性[1]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),UCA1可以通過PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)CREB的表達(dá),進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞周期[2]。同時,UCA1還能夠調(diào)節(jié)與腫瘤發(fā)生及藥物抵抗相關(guān)基因的表達(dá)。而UCA1調(diào)控膀胱癌發(fā)生發(fā)展的具體作用機制還有待深入研究。

miRNA是廣泛存在于各種生物體中高度保守的非蛋白編碼的小RNA。目前各種研究發(fā)現(xiàn)，miRNA幾乎參與了所有生命活動過程的調(diào)節(jié)，并在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。多項研究表明，miRNA-99b是一個抑癌基因。miRNA-99b調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，參與AKT/mTOR信號通路；通過靶向多個基因，如IGF1R、mTOR、AKT1等調(diào)節(jié)AKT/mTOR信號通路。通過調(diào)節(jié)AKT/mTOR信號通路，促進(jìn)皮膚傷口愈合[3]，抑制宮頸癌細(xì)胞增殖[4]；通過靶向mTOR，增加胰腺癌的放療抵抗力[5]。作為一個抑癌基因，直接靶向FGFR3抑制非小細(xì)胞肺癌[6]，同時還能抑制前列腺特異性抗原PSA和前列腺癌細(xì)胞[7]

最近許多針對LncRNA與腫瘤等疾病的研究表明,LncRNA與miRNA之間可通過相互調(diào)控作用來影響腫瘤的形成和進(jìn)展。LncRNA可以作為ceRNA與其它RNA轉(zhuǎn)錄本競爭相同的miRNA,從而實現(xiàn)相互間的交流與調(diào)節(jié)。近期在關(guān)于RNA轉(zhuǎn)錄本之間互相作用的研究中，提出了一種作為全新基因表達(dá)調(diào)控模式的ceRNA假說：即LncRNA或mRNA假基因轉(zhuǎn)錄物可以作為ceRNA，通過miRNA應(yīng)答元件(miRNA response element，MRE)競爭結(jié)合具有相同MRE的miRNA來調(diào)控基因的表達(dá)水平，從而影響細(xì)胞的功能[8-9]。Cesana等在研究人和鼠的骨骼肌分化過程中，發(fā)現(xiàn)具有MRE轉(zhuǎn)錄本的LncRNA可以競爭性結(jié)合miRNA，調(diào)控miRNA及其靶基因的表達(dá),同時也受miRNA的調(diào)控[10]。

高通量測序發(fā)現(xiàn)miRNA-99b在敲低UCA1表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞5637及對照細(xì)胞中的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量分別為17.4和61.2，即下調(diào)UCA1的表達(dá)，miRNA-99b表達(dá)上調(diào)2.5倍。為了進(jìn)一步驗證測序的結(jié)果,本課題分別在膀胱癌細(xì)胞和組織水平對兩者的相關(guān)性進(jìn)行了驗證，發(fā)現(xiàn)隨著UCA1表達(dá)的升高，miRNA-99b表達(dá)下降，即兩者負(fù)相關(guān)，UCA1調(diào)節(jié)miRNA-99b的表達(dá)。UCA1作為一個與膀胱癌密切相關(guān)的基因，miRNA-99b作為一個腫瘤抑制基因，UCA1調(diào)節(jié)miRNA-99b在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用還有待深入研究。

[1] Xie XJ,Li X,Wang F,etal.Cellular localization and tissue expression pattern of UCA1, a non-coding RNA[J].Journal of Southern Medical University,2010,30(1)：57-60.

[2] Yang C,Li X, Wang Y,etal.Long non-coding RNA UCA1 regulated cell cycle distribution via CREB through P13-K dependent pathway in bladder carcinoma cells[J].Gene,2012,496(1)：8-16.

[3] Jin Y,Tymen SD,Chen D,etal.MicroRNA-99 family targets AKT/mTOR signaling pathway in dermal wound healing [J].PLoS One,2013,8(5)：e64434.

[4] Wang L, Chang L,Li Z,etal.miR-99a and -99b inhibit cervical cancer cell proliferation and invasion by targeting mTOR signaling pathway [J].Med Oncol,2014,31(5)：934.

[5] Wei F,Liu Y,Guo Y,etal.miR-99b-targeted mTOR induction contributes to irradiation resistance in pancreatic cancer[J].Mol Cancer,2013,25(12)：81.

[6] Li Z,Li X,Wu S,etal.Long non-coding RNA UCA1 promotes glycolysis by upregulating hexokinase 2 through the mTOR-STAT3/microRNA143 pathway[J].Cancer Sci,2014,105(8)：951-955.

[7] Sun D,Lee YS,Malhotra A,etal.miR-99 family of MicroRNAs suppresses the expression of prostate-specific antigen and prostate cancer cell proliferation[J].Cancer Res,2011,71(4)：1313-1324.

[8] Salmena L,Poliseno L,Tay Y,etal.A ceRNA hypothesis: the Rosetta Stone of a hidden RNA language [J].Cell,2011,146：353-358.

[9] 涂海峰,武明花,李桂源.lncRNA與miRNA相互調(diào)控作用及其與腫瘤的關(guān)系[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報, 2013,29(11)：1029-1034.

[10] Cesana M,Cacchiarelli D,Legnini I,etal.A ong noncoding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA[J].Cell,2011,147(2)：358-369.

(收稿：2015-04-20)

Correlation analysis of long non-coding RNA UCA1 and miRNA-99b in bladder carcinoma cells and tissues

Center for Clinical Laboratory,Shaanxi Provincial People’s Hospital(Xi’an 710068)

Xie Xiaojuan Pan Jingjing Hou Huilian et al

Objective：To confirm the correlation of LncRNA UCA1 and miRNA-99b.Methods：UCA1 and miRNA-99b were assessed in bladder carcinoma celles with over expression and knockdown of UCA1, and bladder carcinoma tissues. Results: UCA1 was down-regulation by 60%,while miRNA-99b was up-regulation by 250% in bladder carcinoma cell 5637 with knockdown of UCA1. UCA1 was up-regulation by 410%,while miRNA-99b was down-regulation by 60% in bladder carcinoma cell UMUC2 with over expression of UCA1. UCA1 was significantly increased in bladder carcinoma tissues compared with adjacent carcinoma tissues (P<0.05),but miRNA-99b was completely opposite(P<0.05)；The correlation of UCA1 and miRNA-99b in bladder carcinoma tissues was analysised(R=-0.502,P<0.05).Conclusion：UCA1 is negative regulating the expression of miRNA-99b,but it's to be researched in further of the correlation of UCA1 and miRNA-99b in the mechanism of bladder tumorous development.

Urinary bladder neoplasms RNA,long noncoding Gene expression regulation,neoplastic @UCA1 @miRNA-99b

*國家自然科學(xué)基金面上項目(81372151)

膀胱腫瘤 RNA,長鏈非編碼 基因表達(dá)調(diào)控,腫瘤 @UCA1 @miRNA-99b

R737.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.10.002

△西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科

▲通訊作者