金洪波 畢生雷 喬建援 劉 鉞 杜風(fēng)光 郝生印

（河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司，河南 南陽 473000）

生物柴油是一種優(yōu)質(zhì)清潔柴油， 原料可以從各種含油生物中獲得，可以說是取之不盡、用之不竭的能源。 生物柴油具有環(huán)保、安全、可降解、可再生以及燃燒性能優(yōu)良等優(yōu)點，在資源日益枯竭的今天，在能源領(lǐng)域擁有重要的地位和廣闊的發(fā)展前景， 有望取代石化柴油成為替代燃料。

據(jù)報道，2013年中國有近300 萬噸的生物柴油產(chǎn)能，但是由于原料短缺，實際產(chǎn)量還不足90 萬噸。 因此原料短缺嚴(yán)重制約了生物柴油產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

產(chǎn)油微生物是上世紀(jì)50年代興起的研究熱點，它的優(yōu)勢在于培養(yǎng)周期比較短，正常情況下，產(chǎn)油微生物生長周期僅3-20 天，產(chǎn)油微生物胞內(nèi)優(yōu)質(zhì)含量高達(dá)50-80%，占地面積相對傳統(tǒng)產(chǎn)油原料來說要少得多。 作為異養(yǎng)產(chǎn)油微生物的代表， 華東理工大學(xué)的李元廣團(tuán)隊培養(yǎng)的小球藻終了生物量可以達(dá)到144g/L， 中科院大連化物所的趙宗保團(tuán)隊培養(yǎng)的圓紅冬孢酵母終了生物量更是高達(dá)180g/L 以上。 產(chǎn)油微生物的產(chǎn)率高、油脂含量高、生長周期短、占地面積較少的優(yōu)點贏得了廣大研究人員的關(guān)注。

天冠集團(tuán)與清華大學(xué)、中科院大連化物所合作，進(jìn)行了異養(yǎng)小球藻和圓紅冬孢酵母發(fā)酵法制備生物柴油原料的實驗[1-2]，在實驗過程中，課題組發(fā)現(xiàn)使用發(fā)酵法培養(yǎng)具有明顯的比較優(yōu)勢。 本文著重分析了產(chǎn)油酵母的一些優(yōu)勢和發(fā)酵中出現(xiàn)的問題。

1 產(chǎn)油酵母發(fā)酵具備的一些優(yōu)勢

1.1 發(fā)酵中的原料成本較低

圓紅冬孢酵母相對其他產(chǎn)油脂的的發(fā)酵過程來說具有一定優(yōu)勢，酵母細(xì)胞中含油量高（高達(dá)60%-70%），而且產(chǎn)油酵母轉(zhuǎn)化率高（葡萄糖/干粉轉(zhuǎn)化率可達(dá)50%，葡萄糖/油脂轉(zhuǎn)化率可達(dá)30%），因此生產(chǎn)相同數(shù)量的油脂需要培養(yǎng)基原料、發(fā)酵過程中補料相對較少。 而且產(chǎn)油酵母發(fā)酵過程所用的原料比較單一，僅葡萄糖、酵母粉、蛋白胨等四五種， 遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他產(chǎn)油微生物培養(yǎng)所需要的原料種類[3]。 中科院大連化物所的研究成果還表明，圓紅冬孢酵母可以利用菊芋、秸稈等廉價原料，而且生產(chǎn)效率與葡萄糖等高價值原料相差無幾。 這些都使得原料成本相對較低。

1.2 發(fā)酵中的能耗成本較低

圓紅冬孢酵母的生長速度較快， 相對其他產(chǎn)油脂的發(fā)酵過程來說，在發(fā)酵周期方面，圓紅冬孢酵母由于每天干重增加量高（每天干重增加量可以達(dá)到15-20g/L*D），而其他產(chǎn)油微生物一般在異養(yǎng)培養(yǎng)條件下每天干重增加量僅4-9g/L*D，在自養(yǎng)條件下每天干重增加量還不足2g/L*D，生產(chǎn)效率提高了近10 倍。因此生產(chǎn)相同數(shù)量的油脂需要的發(fā)酵時間相對較短。 對于自養(yǎng)發(fā)酵來說，培養(yǎng)時間縮短，那么通入二氧化碳所需要的泵、壓縮機(jī)的耗電量就少，對于異養(yǎng)發(fā)酵來說，培養(yǎng)時間縮短，那么通風(fēng)量、攪拌耗電量都會大大縮短。 因此培養(yǎng)時間縮短意味著消耗的電、風(fēng)、水均相對減少。 同時，在圓紅冬孢酵母的培養(yǎng)過程中，異養(yǎng)培養(yǎng)是產(chǎn)熱的過程，而其他自養(yǎng)產(chǎn)油微生物在培養(yǎng)過程中，為了保持環(huán)境中溫度和濕度的恒定，往往需要使用外在熱源升溫， 這意味著產(chǎn)油酵母異養(yǎng)培養(yǎng)過程與其他自養(yǎng)產(chǎn)油微生物相比節(jié)省了大量的加熱成本。

1.3 控制條件寬松，利于工業(yè)生產(chǎn)

圓紅冬孢酵母在發(fā)酵過程中對葡萄糖的耐受范圍寬，最高濃度高達(dá)15%，作為工業(yè)化生產(chǎn)，可以一次補料到10%以上，從而2-3 天補料一次即可。 較高的葡萄糖耐受范圍可以使培養(yǎng)過程補料的次數(shù)減少， 而其他產(chǎn)油微生物在發(fā)酵過程中， 一般來說耐受葡萄糖濃度最高僅6%。超過最高濃度，將抑制微生物的正常生長和產(chǎn)油的效率。 另外，圓紅冬孢酵母生長比較迅速，在24 小時即可形成種群優(yōu)勢， 其他產(chǎn)油微生物往往需要培養(yǎng)6 天以上才能獲得比較明顯的種群優(yōu)勢，與其他產(chǎn)油微生物相比，染菌機(jī)率明顯降低， 對普通工人的操作水平的要求也相對較低。 因此發(fā)酵操作相對寬松，意味著生產(chǎn)管理更適合普通工人操作。

1.4 染菌機(jī)率較低

圓紅冬孢酵母在短期內(nèi)獲得了種群優(yōu)勢， 使得除霉菌外其他雜菌影響圓紅冬孢酵母生長、 產(chǎn)油的概率幾乎為零。 其他產(chǎn)油微生物在自養(yǎng)條件下，由于培養(yǎng)液中營養(yǎng)豐富，容易受到蟲子、細(xì)菌的污染，從而影響產(chǎn)油微生物的正常生長以及烘干以后干粉的品質(zhì)。 其他產(chǎn)油微生物在異養(yǎng)條件下， 由于需要較長的時間才能完成細(xì)胞數(shù)量的積累，因此在獲得種群優(yōu)勢之前極易受到細(xì)胞、霉菌、酵母菌的污染，一旦發(fā)酵液受到污染，由于產(chǎn)油微生物獲得營養(yǎng)物質(zhì)的能力弱于雜菌、生長速度弱于雜菌，會出現(xiàn)細(xì)胞濃度生長停滯、胞內(nèi)油脂含量下降等問題。

2 發(fā)酵過程染菌問題初探

搖瓶試驗與發(fā)酵罐中培養(yǎng)有較大的差別。 首先，發(fā)酵罐中培養(yǎng)時只能使用搖瓶接種或者上一級種子罐接種，為了減少生產(chǎn)成本， 種子罐的放大梯度一般僅為10 倍，因此接種量沒有辦法像搖瓶培養(yǎng)一樣達(dá)到20%甚至50%的接種量。 其次， 搖瓶中溶解氧的獲得主要依賴搖床搖動，使環(huán)境中氧氣溶解到培養(yǎng)基中。 而在室溫下物料的溶解氧數(shù)量比較有限， 因此搖瓶培養(yǎng)過程中圓紅冬孢酵母細(xì)胞獲得的溶解氧數(shù)量有限，影響了生長速度。 最后，搖瓶生長環(huán)境比較封閉，為了保證種子培養(yǎng)效果，搖床一般會放置到無塵室內(nèi)， 因此圓紅冬孢酵母在培養(yǎng)過程中受到污染的概率極低。 為了探討圓紅冬孢酵母異養(yǎng)培養(yǎng)的生長特性， 本課題組先后進(jìn)行了50 升小試和1500 升中試， 在發(fā)酵過程中，50 升小試和1500 升中試出現(xiàn)了一些不同的問題，針對這些問題本課題組做了初步分析，并提出了相應(yīng)的解決方法。

2.1 50 升小試

按標(biāo)準(zhǔn)配方進(jìn)行發(fā)酵， 出現(xiàn)了前期酵母細(xì)胞數(shù)增長較慢的現(xiàn)象，結(jié)果是較少的細(xì)胞濃度增殖速度較慢，并且在整體上拉長發(fā)酵周期，造成電、風(fēng)的消耗增加。 針對這一現(xiàn)象分析原因可能是以下幾點。

一是發(fā)酵接種量稍低。 對于50 升發(fā)酵來說，初始培養(yǎng)基一般為30 升，接種500 毫升種子接種量低，僅有1/60，初始細(xì)胞濃度較低使發(fā)酵生長緩慢。 因此，為了縮短發(fā)酵周期需要提高接種量， 具體做法就是減小初始培養(yǎng)基的體積，以期在種子數(shù)量不變的情況下提高接種量。

二是發(fā)酵底料中初始糖濃度太高。 細(xì)胞接到發(fā)酵罐中以后需要有一個適應(yīng)階段，因此出現(xiàn)了近16 小時的生長停滯期。 發(fā)酵初期圓紅冬孢酵母種群不占優(yōu)勢，為了減少補料引起的染菌，減少補料次數(shù)，在發(fā)酵培養(yǎng)基里初始糖濃度比較高。 圓紅冬孢酵母種子在搖瓶中培養(yǎng)結(jié)束時糖含量基本為1%左右， 而到了發(fā)酵罐中糖含量高達(dá)10%，滲透壓的劇烈變化影響了產(chǎn)油酵母的正常生長。 解決的辦法就是降低發(fā)酵底料初始糖濃度， 將初始糖濃度降低到3%，然后將補料時間由第4 天提前到第2 天。 這樣做雖然在第2 天， 圓紅冬孢酵母細(xì)胞數(shù)量還沒有達(dá)到絕對優(yōu)勢， 但是在對數(shù)生長期圓紅冬孢酵母細(xì)胞數(shù)量通常在10 億/毫升，而且增值迅速，能夠避免受到污染。

三是發(fā)酵中后期，干物質(zhì)增加緩慢。 造成這種現(xiàn)象的原因主要是發(fā)酵底物濃度和發(fā)酵液體積增加過快， 圓紅冬孢酵母在生長過程中油脂積累速度較快， 因此為了維持正常的葡萄糖含量，每天需要補料1-2 升。 但是補料時使用的葡萄糖的濃度僅僅為50%左右， 不斷的補料造成發(fā)酵液體積增加，而發(fā)酵穩(wěn)定期，圓紅冬孢酵母主要是積累胞內(nèi)油脂數(shù)量，細(xì)胞增殖極慢。 補料體積增加較快、圓紅冬孢酵母酵母數(shù)量增加較慢， 導(dǎo)致補料相對稀釋了酵母細(xì)胞的數(shù)量。 解決的辦法是，減小初始培養(yǎng)基的體積，以騰出空間補料和提高初始的接種量。 另外，發(fā)酵底物中除氮源濃度以外，其他如碳源和微量元素等，胞內(nèi)需要保持在一定的濃度， 以刺激產(chǎn)油酵母的細(xì)胞增殖和油脂生成。 關(guān)于補料，需要注意的是碳源在溶解過程中，水的添加以能溶解碳源為標(biāo)準(zhǔn)，不需要添加太多的水，否則會造成發(fā)酵液體積增長過快，終了干物質(zhì)含量上不去。

2.2 1500 升中試

50 升發(fā)酵是介于實驗室研究和工業(yè)生產(chǎn)之間的階段，可以探討實驗室研究在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用的不足，也可以尋找相應(yīng)的解決方案。 但是50 升發(fā)酵是一個相對孤立的發(fā)酵過程，不能夠連續(xù)生產(chǎn)，因此仍然需要開展中試來進(jìn)一步放大發(fā)酵試驗， 以發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程中有可能影響工業(yè)化的問題。

2.2.1 堿管堵塞

發(fā)酵過程中，出現(xiàn)過加堿系統(tǒng)不銹鋼管道堵塞現(xiàn)象。原因是： 為了保證發(fā)酵過程不染菌， 罐壓需要維持在0.1mpa 左右。 堿液濃度一般配40%， 接近溶解度的臨界點。 在流加的時候，如果風(fēng)壓有波動，導(dǎo)致罐壓較高，堿液會在流加管中析出， 從而堵塞流加管。 或者外界溫度較低，堿液在較低的溶解度下析出顆粒狀物質(zhì)，久而久之就會堵塞流加管道。

出現(xiàn)這種現(xiàn)象主要從兩方面解決， 一是盡量使用配好的堿液的上清部分，沉淀的雜質(zhì)舍去不用。 批量采購的工業(yè)級氫氧化鈉中通常有一定的雜質(zhì)， 在配成堿液并降溫至室溫后，會有一些不溶性物質(zhì)析出，這些低溶解度的物質(zhì)如果被蠕動泵堿流加壓到流加管中， 有可能在某些管道拐彎處沉積下來。 二是盡量使用30%左右濃度的堿液，這樣就會避免天氣溫度變化造成堿溶解度不同。 堿液濃度降低，會相應(yīng)增加將pH 調(diào)節(jié)到正常水平所消耗的堿液體積，但是正常情況下，發(fā)酵過程中消耗堿液僅占總補料體積的十分之一，對整個發(fā)酵過程影響極小。 三是將罐壓降低到0.08mpa 左右， 罐壓的降低有可能增加染菌的機(jī)率，但是在保持正壓的條件下，染菌機(jī)率還是相對較低的。

2.2.2 染菌

染菌是發(fā)酵過程中一種比較普遍的現(xiàn)象。 出現(xiàn)染菌的原因主要有：風(fēng)壓波動較大，引起進(jìn)風(fēng)口、排風(fēng)口倒吸，補料過程操作不嚴(yán)謹(jǐn)帶入細(xì)菌。 染菌以后通常做法是立即高溫滅菌，并對環(huán)境反復(fù)消毒，這樣做結(jié)果是浪費前期投入的培養(yǎng)基、補料，以及過程中消耗的能源。 為了避免發(fā)生染菌現(xiàn)象， 綜合考慮1500 升每次出現(xiàn)的染菌時間，染菌后出現(xiàn)的現(xiàn)象，以及發(fā)酵平臺當(dāng)時的其他操作等，我們大致總結(jié)出以下幾點注意事項。

一是，風(fēng)系統(tǒng)中主渠道與分管道的配比是否合適，如果使用風(fēng)的設(shè)備較多，主渠道就要相應(yīng)粗一些，且單臺設(shè)備應(yīng)當(dāng)配置單獨的進(jìn)風(fēng)管道和排風(fēng)管道， 這就不會導(dǎo)致單臺設(shè)備用風(fēng)量較大時，其他設(shè)備風(fēng)壓波動較大。 通常情況下，為了保持現(xiàn)場的美觀，在生產(chǎn)車間往往將多臺發(fā)酵罐的排風(fēng)管道和進(jìn)風(fēng)管道合并在一起。 這種布局正常情況下不會出現(xiàn)問題， 但是如果出現(xiàn)風(fēng)壓大幅波動或者風(fēng)壓歸零的情況， 極有可能引起雜菌通過管道被倒吸進(jìn)發(fā)酵罐中。 另外，多臺發(fā)酵罐的排風(fēng)管道和進(jìn)風(fēng)管道合并在一起，也不利于在發(fā)酵罐實消階段徹底殺菌。

二是，風(fēng)壓是否合適，不能太低，以免多個設(shè)備同時用風(fēng)時造成風(fēng)壓波動太大。 如果保持0.05mpa 以上的壓力，風(fēng)壓即使保持波動也能維持在正壓的范圍內(nèi)。 而罐壓低于0.05mpa，如果風(fēng)壓波動較大，或者是空氣壓縮機(jī)、風(fēng)管道出現(xiàn)問題，有可能使罐壓在某個時間段內(nèi)為零，從而導(dǎo)致外界細(xì)菌進(jìn)入到發(fā)酵罐內(nèi)，造成污染。

三是，在前兩點的前提下，要注意操作其他設(shè)備對正在發(fā)酵的設(shè)備的風(fēng)壓波動的影響。 在生產(chǎn)車間里，管道上的閥門比較大， 操作人員往往使用加力桿來開啟和關(guān)閉閥門，結(jié)果是閥門往往被快速開啟或關(guān)閉，引起其他用風(fēng)管道的壓力大幅波動。 如果管道設(shè)置不當(dāng)，再加上系統(tǒng)風(fēng)壓劇烈波動，就會引起染菌。

四是，無論操作多么完善，也不可能比得上無塵室的環(huán)境，而且在無塵室中也會染菌。 因此在生產(chǎn)車間，要時刻防止染菌，在染菌以后應(yīng)當(dāng)及時挽救。 從目前的研究成果來看，可以通過添加青霉素等抑菌劑，破壞雜菌的細(xì)胞膜合成，抑制雜菌的生長。 而產(chǎn)油酵母的生長雖然不能和正常發(fā)酵過程相媲美， 但是仍然能夠達(dá)到一個較高的水平，從而減少因為染菌而造成的物料和能源消耗。 課題組在染菌后加入500ppm 的青霉素取得了較好的效果，能夠保證實驗順利進(jìn)行下去。

3 結(jié)論

微生物發(fā)酵法制備生物柴油原料具有較多優(yōu)勢，是生物能源領(lǐng)域重要的組成部分，但是作為一種新生事物，還需要不斷完善。 生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)不斷完善生產(chǎn)系統(tǒng)，以滿足產(chǎn)油微生物生長的需求。 研究人員需要不斷嘗試，篩選新的菌株、開發(fā)更貼近生產(chǎn)應(yīng)用的原料，還需要開發(fā)新的工藝以提高生產(chǎn)效率、降低成本，使微生物發(fā)酵制備生物柴油早日實現(xiàn)工業(yè)化。

［1］畢生雷，張成明，李十中，等.異養(yǎng)小球藻半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)油脂工藝探討［J］.食品與發(fā)酵科技，2014（05）:36-40.

［2］畢生雷，喬建援，劉鉞，等.異養(yǎng)小球藻用發(fā)酵罐的使用與維護(hù)［J］.化學(xué)工程與裝備，2014（07）:64-65.

［3］馬勇，圖雅，劉曉光等.產(chǎn)油酵母菌高產(chǎn)培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分優(yōu)化［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（23）:5832-5835.