劉奕 周榮靜 吳紅崑

1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院口腔科，成都 610072；2.聊城市人民醫(yī)院口腔科，聊城 252000；3.口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 華西口腔醫(yī)院特需門診（四川大學(xué)），成都 610041

牙髓根尖周病是最常見(jiàn)的口腔疾病，嚴(yán)重影響人類的口腔和全身健康。根管治療術(shù)是目前治療牙髓根尖周病最有效的方法，但臨床研究顯示，即使經(jīng)過(guò)完善的根管治療，患牙仍存在4%～15%的失敗率[1]，而進(jìn)行根管再處理的成功率僅為66%～74%[2]。糞腸球菌以生物膜的形式定植于根管系統(tǒng)[3]，是導(dǎo)致根管治療再感染的主要微生物之一，是目前評(píng)價(jià)根管治療過(guò)程中各種感染清除措施有效性最常采用的目標(biāo)菌種。研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，臨床常用的根管消毒劑氫氧化鈣在體內(nèi)外環(huán)境中對(duì)糞腸球菌無(wú)明顯抑制作用。目前臨床上尚未找到一種對(duì)糞腸球菌安全有效的根管消毒藥物。

納米羥磷灰石復(fù)合材料作為一種新型無(wú)機(jī)材料，安全無(wú)毒，生物相容性好，廣泛用于醫(yī)療各領(lǐng)域。銀、釔、鈰等金屬離子的加入，更賦予材料一定的抑菌性能。目前，納米復(fù)合抗菌材料多應(yīng)用于種植體表面涂層、骨修復(fù)、充填修復(fù)等領(lǐng)域，也有部分學(xué)者曾研究這類材料的防齲功能，但對(duì)其在根管治療領(lǐng)域的應(yīng)用研究還比較少見(jiàn)。特別是對(duì)難治性牙髓根尖周病變中的常見(jiàn)菌——糞腸球菌影響的研究還罕見(jiàn)報(bào)道。本課題通過(guò)比較4種納米羥磷灰石復(fù)合材料對(duì)糞腸球菌的影響，擬篩選一種對(duì)糞腸球菌有高效抑制作用的根管消毒藥物，為無(wú)機(jī)納米材料在根管治療領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

載銀納米羥磷灰石水溶膠（Ag/nHA）、載釔納米羥磷灰石水溶膠（Yi/nHA）、載鈰納米羥磷灰石水溶膠（Ce/nHA）、納米羥磷灰石水溶膠（nHA）（四川大學(xué)納米生物材料研究中心）；糞腸球菌（ATCC29212）由四川大學(xué)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

光學(xué)顯微鏡（Nikon公司，日本），隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），ProtoCOL SR全自動(dòng)抑菌環(huán)測(cè)量?jī)x（Synbiosis公司，英國(guó)），Microstation全自動(dòng)微生物鑒定儀（Biolog公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料溶液的配制 采用透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察各組復(fù)合納米微晶的形貌和尺寸，納米微晶晶化好，形貌均為納米級(jí)針狀微晶。分別取復(fù)合納米羥磷灰石水溶膠（Ag/nHA、Yi/nHA、Ce/nHA、nHA）3 000 r·min-1離心2 min，去上清液。無(wú)菌去離子水超聲振蕩下分散，配制成濃度為320 g·L-1的納米微晶溶膠貯存液備用。

1.2.2 糞腸球菌菌懸液的配制 取糞腸球菌的牛奶保存液50 μL，接種于普通瓊脂（BA）固體培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行細(xì)菌復(fù)蘇。挑取部分菌落革蘭染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察菌落的形態(tài)，鏡檢無(wú)污染，涂片檢查證實(shí)為純培養(yǎng)后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，備用。

無(wú)菌接種環(huán)挑取經(jīng)鑒定的純培養(yǎng)單個(gè)糞腸球菌菌落置于含2 mL BA液體培養(yǎng)基的康氏管中進(jìn)行24 h增菌，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）配制成濃度為1×107、1×104、1×103CFU·mL-1的糞腸球菌菌懸液備用。

1.2.3 瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn) 用微量加樣槍吸取濃度為1×107CFU·mL-1的糞腸球菌菌懸液50 μL，滴加于直徑為90 mm的BA瓊脂平皿上，無(wú)菌玻棒涂抹均勻。每個(gè)平皿平均劃分5個(gè)加樣區(qū)，加樣區(qū)分別加20 μL濃度為320 g·L-1的實(shí)驗(yàn)材料溶膠，生理鹽水濾紙片為空白對(duì)照。室溫放置1 h后，100%濕度、37 ℃有氧條件下，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。ProtoCOL SR全自動(dòng)抑菌環(huán)測(cè)量?jī)x測(cè)量不同實(shí)驗(yàn)材料對(duì)糞腸球菌的抑菌環(huán)直徑大小。每種實(shí)驗(yàn)材料均設(shè)置5個(gè)平行對(duì)照組，分別記錄20 μL實(shí)驗(yàn)材料溶膠在BA平皿上的直徑、抑菌環(huán)的直徑，并且觀測(cè)不同實(shí)驗(yàn)材料的抑菌環(huán)范圍。

1.2.4 最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測(cè)定 含實(shí)驗(yàn)材料瓊脂平皿的配制：采用對(duì)倍系列稀釋法，用無(wú)菌去離子水將實(shí)驗(yàn)材料貯存液對(duì)倍稀釋成系列濃度的實(shí)驗(yàn)材料液：32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5 g·L-1。分別取上述不同濃度的實(shí)驗(yàn)材料液2 mL，加18 mL溫度為48～50 ℃的BA瓊脂混合均勻后鋪板，配制成含系列濃度實(shí)驗(yàn)材料溶膠的瓊脂平皿：32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5 g·L-1。每種材料相應(yīng)濃度各3個(gè)平皿，以普通瓊脂平皿為空白對(duì)照。

采用瓊脂稀釋法，用微量加樣槍分別吸取濃度為1×104CFU·mL-1、1×103CFU·mL-1的糞腸球菌菌懸液5 μL，點(diǎn)種于含系列濃度實(shí)驗(yàn)材料溶膠的瓊脂平皿表面。兩種濃度的菌懸液各點(diǎn)種3個(gè)點(diǎn)種點(diǎn)，一個(gè)平皿上共6個(gè)點(diǎn)種點(diǎn)。恒溫培養(yǎng)箱37 ℃有氧條件下培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)菌落數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件對(duì)不同實(shí)驗(yàn)材料對(duì)兩種實(shí)驗(yàn)濃度糞腸球菌的抗菌活性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較分析。

2 結(jié)果

2.1 瓊脂擴(kuò)散法結(jié)果

瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)表明，Ag/nHA、Yi/nHA、Ce/nHA、nHA、空白對(duì)照點(diǎn)種直徑分別為（5.75±0.38）、（5.89±0.48）、（5.95±0.33）、（6.04±0.38）、（6.05±0.06）mm，不同實(shí)驗(yàn)材料點(diǎn)種直徑間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.545，P>0.05）。不同實(shí)驗(yàn)材料的抑菌環(huán)直徑大小有可比性。與空白對(duì)照相比，Ag/nHA周圍有明顯的抑菌環(huán)，抑菌環(huán)直徑為（8.17±0.70）mm，抑菌范圍為（2.42±0.44）mm。而Yi/nHA、Ce/nHA、nHA均未表現(xiàn)出抑制糞腸球菌的作用（圖1）。

2.2 瓊脂稀釋法結(jié)果

瓊脂稀釋實(shí)驗(yàn)顯示，Ag/nHA對(duì)糞腸球菌的MIC為1.0 g·L-1。而Ce/nHA、Yi/nHA、nHA對(duì)糞腸球菌的MIC>32.0 g·L-1，在測(cè)試濃度范圍內(nèi)均未表現(xiàn)出抑制糞腸球菌的作用（表1、圖2）。糞腸球菌菌懸液濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)材料抗菌活性的評(píng)價(jià)無(wú)明顯影響，1×103CFU·mL-1和1×104CFU·mL-1兩種濃度菌懸液實(shí)驗(yàn)組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1）。

圖1 不同納米羥磷灰石復(fù)合材料對(duì)糞腸球菌的影響Fig 1 Effects of different nano hydroxyapatite composite material on Enterococcus faecalis

表1 細(xì)菌濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)材料抗菌活性的影響Tab 1 Effect of bacterial concentration on the experiment materials

圖2 含不同實(shí)驗(yàn)材料瓊脂平皿上糞腸球菌的生長(zhǎng)情況Fig 2 The growth of Enterococcus faecalis on different agar containing experimental materials

3 討論

糞腸球菌為兼性厭氧的條件致病菌，多定居在人類和動(dòng)物的胃腸和泌尿生殖器官，也可定居在人類口腔[6]，可在多種口腔感染中檢出。糞腸球菌可單獨(dú)或與鏈球菌、中間普雷沃菌、具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌等細(xì)菌混合感染根管[7-8]。以往研究[9-11]發(fā)現(xiàn)未經(jīng)治療的感染根管內(nèi)糞腸球菌的檢出率為24%～42%；在慢性根尖周炎患牙根管中糞腸球菌的檢出率為60%，而在根管治療后再感染的病例中檢出率則高達(dá)76%；在根管治療失敗的病例中，糞腸球菌的檢出率為77%。甚至有實(shí)驗(yàn)研究[12]表明，在已充填根管內(nèi)糞腸球菌的陽(yáng)性率高達(dá)80%。就診次數(shù)大于10次的13例根管治療病例中，12例感染根管內(nèi)均可以檢測(cè)到糞腸球菌的存在[13]。糞腸球菌對(duì)機(jī)械預(yù)備及多種殺菌藥物具有廣泛的抵抗力[14]，并且可在組織液環(huán)境中粘接于牙本質(zhì)膠原、侵入牙本質(zhì)小管造成再感染，是難治性根尖周炎和根管治療后再感染的主要病原菌之一[15]，是評(píng)價(jià)根管治療過(guò)程中各種感染清除措施有效性最常采用的目標(biāo)菌種。因此，本實(shí)驗(yàn)選用糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)株作為實(shí)驗(yàn)菌種。

復(fù)合納米羥磷灰石無(wú)機(jī)抗菌材料，具有納米材料和復(fù)合材料的雙重特性，具備耐高溫、抗菌譜廣、長(zhǎng)效、安全、無(wú)二次污染等特點(diǎn)，逐漸成為抗菌材料領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，但對(duì)該類材料在根管治療領(lǐng)域的應(yīng)用研究還比較少見(jiàn)。本課題選用的Ag/nHA、Ce/nHA、Yi/nHA、nHA是由四川大學(xué)納米生物材料研究中心采用溶膠-凝膠法原位制備的納米羥磷灰石復(fù)合材料，本身具有抗菌作用的金屬元素與具有較大表面能的納米羥磷灰石結(jié)合，顯示出獨(dú)特的生物活性。研究[16]表明，納米羥磷灰石對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯和連續(xù)的抗菌性能；Ag/nHA對(duì)牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌、消化鏈球菌等多種口腔常見(jiàn)菌具有較強(qiáng)的抑制作用[17]；且適宜濃度的Ag/nHA對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖無(wú)明顯抑制作用，生物相容性良好[14]；Yi/nHA對(duì)變異鏈球菌、黏性放線菌和牙齦卟啉單胞菌等口腔感染性疾病的主要致病菌有抑制作用[18]；經(jīng)溶膠-凝膠-超臨界點(diǎn)干燥法合成的Ce/nHA由Ce3+替代羥磷灰石結(jié)構(gòu)中的Ca2+，具有較高的溶解度，通過(guò)Ce3+的釋放來(lái)發(fā)揮對(duì)大腸埃希菌、乳桿菌的抑菌作用[19]。但關(guān)于此類材料對(duì)感染根管內(nèi)的常見(jiàn)菌糞腸球菌影響的研究，國(guó)內(nèi)外均尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)選用四川大學(xué)納米生物材料研究中心提供的4種納米復(fù)合材料，通過(guò)體外評(píng)價(jià)其對(duì)糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)游離株的影響，擬篩選出一種對(duì)糞腸球菌有高效抑制作用的無(wú)機(jī)抗菌材料，并為該材料在根管治療領(lǐng)域的應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

藥物敏感實(shí)驗(yàn)是根據(jù)致病菌對(duì)不同抗菌藥物敏感性的差異來(lái)測(cè)定抗菌藥物抑制或殺滅細(xì)菌能力的一種實(shí)驗(yàn)方法，常用的有瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)和瓊脂稀釋實(shí)驗(yàn)。瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察實(shí)驗(yàn)材料周圍抑菌環(huán)直徑的大小，初步評(píng)價(jià)不同實(shí)驗(yàn)材料的抑菌性能。為了避免實(shí)驗(yàn)材料擴(kuò)散性因素的影響，本實(shí)驗(yàn)將制備好的瓊脂平皿放置在室溫條件下1 h，并貯存于37 ℃、100%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中24 h，以便于材料擴(kuò)散。使用ProtoCOL SR全自動(dòng)抑菌環(huán)測(cè)量?jī)x測(cè)量抑菌環(huán)直徑大小，在一定程度上避免了人工測(cè)量引起的誤差，具有一定的實(shí)用性。

本研究的瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)和瓊脂稀釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，Ag/nHA對(duì)糞腸球菌有較好的抑制作用，其MIC為1.0 g·L-1；而其Ce/nHA、Yi/nHA和nHA在測(cè)試濃度范圍內(nèi)均未表現(xiàn)出抑制糞腸球菌的作用。以往研究[20]發(fā)現(xiàn)銀離子本身具有較強(qiáng)的抗菌活性，可通過(guò)分裂細(xì)菌細(xì)胞膜、干擾細(xì)菌呼吸鏈、抑制細(xì)菌DNA合成等多重殺菌機(jī)制，對(duì)銀離子耐受的細(xì)菌很少，也難通過(guò)變異產(chǎn)生耐藥性。此外，銀離子的抗菌時(shí)效很長(zhǎng)，并能抑制多源性細(xì)菌聚集。有學(xué)者[21]認(rèn)為納米銀的作用方式與Ag離子相似，納米銀顆粒直徑極小（10～100 nm），它具備獨(dú)特的小尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)，可以令其輕易地進(jìn)入病原體內(nèi)，迅速與細(xì)菌中的巰基結(jié)合，降低細(xì)菌合成酶的活性，從而達(dá)到殺滅細(xì)菌的目的。納米銀的Ag＋還能破壞微生物的電子傳輸系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和營(yíng)養(yǎng)傳輸系統(tǒng)[22]。納米羥磷灰石作為吸附劑大大改善了材料對(duì)細(xì)菌的吸附能力，使Ag/nHA達(dá)到良好的殺菌作用。國(guó)內(nèi)學(xué)者[23]研究發(fā)現(xiàn)，激光共聚焦顯微鏡下見(jiàn)隨著0.1%納米銀溶液處理牙本質(zhì)表面時(shí)間的延長(zhǎng)，糞腸球菌生物膜平均厚度逐漸減少，至24 h生物膜內(nèi)無(wú)活菌。本課題組也在進(jìn)一步研究Ag/nHA對(duì)體外牙根管內(nèi)糞腸球菌生物膜的影響及其作用機(jī)制。Ag/nHA有望成為一種新型的根管治療藥物，使再感染根管患牙達(dá)到良好的治療效果，但其最佳臨床應(yīng)用方法及其劑型有待進(jìn)一步深入研究。

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