胡菊花 李倩 王艷青 李頌

安徽醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·附屬口腔醫(yī)院，安徽省口腔疾病研究中心實(shí)驗(yàn)室，合肥 230032

慢性根尖周炎主要由感染根管內(nèi)的細(xì)菌感染引起，以根尖部炎癥及牙槽骨破壞為特征；這是局部免疫反應(yīng)的結(jié)果，這一免疫反應(yīng)由炎癥細(xì)胞及其產(chǎn)物介導(dǎo)[1]。研究[2-5]證實(shí)，多種炎癥細(xì)胞存在于根尖周炎病損組織中，而淋巴細(xì)胞則是最主要的炎癥細(xì)胞；淋巴細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-17、干擾素γ、腫瘤壞死因子α、破骨細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）等已被證實(shí)參與根尖周炎的發(fā)病機(jī)制。

IL-21是近年來(lái)備受關(guān)注的淋巴細(xì)胞因子，主要由CD4+T淋巴細(xì)胞分泌，屬于IL-2家族。IL-21參與多種疾病的發(fā)病，例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[6]和炎性腸病等[7]。有研究[8-10]顯示，IL-21也參與口腔疾病的發(fā)生。慢性牙周炎患者齦溝液及炎癥牙齦組織中IL-21的水平明顯高于正常人群[8]；牙周炎非手術(shù)治療后，IL-21的表達(dá)水平顯著下降[9]。這些研究結(jié)果表明IL-21可以促進(jìn)牙周炎的病變進(jìn)展。與牙周炎相似，根尖周炎也是細(xì)菌感染性疾病，其特征也是炎癥與骨破壞；但是關(guān)于IL-21與人慢性根尖周病的關(guān)系尚罕見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在檢測(cè)IL-21在人慢性根尖周炎中的表達(dá)情況，并探討與骨破壞大小和叩痛的關(guān)系，探討IL-21在根尖周炎發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要儀器

Olympus CX21FS1型光學(xué)顯微鏡（Olympus公司，日本），Spot Advanced顯微攝像系統(tǒng)（Diagnostic Instrument公司，美國(guó)），Image-Pro-Plus 6.0圖像處理系統(tǒng)（Media Cybemetics公司，美國(guó)），隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GNP-9160型，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司），E200型Nikon生物顯微鏡（Nikon公司，日本），RMZ125型LEICA組織切片機(jī)（Leica公司，德國(guó)），F(xiàn)YL-YS-128型福意聯(lián)低溫冰柜（北京福意電器有限公司），SY1-SZ-93型自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海羽通儀器儀表廠(chǎng)），微波爐（廣東康寶電器有限公司），微型高速離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）。

1.2 樣本采集

收集安徽省口腔醫(yī)院口腔頜面外科2014年1—6月經(jīng)根尖外科手術(shù)或拔牙所獲得的23例根尖囊腫和32例根尖肉芽腫作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)取10例未萌出第三磨牙的健康牙齦組織作為對(duì)照[11]。根尖肉芽腫的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)：根尖部組織形成增生的肉芽組織團(tuán)塊，周?chē)欣w維結(jié)締組織包繞，以炎癥細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為主。根尖囊腫的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)：以各種厚度的纖維囊腔為診斷特征，纖維囊腔被覆復(fù)層鱗狀上皮，厚薄不一，上皮釘突因炎癥刺激發(fā)生不規(guī)則增生、伸長(zhǎng)，相互融合成網(wǎng)狀，上皮表現(xiàn)明顯的細(xì)胞間水腫和以中性粒細(xì)胞為主的上皮內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；纖維組織囊壁內(nèi)炎癥明顯，炎癥浸潤(rùn)細(xì)胞主要為淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞，混雜有中性粒細(xì)胞以及泡沫吞噬細(xì)胞[12]。

記錄樣本宿主的年齡、性別、牙位?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)其他口腔疾病和全身系統(tǒng)性疾病，過(guò)去1個(gè)月內(nèi)未服用抗生素或非甾體類(lèi)抗炎藥物。在進(jìn)行臨床試驗(yàn)之前，所有患者簽署知情同意書(shū)。本項(xiàng)研究獲得了安徽醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的倫理審查批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2014013）。

1.3 臨床檢查

在進(jìn)行根尖外科手術(shù)或拔牙之前，對(duì)患者進(jìn)行口腔一般檢查及影像學(xué)檢查（錐形束CT）并記錄在冊(cè)。根據(jù)記錄資料獲取患者有無(wú)叩痛及其根尖病灶大小。采用雙盲法確定病灶大小，即由不知曉實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡膬擅t(yī)師對(duì)錐形束CT圖像進(jìn)行分析，取根尖低密度影像直徑的平均值進(jìn)行資料分析。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

切取5 μm厚的經(jīng)石蠟包埋的組織切片用于免疫組織化學(xué)研究，所用方法為鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（streptavidin-peroxidase，SP）法。使用兔抗人IL-21（編號(hào)ab154767，Abcam公司，美國(guó)）、山羊抗人RANKL（編號(hào)sc-7628，Santa Cruz Biotechnology公司，美國(guó)）的多克隆抗體作為一抗，兩種抗體所用稀釋倍數(shù)分別為1∶200和1∶150，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程參照SP試劑盒（福建邁新生物技術(shù)有限公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。具體步驟如下：組織切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、脫水后進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加3%過(guò)氧化氫以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，PBS沖洗后滴加正常非免疫動(dòng)物血清于室溫下孵化10 min，除去血清，滴加一抗于4 ℃冰箱中孵化過(guò)夜；然后滴加生物素標(biāo)記的二抗，即羊抗兔/鼠IgG（KIT-9710）和兔抗羊IgG（KIT-9709）（福建邁新生物技術(shù)有限公司），37 ℃下孵育30 min，沖洗，滴加鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺（3,3-diaminobenzidine，DAB）（武漢博士德生物工程有限公司）顯色，蘇木素復(fù)染，封片。陰性對(duì)照組：用PBS代替一抗孵育切片作為陰性對(duì)照。

1.5 陽(yáng)性結(jié)果判定

在光學(xué)顯微鏡低倍鏡下觀(guān)察整張切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（放大400倍）觀(guān)測(cè)IL-21和RANKL的表達(dá)并拍攝圖片。若觀(guān)察到細(xì)胞質(zhì)及核膜上有棕色或褐色顆粒為陽(yáng)性染色（即陽(yáng)性表達(dá)）。采用Image-Pro-plus 6.0圖像處理系統(tǒng)計(jì)量每個(gè)組織切片上IL-21和RANKL的蛋白積分光密度（integrated optical density，IOD）值，采用Excel軟件錄入數(shù)據(jù)以備進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0和Excel軟件進(jìn)行分析。對(duì)計(jì)量資料先進(jìn)行兩組獨(dú)立樣本齊性檢驗(yàn)，若方差齊采用t檢驗(yàn)；利用卡方檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估IL-21表達(dá)率與叩痛有無(wú)相關(guān)性；用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估IL-21與病灶大小及RANKL的相關(guān)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 患者的一般資料

患者資料及樣本信息如表1所示：根尖囊腫患者23例，年齡18～60歲，平均（43.5±12.7）歲；根尖肉芽腫32例，年齡20～65歲，平均（45.3±15.1）歲。2組患者的基本情況無(wú)明顯差異（P>0.05）。

表1 2組樣本的基本資料Tab 1 Demographic data of the two groups of subjects

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見(jiàn)圖1、2，所有病損組織中均檢測(cè)到IL-21、RANKL陽(yáng)性表達(dá)，而正常牙齦組織和陰性對(duì)照組中均未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)。

圖1 IL-21在根尖肉芽腫和根尖囊腫中均有陽(yáng)性表達(dá)，而在陰性對(duì)照組和牙齦組織中無(wú)陽(yáng)性表達(dá) DABFig 1 Presence of IL-21-positive cells in periapical granulomas and radicular cysts,and no expression in negative group and healthy gingival tissues DAB

圖2 RANKL在根尖肉芽腫和根尖囊腫中均有陽(yáng)性表達(dá)，而在陰性對(duì)照組和牙齦組織中無(wú)陽(yáng)性表達(dá) DABFig 2 Presence of RANKL-positive cells in periapical granulomas and radicular c ysts,and no expression in negative group and healthy gingival tissues DAB

根尖囊腫和根尖肉芽腫兩組間IL-21和RANKL的表達(dá)強(qiáng)度及比較見(jiàn)表2，2組間IL-21和RANKL表達(dá)強(qiáng)度的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），在根尖囊腫中的表達(dá)強(qiáng)度高于根尖肉芽腫。

2.3 IL-21與RANKL表達(dá)、根尖病損大小和叩痛的相關(guān)關(guān)系

本研究分析了IL-21與RANKL表達(dá)、根尖病損大小和叩痛的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)表3。在根尖囊腫組，8例（34.78%）患者有叩痛表現(xiàn)，囊腫病損平均大小為7.8 mm；而在根尖肉芽腫組，13例（40.62%）患者有叩痛表現(xiàn)，病灶平均大小為2.9 mm。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，IL-21的表達(dá)水平與叩痛無(wú)關(guān)（P>0.05）。

表2 根尖囊腫組、根尖肉芽腫組及健康牙齦組間IL-21和RANKL的表達(dá)及比較Tab 2 Expression and comparison of IL-21 and RANKL among cyst group,granuloma group and healthy gingival tissues

Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)顯示，在根尖囊腫和肉芽腫中，IL-21的表達(dá)水平與RANKL的表達(dá)水平均具有明顯的相關(guān)性（r值分別為0.935和0.958，P<0.05），IL-21的表達(dá)水平與病損大小也有明顯的相關(guān)性（r值分別為0.828和0.831，P<0.05）（表3）。

表3 根尖囊腫及根尖肉芽腫中IL-21的蛋白表達(dá)與RANKL及根尖病損大小的相關(guān)關(guān)系Tab 3 The correlation among the protein expression of IL-21 and RANKL,lesions size in cyst group and granuloma group

3 討論

眾所周知，根尖周病是根尖組織對(duì)抗細(xì)菌感染的反應(yīng)結(jié)果，包括根尖炎癥和牙槽骨的破壞。這些病損以持續(xù)性的炎癥細(xì)胞遷徙及浸潤(rùn)為特征，例如中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞等。在這些細(xì)胞中，研究者們高度強(qiáng)調(diào)了T淋巴細(xì)胞的作用[13-15]。IL-21是一種主要由CD4+T細(xì)胞分泌的促炎癥細(xì)胞因子，可以上調(diào)炎癥細(xì)胞因子[6,10]及破骨細(xì)胞分化因子[16]的表達(dá)?；谶@些研究結(jié)果，筆者猜測(cè)IL-21可能是參與根尖周炎發(fā)病機(jī)制的炎癥細(xì)胞因子之一，并且可能誘導(dǎo)RANKL蛋白表達(dá)參與根尖部骨質(zhì)吸收作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，IL-21陽(yáng)性細(xì)胞存在于所有根尖周病損組織中，主要由T淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞表達(dá)，但正常牙齦組織并無(wú)IL-21的表達(dá)，這說(shuō)明IL-21可能參與根尖炎癥過(guò)程。Hatori等[11]在研究肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子在慢性根尖周炎中的表達(dá)及作用中，同樣采用健康牙齦組織作為陰性對(duì)照組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-21在健康牙齦組織中無(wú)表達(dá)。此外，根尖囊腫組中IL-21的表達(dá)水平明顯高于肉芽腫組。Teixeira-Salum等[3]和de Carvalho Fraga等[15]研究顯示，根尖囊腫中促炎癥細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α、干擾素γ等表達(dá)量明顯高于根尖肉芽腫，而根尖肉芽腫中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的表達(dá)量高于根尖囊腫，說(shuō)明根尖囊腫炎癥狀態(tài)高于肉芽腫。這些研究結(jié)果可以解釋本研究中IL-21作為促炎癥細(xì)胞因子在囊腫中的表達(dá)水平高于肉芽腫的原因。同樣，病變組織中RANKL的表達(dá)亦明顯高于對(duì)照組，這一結(jié)果與Fan等[17]的研究相一致；RANKL在囊腫中的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于肉芽腫，與張梅華等[18]的研究結(jié)果相同。該結(jié)果提示，RANKL的表達(dá)隨病變發(fā)展而增加，可能是因?yàn)楦饽夷[病變活動(dòng)期骨吸收活躍的緣故。

對(duì)IL-21和RANKL兩細(xì)胞因子的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在根尖囊腫組及肉芽腫組兩個(gè)細(xì)胞因子的表達(dá)均呈明顯正相關(guān)關(guān)系（r值分別為0.935和0.958），這與Kwok等[16]的研究結(jié)果相似。Kwok等[16]提取類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的CD4+T細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞，并將IL-21加入細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行觀(guān)察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著IL-21劑量的增加，RANKL mRNA的表達(dá)量增加，破骨細(xì)胞標(biāo)記物即抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）也隨之增加。這些發(fā)現(xiàn)提示了IL-21可能通過(guò)促進(jìn)RANKL的表達(dá)參與根尖周病的骨破壞過(guò)程。

本研究還發(fā)現(xiàn)，病灶大小和IL-21表達(dá)強(qiáng)度之間存在明顯的相關(guān)性（P<0.05）。Jang等[19]發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠IL-21受體基因，阻斷IL-21/IL-21受體信號(hào)通路，其RANKL的表達(dá)量明顯減少。RANKL是重要的破骨細(xì)胞分化因子，參與根尖骨質(zhì)破壞[5]，RANKL的表達(dá)減少使得骨質(zhì)破壞和病損范圍隨之縮小。這可以解釋本研究中病灶大小與IL-21表達(dá)量呈正相關(guān)的原因。但是，本研究發(fā)現(xiàn)，IL-21的表達(dá)與叩痛無(wú)相關(guān)關(guān)系。這與Dutzan等[10]在牙周炎中的研究結(jié)果不同，他們發(fā)現(xiàn)IL-21與臨床癥狀如探診深度及附著喪失、探診出血具有強(qiáng)相關(guān)性。這種差異的原因目前尚不清楚，還需進(jìn)一步研究。

總之，本研究證明IL-21存在于人慢性根尖周疾病中，且IL-21與RANKL及病灶大小具有正相關(guān)關(guān)系，參與根尖周炎的炎癥及骨吸收過(guò)程，該結(jié)果有助于進(jìn)一步理解根尖周病的發(fā)病機(jī)制和病變的發(fā)展；但還需進(jìn)一步研究以確定IL-21在慢性根尖周炎發(fā)病機(jī)制中的具體作用。

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