杜令倩 楊丕山 葛少華

1.山東大學(xué)第二醫(yī)院口腔科，濟(jì)南 250033；2.山東大學(xué)口腔醫(yī)院牙周病科 山東省口腔生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250012

牙周病治療的最終目標(biāo)是重建因炎癥而破壞的牙周支持組織，關(guān)鍵是有足夠量的功能細(xì)胞遷移到組織缺損區(qū)域，發(fā)揮干細(xì)胞作用，引導(dǎo)牙周缺損組織的再生。然而，由于長期慢性炎癥的影響，病損區(qū)域功能細(xì)胞數(shù)量不足，功能不佳，如何獲得更多的再生性功能細(xì)胞是牙周病治療的關(guān)鍵。近年來，從牙齦組織中分離的牙齦干細(xì)胞（gingival mesenchymal stem cells，GMSCs）受到了高度關(guān)注，無論是在體內(nèi)環(huán)境還是在體外環(huán)境中，GMSCs都顯示出具有多向分化、自我更新和免疫調(diào)節(jié)的能力，并具有組織愈合能力強(qiáng)且無瘢痕愈合的特點(diǎn)[1-2]。此外，GMSCs還具有取材容易、來源豐富、抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能。從病變牙齦組織中分離培養(yǎng)的GMSCs，其自我更新及多向分化能力與健康牙齦組織無明顯差異[3]，因此，牙周病治療過程中，募集病損周圍的GMSCs遷移到缺損區(qū)域，發(fā)揮干細(xì)胞作用以重建牙周組織為牙周組織再生提供新的思路。

趨化因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal cellderived factor-1，SDF-1）即CXCL12，屬于趨化因子CXC家族，它通過激活G-蛋白偶聯(lián)的特異性受體CXCR4，調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖，細(xì)胞遷移及細(xì)胞形態(tài)等活性[4-6]。SDF-1能夠募集骨髓基質(zhì)干細(xì)胞歸巢，調(diào)控其增殖和分化，從而在組織和器官的再生中發(fā)揮重要作用。本課題組在前期研究[7]中證實(shí)，趨化因子具有募集包括牙周膜干細(xì)胞遷移到牙周創(chuàng)區(qū)從而促進(jìn)牙周組織再生的能力。目前關(guān)于SDF-1對(duì)GMSCs的趨化效應(yīng)卻知之甚少，本研究的目的是觀察趨化因子SDF-1受體CXCR4在人GMSCs上的表達(dá)及SDF-1對(duì)人GMSCs的趨化效應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（Hyclone公司，美國），Ⅰ型膠原酶、DispaseⅡ、胰蛋白酶（Gibco公司，美國），維生素C、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、茜素紅、油紅O（Sigma公司，美國），SDF-1（Santa Cruz公司，美國），CXCR4抗體（R&D Systems公司，美國），抗CD44、抗CD73、抗CD90、抗CD105、 抗CD166、抗CD45、抗CD14、抗CD34抗體（BioLegend公司，美國），異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）熒光標(biāo)記二抗、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（北京中杉金橋生物科技有限公司）。各型號(hào)培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶、凍存管、離心管等（Corning公司，美國），70 μm細(xì)胞篩網(wǎng)（Falcon公司，美國）。GBB16 CO2紫外清潔型培養(yǎng)箱（Heraeus公司，德國），DL-CJ-IN型高性能超凈工作臺(tái)（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)公司），BP221S型電子分析天平（德國賽多利斯股份公司），OLYMPUS熒光顯微鏡和成像系統(tǒng)（Olympus公司，日本），流式細(xì)胞分析儀（Beckman Coulter公司，美國）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原代細(xì)胞培養(yǎng) 標(biāo)本的取得經(jīng)山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批編號(hào)為2010015），并獲取患者的知情同意，簽署知情同意書。標(biāo)本取自臨床上需行牙冠延長術(shù)的6例牙周健康患者術(shù)中切除的牙齦組織，分別將牙齦組織剪碎后，移入6個(gè)離心管中，加入3 g·L-1的Ⅰ型膠原酶和4 g·L-1DispaseⅡ輕輕振蕩，37 ℃下消化2 h，通過細(xì)胞篩網(wǎng)獲得單個(gè)離散的細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為60個(gè)·cm-2，接種于含α-MEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基中含20% FBS、2 mmol·L-1L-谷氨酰胺、1 mmol·L-1丙酮酸鈉、50 U·mL-1青霉素、50 μg·mL-1鏈霉素和2.5 μg·mL-1兩性霉素B，37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每隔3 d換液，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底70%～80%后傳代。來自6個(gè)樣本的細(xì)胞分別進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 有限稀釋法分離人GMSCs 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，消化成單細(xì)胞懸液，稀釋至每毫升10個(gè)細(xì)胞，接種于96孔板中，加液至每孔0.1 mL，培養(yǎng)24 h后，在顯微鏡下挑出只含單個(gè)細(xì)胞的孔并標(biāo)記，每隔3 d換液。顯微鏡下觀察孔內(nèi)細(xì)胞形成較大克隆并長至孔底1/3～1/2后，消化并擴(kuò)大培養(yǎng)，此時(shí)獲得的細(xì)胞即GMSCs。

1.2.3 人GMSCs克隆形成能力分析 將GMSCs以每孔500個(gè)細(xì)胞的密度分別接種于六孔板中，培養(yǎng)液為含20%FBS的α-MEM，5%CO2、37 ℃飽和濕度條件下培養(yǎng)14 d，PBS沖洗2遍，4%多聚甲醛固定，甲苯胺藍(lán)染色，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，多于50個(gè)細(xì)胞的集落記為1個(gè)克隆?？寺⌒纬陕剩╟olony forming unitfibroblastic，CFU-F）計(jì)算公式如下：CFU-F=細(xì)胞克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.4 人GMSCs表面抗原的檢測 將GMSCs制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)·mL-1，分別與FITC標(biāo)記的單克隆抗體CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、CD14、CD34、CD45在冰上孵育1 h后，加入二抗（CD14、CD34、CD45不用二抗），冰上孵育30 min，1%多聚甲醛固定，4 ℃避光保存，用流式細(xì)胞儀分析相關(guān)抗原標(biāo)志物的表達(dá)。

1.2.5 人GMSCs多向分化能力的檢測 分別用成骨誘導(dǎo)劑（0.1 μmol·L-1地塞米松，50 mg·L-1維生素C，10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉）、成脂誘導(dǎo)劑（0.5 μmol·L-1地塞米松，60 μmol·L-1吲哚美辛，0.5 mmol·L-1異丁基甲基黃嘌呤，10 mg·L-1牛胰島素）誘導(dǎo)GMSCs向成骨和成脂方向分化，并分別用茜素紅鈣鹽染色法、油紅O染色法來測定GMSCs的多向分化能力。

1.2.6 免疫熒光法檢測SDF-1受體CXCR4在人GMSCs上的表達(dá) 將人GMSCs制成細(xì)胞爬片，進(jìn)行免疫熒光染色。4%多聚甲醛室溫固定15 min，10%山羊血清37 ℃封閉30 min后滴加適量稀釋后的CXCR4抗體（1∶50），以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，置于濕盒中4 ℃孵育過夜。次日在37 ℃下避光孵育l h后加入FITC熒光標(biāo)記的二抗，避光孵育1 h，用5 μg·mL-1DAPI復(fù)染細(xì)胞核5 min，檢測趨化因子SDF-1受體CXCR4的表達(dá)。

1.2.7 SDF-1對(duì)人GMSCs的趨化效應(yīng) 用多聚碳酸膜上有8 μm微孔的24孔Transwell細(xì)胞培養(yǎng)室檢測人GMSCs對(duì)SDF-1的趨化反應(yīng)[7-8]。將第3代GMSCs調(diào)整至細(xì)胞密度為5×105個(gè)·mL-1，在細(xì)胞培養(yǎng)室的上腔分別加入200 μL細(xì)胞懸液（含0.01% FBS的α-MEM培養(yǎng)基），實(shí)驗(yàn)組的下腔分別加入終質(zhì)量濃度為100、200 ng·mL-1SDF-1和50 μg·mL-1CXCR4中和抗體的含0.01%FBS的α-MEM培養(yǎng)基500 μL?？瞻讓?duì)照組下腔中加入含0.01%FBS的α-MEM培養(yǎng)基500 μL。為證實(shí)細(xì)胞的遷移效應(yīng)是由于SDF-1的趨化效應(yīng)而非細(xì)胞的化學(xué)運(yùn)動(dòng)，消除細(xì)胞培養(yǎng)室上下腔中SDF-1的濃度梯度，上下腔中所用培養(yǎng)液均含有100 ng·mL-1SDF-1。所有的樣本均設(shè)有復(fù)孔。37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醛固定濾膜上下表面附著的細(xì)胞30 min，用棉簽輕輕拭去濾膜上表面的細(xì)胞，PBS沖洗。伊紅染色濾膜3 min，PBS沖洗。待濾膜干燥后，計(jì)數(shù)已遷移至濾膜下側(cè)面的細(xì)胞，每個(gè)濾膜隨機(jī)觀察3個(gè)不重疊的高倍視野。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，所得數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理。計(jì)量資料統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

原代培養(yǎng)的人GMSCs呈集落樣生長（圖1A），有限稀釋法體外分離擴(kuò)增獲得人GMSCs（圖1B），人GMSCs具有成纖維細(xì)胞的形態(tài)特征，細(xì)胞多呈長梭形，具有2～3個(gè)細(xì)胞突起，細(xì)胞核居中（圖1C）。

圖1 人GMSCs的分離培養(yǎng) 倒置相差顯微鏡Fig 1 Isolation and characterization of human GMSCs inverted phase contrast microscope

2.2 人GMSCs的CFU-F分析

GMSCs在體外呈集落樣增殖，形成克隆細(xì)胞簇（圖2），經(jīng)計(jì)算，GMSCs的CFU-F為21.4%±2.8%。

2.3 人GMSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)

通過流式細(xì)胞儀檢測，人GMSCs表面標(biāo)志物表達(dá)見圖3：GMSCs陽性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44、CD73、CD90、CD105和 CD166（陽性率分別為99.40%、99.86%、99.95%、99.39%、99.89%），而造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD14、CD34和CD45表達(dá)為陰性（陽性率分別為0.57%、0.79%、0.80%）。

圖2 人GMSCs形成的單克隆集落 甲苯胺藍(lán)染色Fig 2 Human GMSCs cell clusters derived from a single colony toluidine blue

2.4 人GMSCs向成骨細(xì)胞及成脂細(xì)胞分化

經(jīng)成骨誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)4周后，茜素紅鈣鹽染色顯示紅色的礦化結(jié)節(jié)形成（圖4左），呈散在分布，周邊界限不清，周圍可見GMSCs，生長中心處礦化結(jié)節(jié)較多。經(jīng)成脂誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)4周后，油紅O染色顯示細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)密集紅染的脂肪小滴（圖4右），GMSCs向脂肪細(xì)胞分化。

2.5 SDF-1受體CXCR4在人GMSCs上的表達(dá)

免疫熒光檢測的結(jié)果如圖5所示：人GMSCs上趨化因子SDF-1受體CXCR4呈陽性表達(dá)，細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)發(fā)出紅色熒光，細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色后發(fā)出藍(lán)色熒光。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測人GMSCs表面標(biāo)志物表達(dá)Fig 3 The result of flowcytometry analysis of human GMSCs

圖4 人GMSCs向成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞分化情況× 40Fig 4 Osteogenic and adipogenic differentiation potentials of human GMSCs× 40

圖5 人GMSCs表達(dá)CXCR4，CXCR4發(fā)出紅色熒光，細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)色熒光 免疫熒光染色× 400Fig 5 Expression of CXCR4 on human GMSCs,CXCR4 red fluorescent signals and nuclei blue signals immunohistochemical staining× 400

2.6 SDF-1對(duì)人GMSCs的趨化效應(yīng)

在不同質(zhì)量濃度的SDF-1作用下，人GMSCs對(duì)SDF-1顯示不同的趨化反應(yīng)。SDF-1為100、200 ng·mL-1時(shí)，GMSCs遷移至膜下表面的每高倍視野細(xì)胞數(shù)目分別是189.3±4.4和164.6±4.9，細(xì)胞數(shù)目明顯多于空白對(duì)照組的47.8±2.5，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。經(jīng)50 μg·mL-1CXCR4中和抗體處理后，與空白對(duì)照組相比，遷移的細(xì)胞數(shù)目明顯減少，每高倍視野細(xì)胞數(shù)從47.8±2.5減少到29.0±2.4，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這提示SDF-1的促遷移效應(yīng)是由CXCR4介導(dǎo)的。在消除細(xì)胞培養(yǎng)室上下腔中SDF-1濃度梯度后，遷移至膜下表面的每高倍視野細(xì)胞數(shù)目為51.3±3.0，明顯少于下腔中含100 ng·mL-1SDF-1實(shí)驗(yàn)組的189.3±4.4（P<0.01），說明GMSCs細(xì)胞的遷移是由SDF-1引起的趨化效應(yīng)而不是GMSCs的化學(xué)運(yùn)動(dòng)。

3 討論

牙周缺損組織的再生是牙周病治療的難點(diǎn)，近年來，以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的再生性治療措施使牙周缺損修復(fù)取得了一定的進(jìn)展。干細(xì)胞移植[9]及各種生長因子的應(yīng)用[10]等方式可以通過增加牙周病損區(qū)域間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量并促進(jìn)其增殖分化以修復(fù)牙周缺損；但是干細(xì)胞介導(dǎo)的治療需要從患者健康組織處取材，進(jìn)行大量的體外操作，而在體外培養(yǎng)中，間充質(zhì)干細(xì)胞會(huì)喪失其原有表型，增殖、分化、遷移、歸巢等很多干細(xì)胞的特性逐漸喪失[11-12]，移植細(xì)胞的成瘤性、免疫排斥還無法解決，而且還存在倫理道德等方面的不利因素，因此，從牙周病損周圍組織及血管中募集更多的再生性細(xì)胞可能是牙周組織再生研究的一個(gè)更重要方向。

GMSCs一直以來被看作是牙周組織再生的不利因素，然而近年來的研究證實(shí)，從牙齦組織中分離的GMSCs具有自我更新能力并有多向分化潛能，比骨髓基質(zhì)細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力且表型穩(wěn)定，經(jīng)長期的體外培養(yǎng)仍能保持正常的細(xì)胞核型和端粒酶活性[13]，這可能是造成牙齦組織愈合能力強(qiáng)且能夠無瘢痕愈合的原因之一。研究[14]表明，GMSCs在體內(nèi)具有成骨能力，可以有效修復(fù)裸鼠下頜及顱骨缺損，提示GMSCs在牙周病的治療中具有廣闊的研究前景和開發(fā)空間。還有研究[3]發(fā)現(xiàn)，雖然牙周病變組織存在長期的慢性炎癥，但從病變牙齦組織中分離培養(yǎng)的GMSCs的自我更新及多向分化能力與健康牙齦組織無明顯差異。由此推測，將GMSCs應(yīng)用于牙周組織再生具有可行性，并具有良好的臨床推廣價(jià)值，因此將GMSCs從牙周缺損周圍募集到缺損區(qū)可能促進(jìn)炎癥組織早期愈合修復(fù)及再生。

本研究成功分離出人GMSCs，有較高的自我更新能力，并高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44、CD73、CD90、CD105和CD166，而造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD14、 CD34和CD45表達(dá)陰性。體外克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，GMSCs有較高的克隆形成能力。在體外誘導(dǎo)環(huán)境下，GMSCs具有向成骨細(xì)胞及成脂細(xì)胞分化的能力。

本實(shí)驗(yàn)將趨化因子SDF-1引入GMSCs中。SDF-1和CXCR4是研究最多的一對(duì)趨化因子配體和受體，SDF-1能夠促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和其他前體細(xì)胞活化、生長和遷移。本研究檢測了趨化因子SDF-1受體CXCR4在人GMSCs上的表達(dá)，并研究了SDF-1對(duì)GMSCs遷移能力的影響，結(jié)果顯示，SDF-1對(duì)體外培養(yǎng)的人GMSCs具有趨化效應(yīng)。趨化因子SDF-1受體CXCR4的表達(dá)得到證實(shí)，并且CXCR4的中和抗體能顯著降低SDF-1引起的遷移效應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)CXCR4為SDF-1的特異性受體，并提示這種趨化效應(yīng)可能是通過其特異性受體CXCR4介導(dǎo)的。在本研究中，100 ng·mL-1的SDF-1促遷移效應(yīng)要優(yōu)于200 ng·mL-1，而對(duì)于牙周膜干細(xì)胞，SDF-1在200 ng·mL-1時(shí)促細(xì)胞遷移作用更佳[7]，原因可能與不同細(xì)胞表面SDF-1受體CXCR4的數(shù)目及表達(dá)水平存在差異有關(guān)。SDF-1/CXCR4信號(hào)通路在局部炎癥及牙周組織修復(fù)過程中扮演著雙重角色[15]。與健康對(duì)照組比較，牙周炎局部病損部位SDF-1與CXCR4表達(dá)水平升高，SDF-1募集GMSCs到病損區(qū)域的同時(shí)可能也募集了宿主防御細(xì)胞，在參與創(chuàng)傷愈合及組織修復(fù)的過程中也可能參與了宿主防御細(xì)胞的免疫監(jiān)視。此外，前期實(shí)驗(yàn)[7]結(jié)果表明，SDF-1通過其特異性受體CXCR4對(duì)人牙周膜干細(xì)胞有劑量依賴性的趨化效應(yīng)，并且SDF-1能夠提高人牙周膜干細(xì)胞的細(xì)胞活性，促進(jìn)其增殖并促進(jìn)膠原形成。所有這些研究結(jié)果表明，有希望通過原位組織工程的方法，利用SDF-1募集牙周膜干細(xì)胞及GMSCs到達(dá)病損區(qū)域，通過促進(jìn)這些細(xì)胞的活性、增殖及分化以修復(fù)牙周缺損；這些設(shè)想尚需進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)去證實(shí)。

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