孫嵩 高強(qiáng)國 張綱 譚穎徽

第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院口腔頜面外科，重慶 400037

頜骨的骨創(chuàng)傷愈合是一個連續(xù)的生理過程，包括血腫中細(xì)胞遷移，血管生成以及骨痂的改建等[1]，同時也包括在骨細(xì)胞增殖和分化過程中細(xì)胞因子的調(diào)控，骨誘導(dǎo)，分子信號傳導(dǎo)作用等，是一個多因素參與的修復(fù)過程。本課題組在前期研究[2]中發(fā)現(xiàn)，降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）在下頜骨缺損的愈合過程中起著重要的作用，如CGRP能通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞中骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）和核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）mRNA的表達(dá)從而間接影響骨代謝等。CGRP可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達(dá)從而調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖分化[3]。本課題組同樣發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)系統(tǒng)也可以調(diào)節(jié)骨創(chuàng)傷的愈合過程，如下齒槽神經(jīng)損傷能影響骨痂生成和礦化成骨量[4]。神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）是最早發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子（neurotrophic factors，NTFs）家族成員，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和修復(fù)進(jìn)程中起到重要的作用，同時在骨折修復(fù)中也扮演著重要角色。NGF存在于骨形成細(xì)胞中，通過上調(diào)成骨細(xì)胞活性，引導(dǎo)神經(jīng)長入骨痂來促進(jìn)骨的愈合[5]。在神經(jīng)系統(tǒng)與骨代謝的關(guān)系中，NGF能否影響CGRP等信號肽的釋放以及影響途徑還少有研究。本研究通過NGF刺激MG-63細(xì)胞檢測CGRP的表達(dá)狀況，探討NGF對骨修復(fù)過程中神經(jīng)遞質(zhì)CGRP的影響以及對MG-63增殖的作用，旨在加深對骨創(chuàng)傷愈合機(jī)制的認(rèn)識，為治療頜骨骨創(chuàng)傷愈合提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

人骨肉瘤細(xì)胞MG-63細(xì)胞株（ATCC公司，美國）；NGF、NGF酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑（Peprotech公司，美國）；高糖DMEM培養(yǎng)基、優(yōu)質(zhì)小牛血清（Hyclone公司，美國），瓊脂糖（上海生物科技有限公司），Trizol RNA 提取液（寶生物工程大連有限公司）；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-QPCR）試劑盒（Thermo公司，美國）。

本實驗采用第2代MG-63細(xì)胞，接種細(xì)胞密度為每孔2×105個，NGF質(zhì)量濃度梯度為0、10、30、100 ng·mL-1，收集樣本時間分別為1、2、3、4 d。

1.2 ELISA法測定CGRP的表達(dá)

將MG-63細(xì)胞以每毫升2×105個細(xì)胞的密度接種于24孔板，每孔1 mL，每組設(shè)復(fù)孔2個，收集上清液時間分別為1、2、3、4 d，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明操作，每組實驗重復(fù)3次，于酶標(biāo)儀上測定A450值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析并計算CGRP質(zhì)量濃度。

1.3 RT-QPCR法測定CGRP mRNA的表達(dá)

用Trizol提取法提取MG-63細(xì)胞總RNA，經(jīng)微量分光光度計和10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳確定A260/A280值為1.8～2.0，取1 g樣本按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟合成cDNA。RT-QPCR條件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。將cDNA對倍稀釋3次后作為模板，在熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀上測定樣本的表達(dá)結(jié)果，所用引物由上海英俊公司合成。CGRP上游引物：5’-ATGCAGCACCATTCAGGTCTG-3’，CGRP下游引物：5’-CCAGCCGATGAGTCACACAG-3’?？偡磻?yīng)體系為25 μL：SYBR Premix EX Taq（TaKaRa公司，日本）12.5 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束儀器自動生成循環(huán)閾（cycle threshold，Ct）值，用各組mRNA與內(nèi)參基因的Ct值的差值（ΔCt）表示各組mRNA的相對表達(dá)量。

1.4 加入NGF受體阻斷劑后MG-63細(xì)胞中CGRP mRNA的表達(dá)

將1 mL細(xì)胞液接種于16孔板中，細(xì)胞密度為每孔2×105個，加10 μL不同質(zhì)量濃度NGF（0、10、30、100 ng·mL-1）作用1、2、3、4 d 后，加50 ng·mL-1NGF受體阻斷劑PD98059 200 μL培養(yǎng)24 h，用RTQPCR檢測MG-63細(xì)胞分泌CGRP mRNA的情況。

1.5 細(xì)胞計數(shù)（cell counting kit-8，CCK-8）法測定MG-63細(xì)胞增殖情況

NGF對MG-63細(xì)胞增殖的作用：將1 mL細(xì)胞液接種于16孔板中，細(xì)胞密度每孔2×105個，加入10 μL不同質(zhì)量濃度NGF（0、10、30、100 ng·mL-1）培養(yǎng)1、2、3、4 d后棄上清液，每孔加入CCK-8溶液10 μL和90 μL PBS，振蕩混勻后繼續(xù)孵育2 h，測定450 nm波長下的吸光度值，每組實驗重復(fù)3次，以單獨MG-63細(xì)胞為空白對照。

NGF受體阻斷劑的作用：阻斷劑干擾組加入50 ng·mL-1的NGF受體阻斷劑200 μL培養(yǎng)24 h后棄上清液，每孔加入CCK-8溶液10 μL和90 μL PBS，振蕩混勻后繼續(xù)孵育2 h，測定450 nm波長下的吸光度值，每組實驗重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件采用t檢驗和單因素方差分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，檢驗水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 NGF刺激MG-63細(xì)胞中CGRP的表達(dá)

ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，MG-63細(xì)胞自身可產(chǎn)生少量的CGRP，NGF可以明顯上調(diào)MG-63細(xì)胞CGRP的分泌（P<0.05），而且隨NGF質(zhì)量濃度的升高，CGRP的濃度也相應(yīng)升高（圖1）。此外，MG-63細(xì)胞上清液中CGRP的濃度隨不同質(zhì)量濃度的NGF作用時間延長也相應(yīng)增加（圖1）。

圖1 MG-63細(xì)胞中CGRP的表達(dá)Fig 1 The expression of CGRP in MG-63

2.2 NGF刺激MG-63細(xì)胞中CGRP mRNA的表達(dá)

RT-QPCR檢測發(fā)現(xiàn)，NGF可以明顯上調(diào)MG-63細(xì)胞CGRP mRNA的表達(dá)（P<0.05），而且隨NGF質(zhì)量濃度的升高，此作用也相應(yīng)增強(qiáng)（圖2）。此外，MG-63細(xì)胞總RNA中CGRP mRNA的表達(dá)量隨不同質(zhì)量濃度NGF作用時間的延長也相應(yīng)增加（P<0.05）（圖2），與ELISA檢測結(jié)果一致。

圖2 MG-63細(xì)胞中CGRP mRNA的表達(dá)Fig 2 The expression of CGRP mRNA in MG-63

2.3 加入NGF受體阻斷劑后MG-63細(xì)胞CGRP mRNA的表達(dá)

RT-QPCR檢測發(fā)現(xiàn)，加入NGF阻斷劑可以明顯降低MG-63細(xì)胞分泌的CGRP mRNA（P<0.05），隨NGF質(zhì)量濃度升高，此作用也相應(yīng)增強(qiáng)；第3天NGF阻斷劑的干擾作用最強(qiáng)（圖3）。

2.4 MG-63細(xì)胞增殖情況

CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)，加入NGF阻斷劑后MG-63的細(xì)胞增殖效率明顯低于其余組（P<0.05），而加入NGF刺激后MG-63細(xì)胞增殖效率明顯高于空白對照組（P<0.05），隨NGF質(zhì)量濃度升高，此作用也相應(yīng)增強(qiáng)（圖4）。實驗組NG-63細(xì)胞增殖效率隨NGF作用時間延長也相應(yīng)增加（P<0.05）（圖4）。

圖3 加入NGF阻斷劑后MG-63細(xì)胞中CGRP mRNA的表達(dá)Fig 3 The expression of CGRP mRNA in MG-63 after added NGF receptor blocker

圖4 MG-63細(xì)胞的增殖效率Fig 4 The proliferation index of MG-63

3 討論

CGRP是感覺神經(jīng)信號分子的重要一員，因在骨創(chuàng)傷愈合調(diào)控中具有重要作用而受到廣泛關(guān)注。CGRP、P物質(zhì)、血管活性腸肽等一些神經(jīng)肽類物質(zhì)都有促進(jìn)骨折修復(fù)重建的作用，而CGRP是在骨組織中分布最廣泛的一種感覺神經(jīng)源性神經(jīng)肽類物質(zhì)，存在于口腔頜面部軟硬組織，在頜骨及其骨膜中均發(fā)現(xiàn)有大量CGRP陽性神經(jīng)纖維分布[6]，在頜骨骨創(chuàng)傷修復(fù)重建過程中發(fā)揮著重要作用。

CGRP對成骨細(xì)胞具有重要的促增殖效應(yīng)。研究[7]發(fā)現(xiàn)，CGRP可通過增強(qiáng)OPG mRNA的表達(dá)促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞的增殖。Imai等[8]用基因重組培育出能分泌CGRP的轉(zhuǎn)基因大鼠，通過形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)其成骨細(xì)胞活性大為增強(qiáng)，說明成骨細(xì)胞可以通過自分泌CGRP的方式促進(jìn)自身和周圍細(xì)胞的增殖。但是，也有學(xué)者[9-10]通過檢測成骨細(xì)胞DNA的合成發(fā)現(xiàn)，CGRP對MG-63細(xì)胞的增殖有抑制作用。目前這一領(lǐng)域的主體認(rèn)識是CGRP能夠通過上調(diào)成骨樣蛋白如堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Ⅰ型膠原蛋白（collegenⅠ）等成骨活性標(biāo)志物的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟；但是同樣有學(xué)者報道CGRP對成骨細(xì)胞分化具有抑制作用。由此可見，該領(lǐng)域?qū)GRP和成骨細(xì)胞增殖和分化的作用機(jī)制的認(rèn)識尚未完善，觀點存在矛盾。

NGF主要通過激活絲裂素活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信號途徑而發(fā)揮其生物效應(yīng)[11]，對神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育有重要的作用。NGF在骨折愈合過程中也起到一定作用，在骨折愈合進(jìn)程中可以檢測到NGF表達(dá)增加[12]。NGF在骨創(chuàng)傷愈合過程中不僅能促進(jìn)下齒槽神經(jīng)的再生，還能促進(jìn)骨缺損愈合過程中的骨整合[13]。此外大量的體內(nèi)和體外研究[14-15]也報道骨形成細(xì)胞中有NGF mRNA的表達(dá)。這表明骨創(chuàng)傷愈合過程中，NGF可以通過自分泌和旁分泌的形式參與。

在成骨細(xì)胞生物學(xué)研究中，采用與成骨細(xì)胞生物學(xué)行為高度類似的MG-63細(xì)胞株來代替成骨細(xì)胞進(jìn)行研究已是常規(guī)方法。本研究通過預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)5 d后細(xì)胞株的活性下降明顯，因而采用1～4 d進(jìn)行研究。在MG-63細(xì)胞株培養(yǎng)皿中加入NGF共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)CGRP的表達(dá)量明顯增高，并且隨培養(yǎng)時間延長表達(dá)量也相應(yīng)增加。RT-QPCR檢測發(fā)現(xiàn)，在相同觀測點的CGRP mRNA表達(dá)增加，與ELISA法檢測結(jié)果一致，從基因?qū)用骝炞C了NGF對CGRP表達(dá)的上調(diào)作用。CCK-8法檢測到MG-63細(xì)胞的增殖效率也明顯增高。在MG-63細(xì)胞中加入NGF阻斷劑PD98059，CGRP表達(dá)量明顯減少，3 d時表達(dá)量最低，MG-63細(xì)胞的增殖效率也顯著降低。

綜上所述，NGF參與和影響骨創(chuàng)傷修復(fù)重建的方式可能是通過上調(diào)CGRP表達(dá)量從而間接調(diào)節(jié)骨創(chuàng)傷修復(fù)過程；然而NGF上調(diào)CGRP表達(dá)量的機(jī)制和途徑尚需進(jìn)一步研究。

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