郭曉東，張 巍，郭 靜,蘇清明，楊貴榮，張 杰，孫 鯤,王立祥

尿激酶對家兔心肺復(fù)蘇后腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

郭曉東1，張 巍2，郭 靜3,蘇清明4，楊貴榮1，張 杰1，孫 鯤5,王立祥5

目的 探討心搏驟停心肺復(fù)蘇后溶栓藥物尿激酶對腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。方法 20只家兔按隨機數(shù)字表法被分為溶栓組和常規(guī)復(fù)蘇組，每組10只。采用氯化鉀注射法結(jié)合窒息法致心搏驟停后，常規(guī)復(fù)蘇組只進(jìn)行心肺復(fù)蘇及基本生命支持，溶栓組在此基礎(chǔ)上給予尿激酶2萬U/kg進(jìn)行干預(yù)。通過細(xì)胞凋亡原位檢測(Tunel)，免疫組織化學(xué)法檢測半胱天冬蛋白酶-3(caspase-3)以此來證明尿激酶對腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果 溶栓組復(fù)蘇24 h后大腦皮質(zhì)和海馬Tunel和 Casepase-3陽性細(xì)胞均明顯低于常規(guī)復(fù)蘇組，Tunnel：皮質(zhì)29.22±7.86比37.20±7.04(t=-2.392，P=0.028)，海馬18.80±7.58比27.4±8.15(t=-2.442，P=0.025)，Caspase-3：皮質(zhì)22.1±9.93比33.1±12.64(t=-2.165，P=0.044)，海馬31.3±15.23比46.8±16.73(t=-2.167，P=0.044)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。常規(guī)復(fù)蘇組與溶栓組自主循環(huán)恢復(fù)時間(s)、自主呼吸恢復(fù)時間(min)、平均動脈壓(mmHg，)均無明顯差異[自主循環(huán)恢復(fù)時間：307.9±96.4比242.0±71.0(t=-1.741，P=0.099)，自主呼吸恢復(fù)時間：20.6±12.5比19.3±10.0(t=-0.256，P=0.801)，平均動脈壓：65.5±6.2比69.0±6.7(t=1.217，P=0.239)]。結(jié)論 心臟驟停后在心肺復(fù)蘇時給予溶栓藥物尿激酶可以改善并減輕因細(xì)胞凋亡所致腦神經(jīng)損害。

心肺復(fù)蘇；尿激酶；溶栓；神經(jīng)細(xì)胞凋亡

心肺復(fù)蘇技術(shù)已經(jīng)歷了半個多世紀(jì)的理論和實踐的探討，挽救了許多心臟驟停者的生命，但經(jīng)心肺復(fù)蘇后的患者總體存活率仍然很低，僅為5%左右[1]，而且腦復(fù)蘇的成功率更低。心肺復(fù)蘇后腦功能的恢復(fù)代表著復(fù)蘇的最終成功，然而僅有少部分能達(dá)到神經(jīng)功能一定程度的恢復(fù)。據(jù)資料顯示 ,在洛杉磯院外2000例心臟驟停者中,心肺復(fù)蘇成功后神經(jīng)系統(tǒng)完好者僅1.4 %[2]。影響腦復(fù)蘇的原因很多，其中心搏驟停及心肺復(fù)蘇后機體存在凝血和纖溶系統(tǒng)功能紊亂、腦血管內(nèi)微血栓形成，導(dǎo)致腦灌注減少或無灌注是重要原因之一[3-7]。而腦灌注減少或無灌注必然導(dǎo)致較長時間的腦缺血，進(jìn)而造成腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷[8]。因缺血導(dǎo)致的腦神經(jīng)損傷包括壞死和凋亡。有研究提示，凋亡可能是心跳驟停導(dǎo)致全腦缺血后海馬區(qū)神經(jīng)元死亡的主要方式[9]，在心肺復(fù)蘇的相關(guān)研究中，溶栓藥物治療，能改善腦微循環(huán)的灌注，減少腦無灌注區(qū)的面積，有助于改善神經(jīng)系統(tǒng)的預(yù)后，可提高腦復(fù)蘇的成功率[10-14]。應(yīng)用溶栓藥物在改善腦灌注的同時，是否對神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程產(chǎn)生影響值得研究。本研究旨在探討心搏驟停后心肺復(fù)蘇基本生命支持階段給予溶栓藥物并通過細(xì)胞凋亡原位檢測(Tunel)，免疫組織化學(xué)法檢測半胱天冬蛋白酶-3(caspase-3)，觀察細(xì)胞凋亡情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及模型制備 健康新西蘭純種大白兔20只，兔齡5～6個月，體重2～3 kg，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供〔SCXK(軍2012-0004)〕，隨機分為常規(guī)復(fù)蘇組(n=10)和溶栓組(n=10)。實驗兔在術(shù)前晚上禁食。術(shù)前30 min 給予阿托品0.01 mg/kg肌內(nèi)注射，稱重后給予氯胺酮+速眠新(合劑配比為1 ml∶1 ml) 0.2～0.3 ml/kg肌內(nèi)注射，麻醉后四肢連接心電導(dǎo)聯(lián)電極監(jiān)測心電圖，分離股動脈置入小兒心導(dǎo)管，與邁瑞9000多道生理記錄儀傳感器相連監(jiān)測動脈血壓、平均動脈壓。分離股靜脈置入BD22G套管針，用于靜脈給藥。氣管切開置入氣管插管以備呼吸機應(yīng)用。參照文獻(xiàn)[15，16]采用氯化鉀注射法結(jié)合窒息法致心搏驟停動物模型，經(jīng)股靜脈彈丸式注射4 ℃的10%氯化鉀(7 mg/100 g)，待心搏驟停后，于呼氣末夾閉氣管導(dǎo)管。心搏驟停標(biāo)準(zhǔn)為動脈壓波形消失且平均動脈壓<20 mmHg，心電圖示竇性心律消失，出現(xiàn)室顫波或一直線，聽診心音消失，持續(xù)3 min后開始復(fù)蘇。復(fù)蘇方法：松開夾閉的氣管導(dǎo)管，連接小動物呼吸機，給予機械通氣，呼吸頻率40次/min，潮氣量20 ml/kg。胸外按壓150～180次/min，各組均于復(fù)蘇開始靜脈注射腎上腺素0.02 mg/kg。每5 min給藥1次，重復(fù)3次，復(fù)蘇30 min后自主循環(huán)未恢復(fù)者結(jié)束觀察，表明復(fù)蘇失敗。溶栓組在開始復(fù)蘇時給予尿激酶2萬U/kg+NS30 ml于30 min內(nèi)靜脈滴完[17]， 常規(guī)復(fù)蘇組在開始復(fù)蘇時給予生理鹽水30 ml于30 min內(nèi)靜脈滴完。自主循環(huán)恢復(fù)后，繼續(xù)給予機械通氣，直到恢復(fù)自主呼吸后停止機械通氣。復(fù)蘇后24 h，再次以氯胺酮+速眠新麻醉，開胸在右心耳處剪一小孔，經(jīng)左心室穿刺灌注0.9%生理鹽水至血液變清，然后灌注4%多聚甲醛，斷頭后剝離出腦組織，放入4%多聚甲醛液中常溫固定，腦組織標(biāo)本用石蠟包埋并切片。

1.2 觀測指標(biāo)

1.2.1 自主循環(huán)恢復(fù)時間 判斷標(biāo)準(zhǔn)為在無胸外按壓時，收縮壓在60 mmHg以上維持10 min，表示自主循環(huán)恢復(fù)[18 ]。

1.2.2 自主呼吸恢復(fù)時間 以出現(xiàn)腹式呼吸，撤掉呼吸機后持續(xù)5 min為自主呼吸恢復(fù)的標(biāo)志。

1.3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測及結(jié)果判斷

1.3.1 Casepase-3 (1)試劑：Casepase-3免疫組化試劑盒由邁新公司提供。輔助試劑有磷酸鹽緩沖液(PBS)；枸椽酸鹽緩沖液(CB)等。(2)操作規(guī)程：組織切片常規(guī)脫蠟，水化，PBS緩沖液洗滌切片，采用加熱法修復(fù)抗原后，待修復(fù)液自然冷卻至室溫；1×PBS緩沖液洗滌切片；在組織切片上3%H2O2滴加(以PBS緩沖液或甲醇配置)； PBS洗2～3次各5 min；滴加正常山羊血清封閉液；滴加第一抗體50 μl，置于濕盒內(nèi)，4 ℃過夜；1×PBS洗3次各5 min；滴加復(fù)合二抗(HRP-Polymer anti ms/rb IgG)，室溫靜置20 min；1×PBS洗3次各5 min；DAB顯色，蘇木精復(fù)染，1%鹽酸乙醇分化，脫水,透明：中性樹膠封片，鏡檢(具體過程詳見試劑盒說明)。(3)觀測方法：胞漿有棕黃色顆粒狀染色者為陽性細(xì)胞。應(yīng)用Olym pus BX-51光學(xué)顯微鏡，400倍鏡下隨機選取10個不重復(fù)的視野，由圖像分析系統(tǒng)計數(shù)陽性細(xì)胞，取均值作為該張切片陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3.2 Tunnel染色 (1)試劑：PBS(磷酸鹽緩沖液pH7.2～7.4)；C1017 Hoechst 33258染色液。(2)操作規(guī)程：抗原/切片的準(zhǔn)備：切片厚度3 μm，60～65 ℃烤片2 h；切片脫蠟，水化，依次為二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ→無水乙醇Ⅰ→無水乙醇Ⅱ→95%乙醇→90%乙醇→85%乙醇→75%乙醇各10 min；PBS浸泡10 min；直接加Hoechst 33258染色液，染色5 min，封片，熒光顯微鏡下觀察采圖。(3)觀測方法(400倍)：以HOST23358染色觀察凋亡情況，有凋亡的細(xì)胞核出現(xiàn)濃縮或碎裂表現(xiàn)。

2 結(jié) 果

2.1 鏡下觀察 復(fù)蘇24 h后熒光顯微鏡觀察兩組大腦皮質(zhì)和海馬Tunel細(xì)胞核出現(xiàn)濃縮或碎裂表現(xiàn)，常規(guī)復(fù)蘇組可見皮質(zhì)區(qū)與海馬區(qū)有少數(shù)神經(jīng)元發(fā)生凋亡，溶栓組凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯減少；光學(xué)顯微鏡觀察 Casepase-3陽性細(xì)胞呈現(xiàn)棕褐色，棕色團塊主要分布在細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)細(xì)胞核中也可見表達(dá)，常規(guī)復(fù)蘇組可見皮質(zhì)區(qū)與海馬區(qū)有少數(shù)神經(jīng)元胞漿內(nèi)有棕色陽性物質(zhì)，溶栓組陽性細(xì)胞數(shù)目明顯減少(圖1，2)。大腦皮質(zhì)和海馬Tunel和 Casepase-3陽性細(xì)胞計數(shù)，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

圖1 家兔溶栓組和常規(guī)復(fù)蘇組Tunel陽性細(xì)胞的表達(dá)(Tunnel染色，×400)

圖2 家兔溶栓組和常規(guī)復(fù)蘇組Casepase-3陽性細(xì)胞(Casepase-3染色，×400)

注：與常規(guī)復(fù)蘇組比較，①P<0.05。

2.2 其他觀察指標(biāo) 自主循環(huán)恢復(fù)時間、自主呼吸恢復(fù)時間及平均動脈壓，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

表2 家兔溶栓組和常規(guī)復(fù)蘇組觀察指標(biāo)比較 (n=10；±s)

3 討 論

心臟驟停和心肺復(fù)蘇后，由于血液淤滯、缺氧、酸中毒及血管內(nèi)皮損傷等因素激活了凝血系統(tǒng)，機體出現(xiàn)凝血和纖溶系統(tǒng)功能紊亂，使腦血管內(nèi)大量微血栓形成，造成腦微循環(huán)灌注不良[19-23 ]。自主循環(huán)恢復(fù)后，腦灌注不足仍繼續(xù)，即存在無復(fù)流現(xiàn)象，而繼續(xù)加重腦損傷[24]。早期腦微循環(huán)灌注不足是引起復(fù)蘇后腦功能損傷的重要原因之一。完全性腦缺血后, 神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞死亡可以通過多種機制發(fā)生，主要分為凋亡和壞死兩種截然不同的方式，腦組織長時間缺血后，數(shù)分鐘或數(shù)小時內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的快速死亡，即壞死；而缺血中心區(qū)周圍的半暗區(qū)表現(xiàn)為選擇性神經(jīng)元缺失，持續(xù)時間較長,稱遲發(fā)性死亡，即凋亡。但另有研究報告，缺血中心區(qū)的死亡神經(jīng)元極少完全表現(xiàn)為壞死特征，而細(xì)胞凋亡的特征在絕大多數(shù)神經(jīng)元中都存在[25 ]。因此，有學(xué)者提出缺血早期，部分缺血中心區(qū)細(xì)胞可能首先發(fā)生細(xì)胞凋亡。腦缺血是常見的凋亡刺激因素，可以導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)凋亡與抗凋亡反應(yīng)機制同時激活：當(dāng)刺激較小時，以抗凋亡為主；而當(dāng)刺激較大時，則以凋亡為主。細(xì)胞缺血缺氧后的凋亡通路主要是依賴半胱天冬蛋白酶 (cysteine - asparateprotease, caspase)的線粒體途徑和激活死亡受體途徑，在神經(jīng)元細(xì)胞凋亡過程中起重要作用的Caspase家族成員是Caspase-3[26 ]。有研究提示，肝素及溶栓藥物能夠在一定程度上延緩早期心肺復(fù)蘇階段組織微循環(huán)血流灌注的惡化[27 ]，本實驗在活體家兔心臟驟停和心肺復(fù)蘇過程中單獨給予尿激酶(排除肝素對組織微循環(huán)血流灌注的影響)治療，并通過細(xì)胞凋亡原位檢測(TUNEL)，免疫組織化學(xué)法檢測Caspase-3，觀察溶栓藥物對腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。

在本研究中，溶栓組與常規(guī)復(fù)蘇組在自主循環(huán)恢復(fù)時間、自主呼吸恢復(fù)時間，以及平均動脈壓方面，沒有明顯的差異，說明心肺復(fù)蘇后兩組存在相同的微循環(huán)障礙。但是，溶栓組在自主循環(huán)恢復(fù)時間較常規(guī)復(fù)蘇組縮短，考慮尿激酶溶解微血栓,使微循環(huán)保持相對通暢有關(guān)[28]，溶栓組自主循環(huán)恢復(fù)時間較早，對腦血流及微循環(huán)的恢復(fù)亦產(chǎn)生有利影響。再灌注24 h后常規(guī)復(fù)蘇組Tunel陽性神經(jīng)細(xì)胞及caspase-3蛋白陽性表達(dá)明顯高于溶栓(尿激酶)溶栓組，兩組存在明顯差異。說明在心臟驟停和心肺復(fù)蘇過程中給予溶栓(尿激酶)治療可以減少細(xì)胞凋亡，減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷。分析原因如下：溶栓藥物可以有效作用于心搏驟停后大腦微血管栓子，通過溶解微血栓，改善腦微循環(huán)的灌注，減少腦無灌注區(qū)域面積，改善神經(jīng)系統(tǒng)的預(yù)后[30，31]。郭曉東等[28]對大鼠進(jìn)行復(fù)蘇實驗發(fā)現(xiàn)心跳、呼吸驟停5～8 min即可造成腦血管內(nèi)大量微血栓形成及腦神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死，給予尿激酶干預(yù)可以降低腦神經(jīng)細(xì)胞損傷程度，改善預(yù)后。Aliyev等[31]報道，家兔心搏驟停后在心肺復(fù)蘇的BLS階段微循環(huán)血流量下降，有血細(xì)胞聚集現(xiàn)象，給予溶栓、抗凝藥物的干預(yù)可以改善早期心肺復(fù)蘇階段組織的微循環(huán)血流灌注，防止微循環(huán)內(nèi)微血栓形成。

本實驗通過在活體家兔心臟驟停和心肺復(fù)蘇過程中給予尿激酶治療，常規(guī)復(fù)蘇組TUNEL陽性神經(jīng)細(xì)胞及caspase-3蛋白陽性表達(dá)明顯高于溶栓組，兩組存在明顯差異。提示尿激酶溶栓治療可以明顯改善并減輕心臟驟停和心肺復(fù)蘇后因腦缺血、血氧而造成的腦神經(jīng)損害，進(jìn)而提高腦復(fù)蘇的成功率。

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(2015-05-11收稿 2015-09-15修回)

(責(zé)任編輯 岳建華)

Influence of urokinase on nerve cell apoptosis after cardiopulmonary resuscitation in rabbits

GUO Xiaodong1, ZHANG Wei2, GUO Jing3, SU Qingming4, YANG Guirong1，ZHANG Jie1，SUN Kun5，and WANG Lixiang5.

1.The First Department of Critical Care Medicine, 3. Department of Medical Care, 4. Department of Pathology , 5. Department of Emergency，General Hospital of Chinese People's Armed Police Force, Beijing 100039,China；2. Out-patient Department, Department of Information, General Staff Headquarters, Beijing 100840, China

Objective To investigate the effect of urokinase on nerve cell apoptosis after cardiac arrest(CA) and cardiopulmonary resuscitation(CPR)in rabbits. Methods 20 rabbits were randomly divided into experimental group and control group, 10 rabbits in each group. Potassium chloride injection combined with asphyxia method was conducted to establish the CA models. CPR and basic life-support were performed in experimental group. Based on above treatments, intervention with urokinase (20 000 U/kg) was conducted in experimental group. Neural apoptosis was identified by TUNEL and caspase-3 was detected by immunohistochemistry in order to prove the effect of urokinase on nerve cell apoptosis in rabbits 24 hours after CPR. Results Tunel and caspase-3 positive cells counts of cerebral cortex and hippocampus in experimental group were significantly less than those in control group, respectively. The comparisons were as follows(Tunel positive cells in cerebral cortex 29.22±7.86: 37.20±7.04(t=-2.392，P=0.028), in hippocampus 18.80±7.58: 27.4±8.15(t=-2.442，P=0.025), Caspase-3 positive cells in cerebral cortex 22.1±9.93:33.1±12.64(t=-2.165，P=0.044)，in hippocampus 31.3±15.23vs46.8±16.73(t=-2.167，P=0.044); so thrombolytic therapy with urokinase can relieve nerve cell apoptosis obviously. Comparison of spontaneous circulation restoration time(s) 307.9±96.4: 242.0±71.0(t=-1.741,P=0.099), spontaneous breathing restoration time(min) 20.6±12.5:19.3±10.0 (t=-0.256,P=0.801), mean arterial pressure MAP (mmHg) 65.5±6.2: 69.0±6.7 (t=1.217,P=0.239), there were no differences between the experimental group and control group. Conclusions Thrombolytic therapy with urokinase in CPR after CA can improve and lessen nervous lesion resulting from apoptosis in rabbits.

cardiopulmonary resuscitation；cardiac arrest ；urokinase, caspase-3； Tunel；nerve cell apoptosis

全軍醫(yī)學(xué)科技“十二五”課題計劃(BWS11J077)；武警總醫(yī)院一類課題(WZ2008001)

郭曉東，本科學(xué)歷，副主任醫(yī)師，E-mail:guoxiaodong59122@sina.com

100039 北京，武警總醫(yī)院：1.重癥醫(yī)學(xué)一科，3.醫(yī)療科，4.病理科，5.急救醫(yī)學(xué)中心；2. 100840 北京，總參信息化部門診部

郭 靜， E-mail:18610420911@163.com

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