孫亞勤，楊勝利，楊 勇

冠心病介入術(shù)后氯吡格雷低反應(yīng)性與CYP2C19基因多態(tài)性的關(guān)系

孫亞勤1，2，楊勝利2，楊 勇2

目的 探討冠心病(coronary artery disease，CAD)介入術(shù)后氯吡格雷低反應(yīng)發(fā)生與CYP2C19基因多態(tài)性的關(guān)系。方法 選取武警總醫(yī)院心內(nèi)科行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI )患者200例，術(shù)后給予阿司匹林和氯吡格雷雙聯(lián)抗血小板藥，并經(jīng)血栓彈力圖檢測二磷酸腺苷(adenosine diphosphate， ADP)誘導(dǎo)的血小板抑制率，按ADP誘導(dǎo)的血小板抑制率是否小于30%，將患者分為氯吡格雷低反應(yīng)組和氯吡格雷敏感組；同時(shí)采用基因芯片技術(shù)檢測CYP2C19基因多態(tài)性，判斷對(duì)氯吡格雷的反應(yīng)性的影響。結(jié)果 CYP2C19*1/*1與CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*1與CYP2C19*2/*2、快與中間代謝型比較ADP的抑制率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；共79例(39.5%)發(fā)生氯吡格雷低反應(yīng)。氯吡格雷敏感組快代謝型者(基因型*1/*1)多于低反應(yīng)組(P=0.013)，氯吡格雷低反應(yīng)組中慢代謝型較多(P=0.013)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其他代謝型間比較無差異。結(jié)論 冠心病PCI術(shù)后氯吡格雷低反應(yīng)與CYP2C19基因多態(tài)性相關(guān)，攜帶中慢代謝型基因者發(fā)生氯吡格雷低反應(yīng)較多。

CYP2C19基因多態(tài)性；ADP誘導(dǎo)的血小板抑制率；冠心病

阿司匹林和氯吡格雷雙聯(lián)抗血小板藥可治療、預(yù)防冠心病缺血事件發(fā)生，顯著提高急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome, ACS)和經(jīng)皮冠脈介入治療(percutaneous coronary intervention,PCI) 臨床預(yù)后。目前許多研究表明，冠心病PCI術(shù)后的部分患者即使給予常規(guī)劑量雙聯(lián)抗血小板藥治療仍有血栓事件發(fā)生，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室血小板功能檢測發(fā)現(xiàn)存在氯吡格雷低反應(yīng)、無應(yīng)答或抵抗。氯吡格雷屬于前體藥,經(jīng)肝臟細(xì)胞色素酶P450(CYP450)(CYP2C19等編碼)轉(zhuǎn)化為有活性的硫醇代謝物，與血小板表面上ADP受體P2Y12結(jié)合抑制血小板聚集達(dá)到抗血小板作用[1]。CYP2C19在氯吡格雷激活中起著關(guān)鍵作用[2]。大量研究證明，CYP2C19功能缺失型等位基因攜帶者比非攜帶者血漿中抗血小板聚集作用的氯吡格雷活性代謝物顯著降低，與氯吡格雷低反應(yīng)相關(guān)，而且PCI術(shù)后1年內(nèi)臨床終點(diǎn)事件的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。但同時(shí)亦有文獻(xiàn)報(bào)道，CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷低反應(yīng)無關(guān)，存在爭議。

目前，國內(nèi)外尚無明確統(tǒng)一的氯吡格雷低反應(yīng)定義，本研究采用血栓彈力圖檢測二磷酸腺苷(adenosine diphosphate， ADP)誘導(dǎo)的血小板抑制率，參照文獻(xiàn)[3]定義的氯吡格雷低反應(yīng)為ADP誘導(dǎo)的血小板抑制率小于30%。通過基因芯片技術(shù)檢測CYP2C19基因多態(tài)性，旨在探討氯吡格雷低反應(yīng)性與CYP2C19基因多態(tài)性的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選擇2013-10至2014-10就診于武警總醫(yī)院心內(nèi)科診斷為冠心病并行PCI術(shù)患者200例。入選標(biāo)準(zhǔn):(1)漢族；(2)年齡≤80歲；(3)服用氯吡格雷(75 mg/d)≥7 d，ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率出現(xiàn)穩(wěn)定抑制。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)對(duì)阿司匹林或氯吡格雷過敏或不能耐受；(2)3個(gè)月內(nèi)有腦卒中或內(nèi)臟出血性疾?。?3)血小板的數(shù)量<80×109/L或>45×109/L，血紅蛋白<80g/L，或有肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥；(4)嚴(yán)重的肝、腎功能損害及凝血功能障礙；(5)合并腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、感染性疾??；(6)1周內(nèi)或近期擬行外科手術(shù)或具有抗血小板治療禁忌證；(7)心源性休克；(8)有明確活動(dòng)性消化性潰瘍者及上消化道穿孔史者；(9)伴其他終末期疾病，預(yù)期壽命小于1年。

1.2 試劑與儀器 血小板抑制率測定使用5000型血栓彈力圖凝血分析儀(美國Haemoscope 公司)。試劑:高嶺土(含1% Kaolin 液)、激活劑和ADP均為美國Haemoscope公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 血小板抑制率檢測 所有患者于氯吡格雷使用后7 d晨起時(shí)空腹抽取靜脈血5 ml，置于含3.13%枸櫞酸鈉和肝素鉀的采血管內(nèi)，2 h 內(nèi)應(yīng)用TEG 凝血分析儀進(jìn)行檢測。參照文獻(xiàn)氯吡格雷低反應(yīng)的定義，根據(jù)血小板抑制率將患者分為氯吡格雷敏感組(MAADP≥30%)和氯吡格雷低反應(yīng)組(MAADP<30%)[1]。

1.3.2 CYP2C19基因多態(tài)性檢測 (1)樣本收集、DNA 提取及聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增：研究對(duì)象于支架植入后第2天抽取靜脈血1 ml置入乙二胺四乙酸二鈉抗凝管中，按照上海百傲科技有限公司提供的血液基因組DNA提取試劑盒要求提取和純化DNA(DNA 的濃度10～60 ng/μl，A260/A280比值在1.5～2.0)。PCR擴(kuò)增條件為：50 ℃ 5 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 25 s，48 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。(2)雜交顯色利用Baio基因芯片圖像分析軟件進(jìn)行圖像掃描與數(shù)據(jù)分析并輸出檢測結(jié)果。研究表明應(yīng)用美芬妥英或CYP2C19底物作為表型探劑藥物可把人類表達(dá)的CYP2C19分為三種表型，即快或強(qiáng)代謝型(extensive metabolizer，EM，基因型為CYP2C19*1/*1)、中間代謝型(intermediate metabolizer，IM，基因型為CYP2C19*1/*2和CYP2C19*1/*3)和慢(或弱)代謝型(poor metabolizer，PM，基因型為CYP2C19*2/*2、 CYP2C19*2/*3和CYP2C19*3/*3)。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料對(duì)比 200例中，氯吡格雷低反應(yīng)組79例，研究人群中氯吡格雷低反應(yīng)的發(fā)生率為39.5%，其中男性84例(69.4%)；氯吡格雷敏感組121例，其中男性53例(67.1%)。兩組臨床資料中除射血分?jǐn)?shù)、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、血小板抑制率外，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性(表1)。

2.2 CYP2C19各基因型及代謝型間血小板抑制率比較 200例中有90例(45.0%)為純合子快代謝型(CYP2C19*1/*1)。87例(43.5%)為雜合子中間代謝型，其中76例(38.0%)為CYP2C19*1/*2， 11例(5.5%)為CYP2C19*1/*3。23例(11.5%)為慢代謝型，其中18例(9.0%)為CYP2C19*2/*2，5例(2.5%)為CYP2C19*2/*3。經(jīng)單因素方差分析：攜帶CYP2C19*1/*1與CYP2C19*1/*2(46.28±26.67vs38.58±21.99，P<0.05)、CYP2C19*1/*1與CYP2C19*2/*2(46.28±26.67vs33.18±25.01，P<0.05)、快代謝型與中間代謝型相比(46.28±26.67vs38.32±21.47)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 冠心病介入治療術(shù)后兩組患者臨床資料比較 ±s)]

2.3 CYP2C19基因型及代謝型間氯吡格雷反應(yīng)性的比較 氯吡格雷低反應(yīng)組與敏感組比較，氯吡格雷敏感組攜帶基因型*1/*1患者多于低反應(yīng)組(P=0.013)，氯吡格雷低反應(yīng)組中慢代謝型較多(P=0.013),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他基因型及代謝型間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 冠心病介入治療術(shù)后兩組CYP2C19各基因型與氯吡格雷反應(yīng)性的關(guān)系 (n;%)

3 討 論

氯吡格雷是臨床常用的抗血小板藥物,CAPRIE、CURE及COMMIT等一系列臨床研究證明了其抗血小板藥治療的有效性和安全性:氯吡格雷可顯著降低PCI術(shù)后各類血栓事件的發(fā)生率[4-6]。部分患者即使給予常規(guī)劑量雙聯(lián)抗血小板藥治療仍有血栓事件發(fā)生，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室血小板功能檢測發(fā)現(xiàn)存在氯吡格雷低反應(yīng)、無應(yīng)答或抵抗。氯吡格雷抵抗的發(fā)生機(jī)制尚不清楚, 由于缺乏特異性的檢測手段, 且臨床發(fā)生率不低, 對(duì)PCI術(shù)后患者預(yù)后影響大，已經(jīng)引起了臨床的重視[7]。近年來，國內(nèi)外專家對(duì)基因多態(tài)性與氯吡咯雷低反應(yīng)的相關(guān)性存在爭議，對(duì)CYP2C19基因型的檢測意義存在質(zhì)疑[8，9]。氯吡格雷是一種前體藥物需經(jīng)過肝P450系列酶(CYP2B6、CYP3A4、CYP3A5、CYP2C19等編碼)兩步氧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為有活性的代謝產(chǎn)物,而CYP2C19基因編碼的酶蛋白參與上述兩步氧化反應(yīng)，是影響氯批格雷代謝活化的關(guān)鍵酶。研究發(fā)現(xiàn)該基因有兩個(gè)主要的功能缺失型等位基因 CYP2C19*2(681G>A)和 CYP2C19*3(636G>A)，分別是第 5 外顯子的堿基缺失、第 4 外顯子的堿基突變，產(chǎn)生了1個(gè)終止密碼子，導(dǎo)致蛋白合成被提前終止，使得氯吡格雷的活性代謝產(chǎn)物減少，降低了氯吡格雷抗血小板作用[9]。本研究中氯吡格雷低反應(yīng)的發(fā)生率為39.5%，與相關(guān)研究報(bào)道的氯吡格雷抵抗在不同人群的發(fā)生率4%～44%相符[10]。研究發(fā)現(xiàn)等位基因出現(xiàn)的頻率因種族不同而異,功能缺失*2和*3是東方人群中 2 個(gè)主要的有意義的基因突變,突變頻率18%～23%[11]。攜帶該兩個(gè)等位基因中的任何一個(gè)將被認(rèn)為是慢代謝者[12]。

本研究中攜帶CYP2C19*1/*1與CYP2C19*1/*2(46.28±26.67vs38.58±21.99)，CYP2C19*1/*1與 CYP2C19*2/*2(46.28±26.67vs33.18±25.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05?？齑x型與中間代謝型(46.28±26.67vs38.32±21.47)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本研究結(jié)果顯示，CYP2C19*2影響氯吡格雷抗血小板效果，與CLOVIS-2試驗(yàn)[13]、ELEVATE-TIMI56[14]研究一致。CLOVIS-2研究中43例攜帶雜合子CYP2C19*1/*2和8例純合子CYP2C19*2/*2患者代表CYP2C19 * 2的基因突變患者， 選擇58例正?；駽YP2C19*1/*1患者作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)攜帶CYP2C19 * 2患者氯吡格雷的反應(yīng)顯著降低，顯示呈基因-劑量效應(yīng)。ELEVATE-TIMI56研究攜帶 CYP2C19*2雜合子穩(wěn)定型冠心病患者服用3倍氯吡格雷225 mg/d的血小板抑制水平與非攜帶者75 mg/d一致，攜帶CYP2C19*2純合子患者,即使給予300 mg/d的氯吡格雷，血小板抑制率亦無達(dá)標(biāo)，進(jìn)一步證實(shí)CYP2C19*2對(duì)氯吡格雷反應(yīng)性的影響程度。本研究樣本量少，攜帶CYP2C19*1/*3和CYP2C19*2/*3患者較少，兩基因型組受氯吡格雷的影響小，組內(nèi)血小板抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果表明，攜帶中間代謝型患者的血小板抑制率較低，氯吡格雷低反應(yīng)組血小板抑制率較低，中慢代謝型患者較多，均提示攜帶突變基因*2或*3影響體內(nèi)氯吡格雷的活性代謝產(chǎn)物形成，導(dǎo)致抗血小板療效降低，易出現(xiàn)氯吡格雷低反應(yīng)。

綜上所述，冠心病PCI術(shù)后患者氯吡格雷低反應(yīng)與CYP2C19基因多態(tài)性相關(guān)，攜帶中慢代謝型基因者發(fā)生氯吡格雷低反應(yīng)較多?？紤]本研究兩組射血分?jǐn)?shù)、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白間的差異，且樣本量較少，下一步還需進(jìn)行大規(guī)模、前瞻性隨機(jī)臨床試驗(yàn)，繼續(xù)對(duì)氯吡格雷低反應(yīng)與CYPC19基因多態(tài)性做深入研究。

[1] Shanker J, Gasparyan A Y, Kitas GD,etal. Platelet function and antiplatelet therapy in cardiovascular disease: implications of genetic polymorphisms[J]. Curr Vasc Pharmacol,2011,9(4):479-489.

[2] Kazui M, Nishiya Y, Ishizuka T,etal. Identification of the human cytochrome p450 enzymes involved in the two oxidative steps in the bioactivation of clopidogrel to its pharmacologically active metabolite[J]. Drug Metab Dispos,2010,38(1):92-99

[3] Bliden K P, Dichiara J, Tantry U S,etal. Increased risk in patients with high platelet aggregation receiving chronic clopidogrel therapy undergoing percutaneous coronary intervention: is the current antiplatelet therapy adequate [J].J Am Coll Cardiol, 2007,49(6):657-666.

[4] Caprie Steering, Committee. A randomized, blinded, trial of clopidogrel verse aspirin in patients at risk for ischemic events (CAPRIE) [J]. Lancet, 1996,348(9038):1329-1339.

[5] Mehta S R, Yusuf S. The clopidogrel in unstable angina to prevent recurrent events (cure) trial programme; rationale, design and baseline characteristics including a meta-analysis of the effects of pyridines in vascular disease[J]. Eur Heart J, 2000,21(24):2033-2041.

[6] Edwards J, Goodman S G, Yan R T ,etal. has the clopidogrel and metoprolol in myocardial infarction trial (commit) of early beta-blocker use in acute coronary syndromes impacted on clinical practice in canada [J].Am Heart J,2011,161(2):291-297.

[7] 韓雅玲.冠心病抗血小板治療[J]. 武警醫(yī)學(xué), 2006,17(3)：163-166.

[8] Hou X, Shi J, Sun H .Gene polymorphism of cytochrome P450 2C19*2 and clopidogrel resistance reflected by platelet function assays: a meta-analysis[J]. Eur J Clin Pharmacol,2014,70(9):1041-1047.

[9] Zhang X, Yan L, Wang D,etal. Comparison of loading with maintenance dose of clopidogrel on platelet reactivity in Chinese with different CYP2C19 genotypes prior to percutaneous coronary intervention[J].Chin Med J (Engl),2014,123(14):2571-2577.

[10] Vlachojannis G J, Dimitropoulos G, Alexopoulos D. Clopidogrel resistance: current aspects and future directions[J]. Hellenic J Cardiol, 2011, 52(3):236-245.

[11] Frere C, Cuisset T, Morange P E,etal. Effect of cytochrome p45.00 polymorphisms on platelet reactivity after treatment with clopidogrel in acute coronary syndrome[J].Am J Cardiol, 2008,101(8):1088-1093.

[12] Hokimoto S, Mizobe M, Akasaka T,etal. Impact of CYP2C19 polymorphism and proton pump inhibitors on platelet reactivity to clopidogrel and clinical outcomes following stent implantation[J]. Thromb Res,2014,133(4):599-605.

[13] Collet J P, Hulot J S, Anzaha G,etal. High doses of clopidogrel to overcome genetic resistance: the randomized crossover CLOVIS-2 (Clopidogrel and Response Variability Investigation Study2)[J]. JACC Cardiovasc Interv,2011,4(4):392-402.

[14] Mega J L, Hochholzer W, Frelinger A L ,etal. Dosing clopidogrel based on CYP2C19 genotype and the effect on platelet reactivity in patients with stable cardiovascular disease[J]. JAMA,2011,306(20):2221-2228.

(2015-02-10收稿 2015-03-23修回)

(責(zé)任編輯 郭 青)

Correlation between clopidogrel low response and CYP2C19 gene polymorphism in CAD patients after PCI

SUN Yaqin1，2, YANG Shengli2, and YANG Yong2.

1.Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003， China;2.Department of Cardiology,the General Hospital of Chiense People’s Armed Police Forces， 100039 Beijing, China

Objective To study the correlation between clopidogrel low respone and CYP2C19 gene polymorphism in coronary artery disease(CAD)patients after percutaneous coronary intervention(PCI). Methods A total of 200 patients with CAD admitted to this hospital from October 2013 to October 2014 were included in this study, and treated with dual antiplatelet drugs, aspirin and clopidogrel after PCI. The clopidogrel response was judged by depending on the ADP-induced platelet inhibition rate tested by thromboelastogram (TEG). In this study the ADP-induced platelet inhibition rate less than 30% was defined as clopidogrel low respone and the gene chip detection technology was used to detect the genotyes of CYP2C19 to further explore its effect on clopidogrel respone. Results In these 200 patients, the ADP-induced platelet inhibition rate was statistically significantly different between patients carrying CYP2C19*1/*1 and CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*1 and CYP2C19*2/*2、extensive and intermediate metabolizers. The total occurrence of clopidogrel low response was 39.5%(79 patients) . There was significant difference between clopidogrel low respone and CYP2C19 genotyes、 metabolizers， indicating that more carriers with extensive metabolizer (CYP2C19*1/*1) in the clopidogrel response group(P=0.013)， more carriers with intermediate or poor metabolizers in the clopidogrel low response group(P=0.013). Conclusions There is correlation between clopidogrel low respone and CYP2C19 gene polymorphism in patients with CAD after PCI, more carriers with intermediate or poor metabolizers in the clopidogrel low response group.

CYP2C19 gene polymorphism；the ADP-induced platelet inhibition rate； coronary artery disease

孫亞勤，碩士，E-mail:18701239125@163.com

1.453003，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院;2.100039 北京，武警總醫(yī)院心內(nèi)科

楊勝利，E-mail:yangshengli@medmail.com.cn

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