徐 薪，紀小龍，徐明志

組織細胞在炎性腸病鑒別診斷中的意義

徐 薪1，紀小龍1，徐明志2

目的 研究炎性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)腸黏膜內組織細胞種類與分布特點,為其鑒別診斷尋找線索。方法 參照2012年中華醫(yī)學會新制定的診斷標準選取病例，結合臨床病史及內鏡下表現(xiàn)做出診斷,確定潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)組 30例，克羅恩病(Crohn’s disease,CD)組 26例，選取10例正常腸黏膜作為對照組。所有病例均HE染色及加做6項免疫組化染色(CD1a、CD21、CD68、CD163、S-100、Ki-67)。所有切片均掃描進入優(yōu)納ISCAN系統(tǒng)進行半定量分析。結果 UC(80.72±17.15)個/104μm2及CD(78.59±16.37)個/104μm2的固有層內細胞數(shù)與正常對照組(59.57±14.04)個/104μm2相比均具有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.01)。CD1a在正常腸黏膜及UC內幾乎沒有表達[(0.72±0.79)個/104μm2， CD(22.19±10.19)個/104μm2]統(tǒng)計分析比較與正常對照組及UC(1.32±2.26)個/104μm2均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CD21在組織學上的鑒別診斷意義不大。S-100三組的組間比較均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CD68 CD組(16.02±7.33)個/104μm2的陽性細胞數(shù)少于正常對照組(21.92±6.18)個/104μm2和UC組(19.96±11.31)個/104μm2，與UC及正常對照組比較均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CD163染色時CD與UC組比較無統(tǒng)計學意義。 Ki67三組的組間比較均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 通過多種組織細胞免疫組化染色結果可以綜合判斷IBD的免疫狀態(tài)及對UC和CD進行鑒別診斷。

炎性反應性腸病； 組織細胞； 免疫組織化學染色； 形態(tài)學

炎性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種常見的慢性腸道疾病，主要包括潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn’s disease，CD)。兩者的鑒別診斷一直是一大難題。本研究旨在為IBD的診斷及鑒別診斷方法發(fā)現(xiàn)新問題，找到新思路。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2011-01-01至2013-06-30武警總醫(yī)院病理科經消化科及病理科共同診斷為IBD的病例187例，重新查閱病史、內鏡資料及重新閱片，根據2012年中華醫(yī)學會消化病學分會炎性反應性腸病學組的炎性反應性腸病診斷與治療的共識意見[1]的標準重新診斷，經篩選后的病例UC組 30例，CD組 26例，病變部位集中在回盲部距肛門口5 cm內。另外通過正常體檢腸鏡檢查，選取10例正常大腸腸壁組織作為對照。

1.2 實驗方法 每個蠟塊按病理號進行連續(xù)切片7張，厚約5 μm，HE染色1張，選取了6種抗體分別進行標記，分別為CD1a、CD21、CD68、CD163、S-100、Ki-67。所選用抗體除CD163為中杉金橋生物技術有限公司提供外，均由北京西雅金橋生物技術有限公司提供。方法：常規(guī)兩步法免疫組化染色。

1.3 計算分析 所有切片均掃描進入優(yōu)納ISCAN系統(tǒng)(由優(yōu)納數(shù)字醫(yī)療進行分析，半定量標準：在×40放大倍數(shù)下(目鏡×10,物鏡×4)，隨機選擇10個視野，取該放大倍數(shù)下細胞數(shù)/104μm2[3]。系統(tǒng)自動計算出ROI線內包含的細胞數(shù)，得出最終細胞數(shù)，進行統(tǒng)計分析。

2 結 果

2.1 正常對照組五種染色結果 正常對照組中，DC染色除CD1a與CD21比較無統(tǒng)計學意義，其他各抗體的比較結果均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。巨噬細胞染色的CD68和CD163比較也具有統(tǒng)計學意義(P<0.05 ,表1)。

2.2 UC組五種染色結果分析 UC組的組織細胞染色結果為CD21、CD68和CD163(圖1)，三組之間的比較無統(tǒng)計學意義。CD1a與其他四組抗體比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2)。

表1 正常對照組組織細胞染色抗體的組間比較 ±s)

注：CD1a與其他抗體比較,①P<0.05； CD21與其他抗體比較,②P<0.05；CD68與其他抗體比較,③P<0.05； CD163與其他抗體比較,④P<0.05；與其他抗體比較, ⑤P<0.05

圖1 UC組抗體染色圖(×40)

±s)

注：CD1a與其他抗體比較,①P<0.05； CD21與其他抗體比較,②P<0.05；CD68與其他抗體比較,③P<0.05； CD163與其他抗體比較,④P<0.05；與其他抗體比較, ⑤P<0.05

2.3 CD組五種染色結果分析 CD組組織細胞染色結果分析(圖2)，除CD163與CD1a及S-100比較無統(tǒng)計學意義外，其他各抗體之間的比較均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表3)。

表3 CD組組織細胞染色抗體的組間比較 ±s)

注：CD1a與其他抗體比較,①P<0.05； CD21與其他抗體比較,②P<0.05；CD68與其他抗體比較,③P<0.05； CD163與其他抗體比較,④P<0.05；與其他抗體比較, ⑤P<0.05

3 討 論

正常腸道的腺體之間散布著的細胞數(shù)量不是很多，平均細胞數(shù)為(59.57±14.04)個/104μm2。本研究發(fā)現(xiàn)，UC鏡下表現(xiàn)是一個動態(tài)變化的過程，UC及CD的細胞數(shù)與正常對照組相比均具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。

單核巨噬細胞作為黏膜免疫的第一道防線，在炎性反應時對病原體具有很強的吞噬和溶解功能，同時還通過抗原遞呈和分泌細胞因子激活特異性的宿主免疫反應。樹突狀細胞和巨噬細胞是兩類最重要的專職抗原呈遞細胞[3]。

3.1 樹突狀細胞 在體內數(shù)量較少，但分布較廣，DC作為體內最強大的抗原提呈細胞,不僅可以誘導免疫應答，而且可以誘導免疫耐受。

CD1a為未成熟樹突狀細胞(immature DC，iDC)的特異性表面標志[4]。在正常腸黏膜內幾乎沒有表達。CD1a在UC固有層內可見到極個別陽性細胞，與正常腸黏膜內的分布比較無統(tǒng)計學意義，淋巴濾泡內則未見到陽性細胞。CD的CD1a陽性DCs主要在靠近上皮的固有層內聚集分布，部分散在。陽性細胞數(shù)要比正常對照組和UC多，小血管周圍及淋巴細胞周圍均可見到陽性細胞,平均細胞數(shù)：(22.19±10.19)個/104μm2。統(tǒng)計分析比較與正常對照組及UC均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。CD1a染色在正常腸黏膜及IBD的這種差別還沒有報道。UC與CD雖然同為免疫性疾病，但二者的發(fā)病機制不同。

S-100蛋白是DC較好的標記物，S-100陽性DC作為一種免疫抗原提呈細胞分布于全身各器官組織中。正常對照組中S-100固有層內(陽性)。UC組S-100在固有層內分布廣，與淋巴細胞接觸緊密，且越靠近表面數(shù)量越多，平均細胞數(shù)：(37.14±15.04)個/104μm2。CD陽性細胞數(shù)少于UC(20.27±7.57個/104μm2)。三組的組間比較均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。S-100染色陽性的DC細胞是比較成熟的DC細胞，三組間的差異，說明了正常對照組與IBD免疫狀態(tài)的不同，并且UC的抗原提呈細胞要多于CD。

CD21用來標記濾泡樹突狀細胞(follicular dendritic cell,FDC)。正常腸黏膜內，CD21顯示明確的網狀結構。UC的CD21陽性細胞在固有層內可見到散在分布細胞。CD的CD21陽性細胞與上皮細胞及血管的關系比較密切。三者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。實際工作中，CD21主要用來標記濾泡樹突細胞網，固有層內也可以見到散在分布的CD21陽性細胞， 由于CD21也可以使部分T、B染色，在組織學上的鑒別診斷意義不大。

3.2 巨噬細胞 在體內分布廣，且具有強大的吞噬功能。巨噬細胞本身也是免疫效應細胞，活化的巨噬細胞可以殺傷病原體和腫瘤細胞[5]。

CD68染色組織細胞呈陽性。正常對照組CD68在固有層內陽性細胞數(shù)量相對較多，但上皮細胞之間未見陽性細胞，越靠近上皮部位陽性細胞數(shù)量逐漸增多。UC組的陽性細胞在固有層內密集分布，淋巴細胞聚集區(qū)則為陰性，與上皮細胞接觸緊密，偶可見CD68陽性細胞進入到上皮細胞之間。CD組中的CD68分布情況與UC大致相同，在形成肉芽組織部位可見聚集現(xiàn)象。本研究結果顯示，UC組與正常對照組比較無統(tǒng)計學意義。 而CD組的陽性細胞數(shù)少于正常對照組和UC組，與UC及正常對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。文獻[6]報道，IBD時腸黏膜固有層內存在大量的CD68陽性細胞，與正常腸黏膜相比具有顯著差異，提示IBD的發(fā)生與固有層內免疫細胞的增多可能存在一定的內在聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn)，CD的CD68陽性巨噬細胞少于UC組， CD68染色可作為UC與CD的鑒別診斷方法。

CD163限制性表達于單核/巨噬細胞系。文獻[7]報道，CD163是單核巨噬細胞的特異性標記，早期免疫組化研究多用CD68作為巨噬細胞標記，但發(fā)現(xiàn)CD68還可表達于成纖維細胞、內皮細胞等細胞，因此不能作為巨噬細胞的特異性標記。

綜上所述，消化內鏡下取得的鉗夾標本，只要取到了黏膜固有層，通過多種抗體的免疫組織化學染色結果綜合分析，可以對UC與CD予以鑒別，為臨床治療提供參考。

[1] 中華醫(yī)學會消化病學分會炎性反應性腸病學組.炎性反應性腸病診斷與治療的共識意見(2012.廣州)[J].中華內科雜志，2012，51(10)：818-831.

[2] 高英茂，宋天保.組織學與胚胎學[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：153-155.

[3] 紀小龍.消化道病理學[M].北京: 人民軍醫(yī)出版社,2010:383-387.

[4] 紀小龍，張 雷.診斷免疫組織化學[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2011：45-53.

[5] Caballero T, Nogueras F, Medina M T,etal. Intraepithelial and lamina proprialeuecxtyle subsets in inflammatory bowel disease: an immunohistocheical study of colon and biospy specimens[J]. J Clin Pathol, 1995, 48:743-748.

[6] 李 寧，劉冠賢，石詠軍，等.樹突狀細胞與免疫調節(jié)的研究進展[J].西南軍醫(yī)，2010,12(3)：504-506.

[7] Steinman R M，Hawiger D，Liu K，etal. Dendritic cell funtion in vivo during the steady state: a role in peripheral tolerance [J]. Ann NY Acad Sci, 2003,987:15-25.

(2014-11-11收稿 2015-01-12修回)

(責任編輯 尤偉杰)

Significance of tissue cells in diagnosis of inflammatory bowel disease

XU Xin1，JI Xiaolong1，and XU Mingzhi2.

1. Department of Pathology，General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces，Beijing 100039,China;2.the Second Clinic, National Defense University of PLA, Beijing 100063,China

Objective Inflammatory bowel disease(IBD) includes ulcerative colitis(UC) and Crohn’s disease(CD). Definitive diagnosis of UC and CD relies on colonoscopy and biopsy, but it is difficult to give a definitive diagnosis for pathologists by specimens taken from colonoscopy. We hope that through the study for distribution and types of tissue cells within lesions ,looking for new clues to differential diagnosis.Methods Combining clinical history, endoscopy and the new standard, we remade the diagnosis, finally made sure of 30 cases of UC, 26 cases of CD, and 10 cases of normal intestine mucosa taken as the control. All the cases were re-stained by HE and two-step IHC for 6 items of antigens(CD1a、CD21、CD68、CD163、S-100、Ki-67), and these sections were analyzed by UNISCAN system to do semi-quota standard. The SPSS13.0 was used for statistics. The IHC was also analyzed through dividing the strength of the positive staining. Results The cell number in the CD and UC was significantly different from the control(P<0.01). In the CD mucosa, there were more positive cells than in the normal control and UC, with statistically significant difference(P<0.05).The CD21 expression could be the result of other cells stained, and had little diagnostic value. The S-100 positive cell types were rich in these 3 groups, in every two group with statistically significant difference(P<0.05).There was no CD68 expression statistically significant difference in the UC group compared with normal control(P>0.05), but the positive cell number in the CD group were less compared with the normal control and UC group, with statistically significant difference(P<0.05). There were rare Ki67 positive cells in the control group. In the UC group the Ki67 positive cells were more than in the CD group. Three groups of comparisons between groups were statistically significantly different (P<0.05).Conclusions These antibodies can be used as staining differential diagnosis of UC and CD. CD1a:UC(-),CD(+); Ki67 UC(+>10%),CD(+1%-2%);number of positive cells of S-100 and CD68， UC〉CD. The other antibodies can be used as auxiliary diagnositic means.

inflammatory bowel disease; tissue cells; immunohistochemistry; morphology

徐 薪，博士，主治醫(yī)師，E-mail:xxblueflower@163.com

1.100039 北京，武警總醫(yī)院病理科;2.100063 北京，國防大學第二門診部

紀小龍，E-mail: geexl@126.com

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