陳曉丹，李愛民，張正海，張悅

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春 130112)

蘇枸杞(LyciumruthenicumMurr.)屬茄科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium)植物，俗稱黑果枸杞[1]，是分布于我國(guó)青海、新疆、內(nèi)蒙古、陜西、甘肅和西藏等西北部地區(qū)的一類珍貴漿果植物[2]；蘇枸杞適應(yīng)性強(qiáng)，喜光、耐寒、耐干旱、耐鹽堿[3]，是我國(guó)西部地區(qū)特有的沙漠藥用植物[4，5]。蘇枸杞果實(shí)中富含花青素，是迄今為止發(fā)現(xiàn)原花青素含量最高的野生植物，具有清除氧自由基、滋補(bǔ)肝腎、益精明目、增強(qiáng)免疫功能、防治癌癥、抗衰老和美容等功能，被譽(yù)為“軟黃金”[6]，售價(jià)較高。近年來(lái)，隨著野生蘇枸杞藥用保健產(chǎn)品的開發(fā)，凸顯出巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，導(dǎo)致這一寶貴野生資源的面積大大減少，當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境遭人為破壞，已初步呈現(xiàn)一定的資源與環(huán)境問(wèn)題。針對(duì)這一現(xiàn)狀，為了更好地保護(hù)西部地區(qū)生態(tài)環(huán)境和利用蘇枸杞這一珍貴資源，滿足現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)的發(fā)展需求，本研究通過(guò)組織培養(yǎng)建立了蘇枸杞快速繁殖體系，解決了其苗木繁育的問(wèn)題[7]，為其大面積栽培提供了技術(shù)依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行。試驗(yàn)材料為2014年1月從甘肅省永靖縣引進(jìn)的蘇枸杞，其插條在室內(nèi)進(jìn)行盆栽培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1外植體處理待盆栽蘇枸杞萌發(fā)抽生新枝后，取幼嫩莖段為外植體，先用適量洗衣粉液浸泡10min，再以流水沖洗12h；于超凈工作臺(tái)上，先用75%酒精消毒30s，無(wú)菌水沖洗3次；再用0.1%升汞溶液消毒5min，無(wú)菌水沖洗5次。將滅菌的莖段接種到起始培養(yǎng)基(MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L)上，置于光下培養(yǎng)，室溫25±3℃，光照強(qiáng)度2000lx，光照時(shí)間14h/d。

1.2.2增殖繼代培養(yǎng)將“1.2.1”項(xiàng)中誘導(dǎo)形成的芽轉(zhuǎn)接于增殖培養(yǎng)基上，同時(shí)附加不同濃度的6-BA(0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L)和NAA(0.01mg/L、0.02mg/L、0.03mg/L)，每處理接種10瓶，每瓶接3芽，30d后觀察生長(zhǎng)狀況，并統(tǒng)計(jì)各處理芽的分化率。

1.2.3生根培養(yǎng)選取株高2cm以上生長(zhǎng)健壯的小植株，接種于改良的1/2MS培養(yǎng)基上，附加不同濃度的IBA(0.05mg/L、0.10mg/L、0.20mg/L)和NAA(0mg/L、0.01mg/L、0.1mg/L)，每處理接種12瓶，每瓶3株，25d后統(tǒng)計(jì)各處理生根率。

1.2.4煉苗移栽當(dāng)根長(zhǎng)至2cm～3cm時(shí)，將生根苗分別進(jìn)行3d、7d和10d煉苗，后以細(xì)河沙與腐殖土(比例為1∶3)作為移栽基質(zhì)；基質(zhì)在移栽前1天用0.2%高錳酸鉀溶液消毒基質(zhì)并覆膜24h；移栽后加強(qiáng)微環(huán)境調(diào)控，以提高成活率。

1.2.5數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)采用SAS軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 增殖培養(yǎng)

將誘導(dǎo)產(chǎn)生的芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上，經(jīng)30d培養(yǎng)，在芽的周圍均能形成一定數(shù)量的不定芽。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)在植物組織培養(yǎng)中有關(guān)鍵作用，雖然用量少，但它們對(duì)外植體的誘導(dǎo)萌發(fā)以及生根等器官分化具有重要的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，不同6-BA和NAA濃度組合對(duì)蘇枸杞的增殖效果有顯著影響。當(dāng)6-BA濃度一定時(shí)，隨著NAA濃度的升高，組培苗增殖系數(shù)逐漸降低。當(dāng)6-BA濃度為0.2mg/L、NAA濃度為0.01mg/L時(shí)，增殖系數(shù)最高，可達(dá)9.27(圖1、圖2和表1)。

圖1 蘇枸杞腋芽萌發(fā)

圖2 增殖培養(yǎng)

表16-BA和NAA激素配比對(duì)叢生芽增殖的影響

Table1Effectofvarioushormoneonadventitiousbudnumber

6-BA(mg/L)NAA(mg/L)接種數(shù)(個(gè))Inoculatednumber平均增殖系數(shù)Averagegrowthmodulus0.10.01305.50cde0.10.02306.39c0.10.03305.94cd0.20.01309.27a0.20.02308.06b0.20.03304.56ef0.30.01305.39cde0.30.02303.78f0.30.03305.06de

注：小寫字母表示α=0.05水平下差異顯著性，同列不同字母表示差異顯著。下同。

Note：Small letter represents significance at 0.05.Different letter within one column showed significance at 0.05 levels by Duncans LSD test.The same as below.

2.2 生根培養(yǎng)

將株高2cm以上的小植株接種到生根培養(yǎng)基上，7d后開始生根，25d后大量生根。結(jié)果表明，不同處理間差異顯著。當(dāng)NAA濃度一定時(shí)，生根率與根數(shù)隨著IBA濃度的升高而分別提高和增加，說(shuō)明添加IBA促進(jìn)生根。組培苗根數(shù)越多，根對(duì)養(yǎng)分的吸收面積越大，那么生根苗的長(zhǎng)勢(shì)越好，將來(lái)移栽成活的幾率也會(huì)大大增加。當(dāng)生根培養(yǎng)基中添加IBA 0.1mg/L+NAA 0.2mg/L時(shí)，植株生根率最高，可達(dá)72.2%，且植株生長(zhǎng)健壯(圖3和表2)。

圖3 誘導(dǎo)生根

表2不同IBA和NAA濃度對(duì)生根的影響

Table 2 Effect of different concentrations of NAA and IBA on rooting

2.3 煉苗移栽

當(dāng)根長(zhǎng)至2cm～3cm時(shí)，把培養(yǎng)瓶移到室溫條件下煉苗，使其能逐步適應(yīng)外界的環(huán)境變化，增加成活率。不同的煉苗時(shí)間間組培苗的移栽成活率差異顯著。煉苗時(shí)間為3d時(shí)，組培苗木質(zhì)化程度低，仍處于“自養(yǎng)”狀態(tài)，因此，較難適應(yīng)瓶外的環(huán)境，成活率僅為24%；煉苗時(shí)間為10d時(shí)，培養(yǎng)基容易受到外界有菌環(huán)境的污染，并且，培養(yǎng)基中水分蒸發(fā)，根部培養(yǎng)基干燥，較難清洗干凈，根部殘留的培養(yǎng)基容易引起移栽苗爛根死亡，使成活率降低；煉苗時(shí)間為7d時(shí)，組培苗已經(jīng)完成馴化且培養(yǎng)基較易清洗干凈，移栽苗的成活率最高，可達(dá)83%。以細(xì)河沙與腐殖土混合作為移栽基質(zhì)，并用0.2%高錳酸鉀溶液消毒，移栽后保持空氣濕度和溫度，覆膜養(yǎng)護(hù)，成活率可達(dá)80%以上(圖4和表3)。

圖4 幼苗移栽

表3煉苗時(shí)間對(duì)移栽成活率的影響

Table3Effectofacclimatizationtimetosurvivalrate

煉苗時(shí)間(d)Acclimatizationtime處理數(shù)(個(gè))Treatmentnumber成活率(%)Survivalrate310024.0c710083.0a1010059.0b

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

蘇枸杞是名貴的中藥材和滋補(bǔ)保健食品，越來(lái)越受到人們的重視，產(chǎn)品售價(jià)較高且供不應(yīng)求，而人們粗放采摘果實(shí)，導(dǎo)致樹體被破壞和資源銳減，當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境遭受嚴(yán)重破壞。本研究從保護(hù)資源入手，建立了蘇枸杞組培快繁體系，為其可持續(xù)利用提供了技術(shù)儲(chǔ)備。

研究中發(fā)現(xiàn)，蘇枸杞莖段誘導(dǎo)時(shí)存在玻璃化現(xiàn)象，這是培養(yǎng)過(guò)程中所特有的一種生理失調(diào)或生理病變，主要是瓶?jī)?nèi)氣體交換受阻、外植體生長(zhǎng)量過(guò)大、溫度過(guò)高、濕度過(guò)大以及細(xì)胞分裂素的濃度過(guò)高等環(huán)境因素所致。羅青等[7]研究了引起枸杞組培苗玻璃化因素，認(rèn)為6-BA 0.2mg/L、蔗糖3%、瓊脂6.5mg/L、培養(yǎng)溫度25℃、在2000lx光照強(qiáng)度下接受12h的光照，可以有效減少玻璃化苗的發(fā)生。本研究中也產(chǎn)生了少量的玻璃化苗，可能是由于培養(yǎng)溫度過(guò)高、瓊脂含量略低、細(xì)胞分裂素濃度過(guò)高等造成的。

植物激素是影響組織培養(yǎng)快繁的重要因素，其成分、濃度和配比都會(huì)對(duì)細(xì)胞的分化和器官的發(fā)生產(chǎn)生很大的影響[8]。本研究以MS為基本培養(yǎng)基，添加較低濃度的6-BA(0.2mg/L)和NAA(0.01mg/L)，獲得了較高的增殖率。陳正華[9]認(rèn)為，生長(zhǎng)素濃度過(guò)高會(huì)抑制木本植物芽的增殖，以較低濃度為宜。

NAA和IBA被廣泛應(yīng)用于生根培養(yǎng)過(guò)程中，孫書偉等[10]認(rèn)為，IBA能顯著提高藍(lán)莓組培苗瓶?jī)?nèi)的生根率；戴云新等[11]研究結(jié)果表明，NAA誘導(dǎo)非洲菊組培苗的根肥大、粗短，而IBA誘導(dǎo)的根相對(duì)較長(zhǎng)。本研究中，進(jìn)行蘇枸杞生根預(yù)試驗(yàn)時(shí)，在1/2MS培養(yǎng)基中只添加了NAA，結(jié)果組培苗基部形成巨大的根瘤狀組織，生根效果很差，隨后，又增添了不同濃度的IBA聯(lián)合使用促進(jìn)生根，取得了較好的效果，這可能是因?yàn)槎喾N激素共同作用才能很好地完成細(xì)胞的分化和器官的形成。

3.2 結(jié)論

以蘇枸杞幼嫩莖段作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，在MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L上誘導(dǎo)萌發(fā)；適宜增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.01mg/L；適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.1mg/L+NAA 0.2mg/L；最佳的煉苗時(shí)間為7d，移栽基質(zhì)為細(xì)河沙與腐殖土(比例為1∶3)，0.2%高錳酸鉀溶液消毒24h，移栽成活率可達(dá)80%以上。

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