逄世峰，閆梅霞，崔麗麗，李亞麗，郭靖※，楊珺

(1．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春 130112； 2．長(zhǎng)春市公安局司法鑒定中心，長(zhǎng)春 130122)

蛹蟲(chóng)草[Cordycepsmilitaris(L.ex Fr.)Link]是蟲(chóng)草屬的模式種，在生物分類學(xué)上與冬蟲(chóng)夏草(Cordycepssinensis)同為蟲(chóng)草屬[1]，由于天然冬蟲(chóng)夏草的資源非常有限，作為冬蟲(chóng)夏草代替品的蛹蟲(chóng)草已被越來(lái)越多的人接受[2]。

蟲(chóng)草素和腺苷是蟲(chóng)草的主要活性成分，蟲(chóng)草素具有抑菌、抗腫瘤、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基等多種生物活性[3]，腺苷具有改善心腦血液循環(huán)、抑制中樞神經(jīng)遞質(zhì)釋放等多種活性[4]。超高效液相色譜(UPLC)儀為目前被證實(shí)最高效的分離儀器，具有分離時(shí)間短、靈敏度高等特點(diǎn)[5]，目前，尚未見(jiàn)在腺苷和蟲(chóng)草素分析方面的應(yīng)用。本試驗(yàn)建立一種蛹蟲(chóng)草中腺苷和蟲(chóng)草素含量測(cè)定方法，旨在為蛹蟲(chóng)草質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 主要材料、儀器和試劑

蛹蟲(chóng)草子實(shí)體(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所新藥創(chuàng)制研究室培養(yǎng))；超高效液相色譜儀ACQUITY(Waters公司)；腺苷標(biāo)準(zhǔn)品(四川維克奇生物科技有限公司)；蟲(chóng)草素(廣州寬林科技有限公司)；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水。

1.2 色譜條件

ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1mm×50mm，1.8μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(15∶85)；流速：0.3mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：2μL。

1.3 對(duì)照品溶液制備

精密稱取腺苷對(duì)照品5.61mg、蟲(chóng)草素對(duì)照品1.72mg，分別置100mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。

1.4 樣品溶液制備[6]

蛹蟲(chóng)草子實(shí)體自然晾干至恒重，取出，粉碎，過(guò)60目篩，將過(guò)篩后的粉末放入自封袋中并置于干燥器中保存。準(zhǔn)確稱取樣品粉末0.1g于50mL離心管中，精密移取25mL超純水，密封，超聲(功率500W、頻率40kHz)提取2h，10 000r/min離心10min，取上清，過(guò)0.2μm微孔濾膜，供UPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法的選擇

腺苷和蟲(chóng)草素常用的提取方法有加熱回流提取法和超聲提取法，為防止腺苷高溫不穩(wěn)定[6]，本研究采用了超聲提取方法。

腺苷和蟲(chóng)草素常用的提取溶劑有水和甲醇[4，7]，本研究考察了這2種溶劑對(duì)蛹蟲(chóng)草中腺苷和蟲(chóng)草素的提取效果，結(jié)果表明，水提取腺苷效果優(yōu)于甲醇，而甲醇提取蟲(chóng)草素效果略優(yōu)于水(表1)。

表1不同提取溶劑對(duì)蛹蟲(chóng)草中腺苷、蟲(chóng)草素含量的影響

Table1EffectsofsolventsonextractionofadenosineandcordycepinfromculturedC.militaris(mg/g)

提取溶劑Extractionsolvent腺 苷Adenosine蟲(chóng)草素Cordycepin水 Water1.1550.336甲醇 Methanol0.2440.345

2.2 樣品溶解溶液的選擇

本研究考察了標(biāo)準(zhǔn)品水溶液和甲醇溶液對(duì)色譜分離的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解時(shí)，峰較寬，且圓角；水溶解時(shí)，峰形尖銳，色譜分離效果較好。

2.3 色譜柱的選擇

本研究比較了ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1mm×50mm，1.7μm)和ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1mm×50mm，1.8μm)。結(jié)果表明，ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱對(duì)腺苷和蟲(chóng)草素保留較強(qiáng)，更利于腺苷和蟲(chóng)草素的分離。

2.4 流動(dòng)相的選擇

《中國(guó)藥典》中采用磷酸鹽緩沖溶液和甲醇作為色譜分離流動(dòng)相[7]，本研究考察了甲醇-水、乙腈-水洗脫系統(tǒng)對(duì)色譜分離的影響發(fā)現(xiàn)，不用緩沖鹽依然能得到較好的分離效果，乙腈-水洗脫系統(tǒng)中腺苷稍微拖尾，15%甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰對(duì)稱，峰形較好。

2.5 線性關(guān)系與檢出限、定量限

取對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣不同體積，以進(jìn)樣質(zhì)量(ng)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢出限(LOD)和定量限(LOQ)由3倍和10倍信噪比計(jì)算而來(lái)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2線性回歸方程與LOD、LOQ

Table 2 Linear regression data,LOD and LOQ

2.6 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液，按“1.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果腺苷、蟲(chóng)草素峰面積的RSD分別為0.49%和0.54%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于0h、4h、8h、12h、16h進(jìn)樣，測(cè)定腺苷、蟲(chóng)草素的峰面積。結(jié)果腺苷、蟲(chóng)草素峰面積的RSD分別為1.7%和2.3%，表明溶液在16h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率

精密稱定已知含量的蛹蟲(chóng)草粉末6份，置離心管中，添加對(duì)照品溶液1mL，精密移取24mL超純水，按“1.4”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，在上述色譜條件下測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3加樣回收率

Table 3 Recovery of sample (n=6)

2.9 樣品測(cè)定

按照“1.4”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按照“1.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定樣品，得蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中腺苷和蟲(chóng)草素含量為1.22mg/g和0.28mg/g，色譜圖見(jiàn)圖1。

1.腺苷；2.蟲(chóng)草素 1.Adenosine;2.Cordycepin

3 結(jié)論

超高效液相色譜是一個(gè)新興的領(lǐng)域，目前尚未見(jiàn)在腺苷和蟲(chóng)草素分析中應(yīng)用，本試驗(yàn)建立了蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中腺苷和蟲(chóng)草素含量的UPLC檢測(cè)方法。與傳統(tǒng)方法相比較，流動(dòng)相中無(wú)需添加緩沖鹽，且在1.7min完成測(cè)定，該方法簡(jiǎn)便、快捷，可用于蛹蟲(chóng)草中腺苷和蟲(chóng)草素的含量測(cè)定及質(zhì)量控制。

[1]張姝,張永杰,SHRESTHA Bhushan,等.冬蟲(chóng)夏草菌和蛹蟲(chóng)草菌的研究現(xiàn)狀、問(wèn)題及展望[J].菌物學(xué)報(bào),2013,32(4):577.

[2]桂仲爭(zhēng),朱雅紅.蛹蟲(chóng)草的人工培育、有效成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].蠶業(yè)科學(xué),2008,34(1):178.

[3]楊濤,董彩虹.蟲(chóng)草素的研究開(kāi)發(fā)現(xiàn)狀與思考[J].菌物學(xué)報(bào),2011,30(2):180.

[4]毛新亮,鄭國(guó)棟,張晨,等.反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定冬蟲(chóng)夏草中腺苷、蟲(chóng)草素、肌苷含量方法的研究[J].中南藥學(xué),2009,7(12):895.

[5]金高娃,章飛芳,薛興亞.超高效液相色譜在復(fù)雜體系中藥分離分析中的應(yīng)用[J].世界科學(xué)技術(shù),2006,8(3):106-110.

[6]郭澄,朱杰,張純,等.高效液相色譜法測(cè)定人工蟲(chóng)草菌絲中腺苷和蟲(chóng)草素的含量[J].中國(guó)中藥雜志,1998,23(4):236.

[7]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[K].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:106.