劉曉穎，鮑坤，劉晗璐，李光玉，馮卓

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130112)

梅花鹿是我國鹿科動物中最為名貴的鹿種之一，與其它反芻動物一樣，瘤胃與梅花鹿的健康以及生產(chǎn)性能密切相關(guān)，大量的細(xì)菌、真菌、原蟲、噬菌體和產(chǎn)甲烷菌等微生物棲息在梅花鹿瘤胃內(nèi)，而且這些微生物與微生物之間以及微生物與宿主之間處于一種相互制約、相互依賴的動態(tài)平衡狀態(tài)，微生物通過相互間的協(xié)同作用，將采食的飼料物質(zhì)轉(zhuǎn)化為動物生長所需要的揮發(fā)性脂肪酸、氨基酸和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)[1]。由于瘤胃微生物的復(fù)雜性，目前，國內(nèi)、外對反芻動物牛、羊瘤胃內(nèi)細(xì)菌分離鑒定的研究較少，梅花鹿瘤胃內(nèi)細(xì)菌研究基本為空白。

棒狀桿菌為反芻動物瘤胃內(nèi)正常存在的一種微生物，具有較強(qiáng)的耐受性和定植能力。本試驗應(yīng)用分離培養(yǎng)、革蘭氏染色、顯微鏡觀察、16Sr DNA序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建相結(jié)合的方法，對18株來源于梅花鹿瘤胃的細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定與分子分類，豐富了瘤胃微生物資源數(shù)據(jù)庫，并且為梅花鹿瘤胃細(xì)菌的利用研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1培養(yǎng)基及試驗儀器厭氧瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂等均按有關(guān)文獻(xiàn)配制[2，3]；厭氧袋、厭氧產(chǎn)氣袋(青島海博生物公司)；細(xì)菌微量生化鑒定管(杭州天和生物有限公司)；細(xì)菌基因組提取試劑盒(天根生物工程公司)。

1.1.2瘤胃液采集[4]瘤胃液采自裝有永久瘤胃瘺管的梅花鹿，無菌2層紗布過濾去掉殘渣，濾液用無菌注射器注入?yún)捬跖囵B(yǎng)管，4℃保溫箱快速帶回實驗室。

1.2 方法

1.2.1菌種分離將4℃保存的瘤胃液樣品取1mL，無菌操作10倍系列稀釋到10-7倍，取0.1mL 10-6、10-72個梯度瘤胃液，分別涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃需氧和厭氧培養(yǎng)，待長出菌落，挑取邊緣光滑、規(guī)則菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18h～24h后，革蘭氏染色鏡檢。

1.2.2耐氧實驗將純化的菌株分別接到MRS瓊脂培養(yǎng)基和厭氧肉湯、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，每株菌、每種培養(yǎng)基各2組，其中1組37℃需氧培養(yǎng)，另1組37℃厭氧袋培養(yǎng)，24h～48h觀察結(jié)果。

1.2.3生理生化指標(biāo)鑒定將上述分離的菌株進(jìn)行觸酶、糖類發(fā)酵等生理生化指標(biāo)的測定。

1.2.4分離細(xì)菌16SrDNA序列測定分離純化的細(xì)菌總DNA提取采用細(xì)菌基因組提取試劑盒并按操作說明書進(jìn)行，凝膠電泳顯示有DNA條帶后，送測序，序列測定由吉林庫美生物科技公司完成。所得序列利用EZTAXON軟件在Ezbiocloud上進(jìn)行同源性比較。

1.2.5分離菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及分析選取同源性較高的典型菌株，將18株菌株與典型菌株序列利用MegA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的初步分離篩選

在需氧和厭氧培養(yǎng)的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，分別挑取形態(tài)規(guī)則、邊緣整齊的灰白色菌落或黃色菌落，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢觀察，呈球桿狀或梭桿狀的革蘭氏陽性菌。需氧培養(yǎng)灰白色菌落6株，分別為C1、C2、C3、C4、C5、C6；厭氧培養(yǎng)黃色菌落4株，分別為C7y、C8y 、C9y、C10y；厭氧培養(yǎng)灰白色或菌落8株，分別為C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18。分別接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中增菌。

2.2 耐氧實驗

將“2.1”項下分離純化的18株菌株接種于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)后，需氧和厭氧培養(yǎng)24h～48h觀察發(fā)現(xiàn)，C11、C7y、C8y 、C9y、C10y在厭氧條件下生長渾濁，需氧條件下輕微渾濁，而其余13株菌在需氧、厭氧條件下均生長。

2.3 分離菌株的生理生化鑒定

分離的18株細(xì)菌觸酶試驗均為陽性，不能利用乳糖、甘露醇、阿拉伯糖、鼠李糖、山梨醇、纖維二糖，靛基質(zhì)反應(yīng)、苯丙氨酸反應(yīng)陰性；除C4、C6外，均能利用葡萄糖、甘露糖、蔗糖、木糖、果糖，MR試驗、硝酸鹽還原試驗陽性；C7y、C8y、C9y、C10y能利用麥芽糖、C7y可利用棉籽糖。具體生理生化鑒定結(jié)果見表1。

2.4 分離菌株特異性16Sr DNA的序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建[5，6]

對18株分離純化的細(xì)菌做了16Sr DNA序列測定。18株細(xì)菌16Sr DNA序列長度約為1400bp，與Ezbiocloud上進(jìn)行EZTAXON序列比對，C1、 C2、C3、C5、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18與CorynebacteriumvitaeruminisDSM 20294(CP004353)序列同源性達(dá)99.93%以上，C4、C6與C.glycinophilumAJ3170(CP006842)同源性99.71%以上，C11與C.minutissimumATCC 23348同源性96.66%，C7y、C8y、C9y、C10y與C.minutissimumATCC 23348同源性96.83%以上，結(jié)合菌株革蘭氏染色陽性、菌落形態(tài)特征、生理生化特征，最后確定分離得到的菌株均為放線菌綱放線菌目棒狀桿菌科棒狀桿菌屬細(xì)菌。將18株菌株的16Sr DNA序列與C.vitaeruminisDSM 20294(CP004353)、C.minutissimumATCC 23348(JSEF 01000027.1)、C.glycinophilumAJ3170(CP006842)3株同源性較高的菌株在Genebank上的序列比對，利用MeGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1所示。C1、C2、C3、C5、C12、C13、C14、C16、C17、C18與C4、C6親緣關(guān)系較近，C11與C7y、C8y 、C9y、C10y親緣關(guān)系較近。

表118株梅花鹿瘤胃分離細(xì)菌的生理生化特性

Table118StrainsofbacteriaisolatedfromtherumenofSikadeerphysiologicalandbiochemicalcharacteristics

3 結(jié)論

本試驗利用普通瓊脂平板培養(yǎng)基，通過需氧和厭氧2種培養(yǎng)方式，從梅花鹿瘤胃液內(nèi)分離出18株細(xì)菌，菌落顏色呈灰白色需氧菌6株，分別為C1、C2、C3、C4、C5、C6；菌落顏色呈黃色的厭氧菌4株，分別為C7y、C8y 、C9y、C10y；菌落顏色呈灰白色厭氧菌8株，分別為C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18。革蘭氏染色鏡檢，菌體為球桿狀或梭桿狀的革蘭氏陽性細(xì)菌；耐氧實驗表明，除C11、C7y、C8y、C9y、C10y在需氧條件下長勢較差外，其余菌株在厭氧條件下均生長良好。

對分離的18株細(xì)菌進(jìn)行部分生化鑒定，18株細(xì)菌觸酶試驗均為陽性，不能利用乳糖、甘露醇、阿拉伯糖、鼠李糖、山梨醇、纖維二糖，靛基質(zhì)反應(yīng)、苯丙氨酸反應(yīng)陰性；除C4、C6外，均能利用葡萄糖、甘露糖、蔗糖、木糖、果糖，MR試驗、硝酸鹽還原試驗陽性；C7y、C8y、C9y、C10y能利用麥芽糖，C7y可利用棉籽糖。

由于細(xì)菌在培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)差別很小，細(xì)菌的多形性僅僅通過菌落形態(tài)、染色特性和生理生化鑒定并不能準(zhǔn)確說明是哪種細(xì)菌，18株分離菌在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落顏色形態(tài)、鏡下形狀并不相同，為此，本實驗提取了純化細(xì)菌的基因組DNA，

圖1 分離的18株細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

對分離的18株細(xì)菌進(jìn)行了16Sr DNA的測序，并進(jìn)行了同源性分析，將18株菌株的16Sr DNA序列與3株同源性較高的菌株Genebank上的序列進(jìn)行對比，利用MeGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)合菌落形態(tài)和生理生化指標(biāo)，確定分離的18株梅花鹿瘤胃細(xì)菌為放線菌綱放線菌目棒狀桿菌科棒狀桿菌屬細(xì)菌。

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