富波，范卓文

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040)

適體(aptamer)是經(jīng)過(guò)指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment，SELEX)篩選出來(lái)的能夠特異性結(jié)合蛋白質(zhì)或其它小分子物質(zhì)的寡核苷酸片段。指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化是由Szostak和Goldberg兩個(gè)研究小組在1990年分別獨(dú)立地提出的一種體外篩選技術(shù)［1-2］，該技術(shù)是從一個(gè)人工構(gòu)建的、巨大的單鏈寡核苷酸文庫(kù)中篩選出與目標(biāo)物高選擇性、高親和力結(jié)合的DNA或者RNA片段，這樣的片段被稱(chēng)為核酸適體，簡(jiǎn)稱(chēng)適體。

1 適體篩選過(guò)程及特點(diǎn)

1.1 適體的指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化篩選過(guò)程

(1)通過(guò)化學(xué)合成法構(gòu)建一個(gè)巨大的、序列隨機(jī)的單鏈寡核苷酸文庫(kù)；(2)在特定的緩沖溶液體系和溫度下，將這些隨機(jī)序列與目標(biāo)物進(jìn)行孵育，結(jié)果只有極少數(shù)隨機(jī)序列與目標(biāo)物結(jié)合；(3)通過(guò)物理的方法分離出結(jié)合物，并將隨機(jī)序列和目標(biāo)物分離；(4)將分離出的隨機(jī)序列進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；(5)擴(kuò)增產(chǎn)物再與目標(biāo)物一起孵育，進(jìn)入下一輪篩選。如此，經(jīng)過(guò)多輪篩選，就能夠得到與目標(biāo)物高選擇性、高親和力結(jié)合的適體。

1.2 適體的特點(diǎn)

與傳統(tǒng)的識(shí)別元素抗體相比，適體作為一種新型的識(shí)別元素具有很多獨(dú)特的特點(diǎn)：(1)適體與目標(biāo)物結(jié)合具有高選擇性和高親和力。親和力高是因?yàn)檫m體是經(jīng)過(guò)多輪篩選而得到的，在篩選的過(guò)程中適體和目標(biāo)物的解離常數(shù)不斷地降低。適體還具有高選擇性，可以區(qū)分目標(biāo)物結(jié)構(gòu)的微小差異，例如，茶堿與咖啡因結(jié)構(gòu)只相差一個(gè)甲基，與可可堿相比只是甲基位置不同，而茶堿適體卻能特異識(shí)別茶堿，與其它兩種物質(zhì)無(wú)反應(yīng)［3］；L-精氨酸的適體與L-精氨酸的親和力比與D-精氨酸高出12 000倍［4］。(2)適體能夠結(jié)合的目標(biāo)物十分廣泛：適體不僅可以和酶、生長(zhǎng)因子、抗體等較大的蛋白質(zhì)分子結(jié)合，還可以和金屬離子、有機(jī)染料、氨基酸、核苷酸、肽、藥物等小分子結(jié)合，甚至可以與完整的細(xì)菌、病毒和細(xì)胞結(jié)合［5］。(3)適體經(jīng)過(guò)體外篩選、化學(xué)合成而得，相比抗體而言，其生產(chǎn)效率高、成本低，純度高、組成確定。(4)適體的穩(wěn)定性好，凍成干粉后可以在室溫條件下保存數(shù)年，適當(dāng)溶解后又立刻恢復(fù)其功能，并且可以反復(fù)變性、復(fù)性，重復(fù)利用。

2 適體在分析檢測(cè)中的主要應(yīng)用

2.1 農(nóng)藥檢測(cè)

農(nóng)藥是一類(lèi)小分子化合物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位。目前農(nóng)藥殘留定性和定量分析的主要方法有各種經(jīng)典色譜法、光譜法等，還有酶抑制法和酶聯(lián)免疫分析方法。近年來(lái)，隨著適體及其篩選技術(shù)的發(fā)展，能夠識(shí)別農(nóng)藥的適體也被篩選出來(lái)，并用于農(nóng)藥的檢測(cè)。王麗等［6］采用新的指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化篩選策略篩選出了甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷、氧化樂(lè)果4種有機(jī)磷農(nóng)藥的適體，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，這為建立基于適體識(shí)別的農(nóng)藥分析檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。啶蟲(chóng)脒、馬拉松以及雜環(huán)聚環(huán)芳香烴類(lèi)農(nóng)藥也已經(jīng)通過(guò)基于適體識(shí)別的方法被檢測(cè)出來(lái)［7］。目前基于適體識(shí)別的農(nóng)藥檢測(cè)還都處于初級(jí)階段，未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)是篩選出更多與各種農(nóng)藥分子高特異性、高親和力結(jié)合的適體，結(jié)合光化學(xué)，電化學(xué)等檢測(cè)手段，建立更多的基于適體識(shí)別的農(nóng)藥分析檢測(cè)方法。

2.2 藥物檢測(cè)

藥物是人類(lèi)防病、治病必不可少的武器，目前藥物的分析方法日新月異。除了傳統(tǒng)的分析方法，適體在藥物的分析檢測(cè)中也得到了廣泛的應(yīng)用。目前已經(jīng)有許多應(yīng)用適體識(shí)別的方法對(duì)小分子藥物進(jìn)行檢測(cè)的報(bào)道，例如Teramae課題組和Xiang課題組均利用DNA雙鏈空白位點(diǎn)結(jié)合染料和腺苷適體建立了腺苷的分析檢測(cè)方法［8-9］，檢測(cè)限分別達(dá)2 μmol／L和6 μmol／L。雖然對(duì)腺苷的檢測(cè)靈敏度不及一些電化學(xué)檢測(cè)方法高，但是已經(jīng)優(yōu)于一般的光學(xué)檢測(cè)方法，重要的是此類(lèi)方法簡(jiǎn)單、快速、無(wú)需熒光標(biāo)記。Dong課題組利用銀納米簇作為熒光信號(hào)，建立了基于適體識(shí)別的、通用的可卡因和三磷酸腺苷的分析檢測(cè)方法［10］。在該方法中，適體被分為兩個(gè)片段，每個(gè)片段都連接一段富含G堿基的DNA序列。沒(méi)有目標(biāo)分析物的時(shí)候，兩個(gè)適體片段處于游離狀態(tài)，生成的銀納米簇發(fā)出微弱的熒光；加入目標(biāo)分析物時(shí)，兩個(gè)適體片段與目標(biāo)分析物結(jié)合，使得兩個(gè)富含G堿基的DNA序列靠近，此時(shí)生成的銀納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度顯著增強(qiáng)。此方法對(duì)可卡因和三磷酸腺苷的檢測(cè)限分別達(dá)0.1 μmol／L和0.2 μmol／L。該課題組還利用銅納米粒子作為熒光信號(hào)、適體作為識(shí)別分子，建立了基于新的檢測(cè)原理的分析檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)三磷酸腺苷的檢測(cè)，檢測(cè)限低至28 nmol／L［11］?；谶m體自組裝的原理，茶堿的分析檢測(cè)方法也被建立起來(lái)［12］。

另外，多種抗生素適體也被篩選出，包括土霉素、新霉素B、四環(huán)素、氯霉素、托普霉素、卡那霉素A和B、妥布霉素、鏈霉素、莫諾霉素、環(huán)孢霉素A、青霉素類(lèi)抗生素、蒽環(huán)類(lèi)抗生素等［13-14］。相應(yīng)的分析檢測(cè)方法也被建立起來(lái)，例如Song等［15］應(yīng)用納米金材料建立了卡那霉素的比色適體傳感器，檢測(cè)限為25 nmol／L；范婷等［16］建立了青霉素類(lèi)抗生素的電化學(xué)適體傳感器，檢測(cè)限達(dá)2.81 nmol／L。這些藥物的適體多為RNA序列，與DNA適體相比較，RNA適體的保存和使用條件較高，很容易被酶解，因此限制了此類(lèi)適體在分析檢測(cè)方面的應(yīng)用。

2.3 金屬離子檢測(cè)

金屬離子的檢測(cè)在臨床檢驗(yàn)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面都有重要的作用。金屬離子適體的出現(xiàn)也為金屬離子的檢測(cè)開(kāi)辟了新的途徑?；谶m體識(shí)別的K+的分析檢測(cè)方法已多有報(bào)道。K+的檢測(cè)方法多借助凝血酶適體來(lái)構(gòu)建，凝血酶適體能夠折疊成G-四分體，由于G-四分體是一系列鳥(niǎo)嘌呤依靠氫鍵和離子之間的相互作用來(lái)穩(wěn)定，因此適體的折疊程度與K+的濃度密切相關(guān)。Nagatoishi等基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移的原理，設(shè)計(jì)了K+的熒光檢測(cè)方法［17］。Shi等建立了基于分子信標(biāo)的K+熒光檢測(cè)方法［18］。高淑麗等［19］利用適體和雙鏈DNA內(nèi)插染料噻唑橙建立起K+的熒光檢測(cè)方法。在該方法中，適體先與它的互補(bǔ)鏈形成雙鏈，噻唑橙分子插入雙鏈結(jié)構(gòu)，發(fā)出強(qiáng)烈熒光；加入K+后，與適體結(jié)合形成G-四分體結(jié)構(gòu)，使雙鏈解離變成G-四分體結(jié)構(gòu)和單鏈，從而噻唑橙分子游離出來(lái)，熒光強(qiáng)度大大降低。該方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)青霉素V甲片中K+的檢測(cè)，其結(jié)果與原子吸收法一致。此外，一些能夠和重金屬離子以及放射性離子特異性結(jié)合的適體也被篩選出來(lái)，并建立了相應(yīng)的分析檢測(cè)方法，例如Pb2+，Hg2+，UO22+等［20-24］，這為有毒害金屬離子的環(huán)境監(jiān)測(cè)提供了新的思路。

2.4 微生物檢測(cè)

適體能夠結(jié)合的目標(biāo)物非常廣泛，微生物也可以篩選得到相應(yīng)的適體，并建立相應(yīng)的分析檢測(cè)方法，有望應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)和食品微生物檢驗(yàn)。文曉堂［25］和王一嫻［26］等分別對(duì)適體在微生物檢測(cè)方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。特別是與量子點(diǎn)、碳納米管等新型納米材料相結(jié)合時(shí)，基于適體識(shí)別的檢測(cè)方法的靈敏度和效率都得到提高。目前已經(jīng)建立了基于適體識(shí)別的拉熱弗朗西斯菌、空腸彎曲桿菌、大腸桿菌、傷寒沙門(mén)氏桿菌、大腸埃希菌等微生物的分析檢測(cè)方法［27-31］。

2.5 蛋白質(zhì)檢測(cè)

蛋白質(zhì)是適體主要的目標(biāo)物之一，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量比較大，有復(fù)雜的立體結(jié)構(gòu)，因此篩選出來(lái)的相應(yīng)適體也具有更高的選擇性和更高的親和力。至今，已經(jīng)篩選出來(lái)數(shù)百種蛋白質(zhì)的適體，其中包括細(xì)胞因子、酶、抗體等。這些蛋白質(zhì)一般與生命的正?；顒?dòng)和疾病的發(fā)生有密切的聯(lián)系，這些蛋白質(zhì)的檢測(cè)對(duì)于臨床檢驗(yàn)和疾病的發(fā)現(xiàn)、治療都具有重要的意義。因此基于適體識(shí)別的各種蛋白質(zhì)分析方法也迅速發(fā)展，并且與多種檢測(cè)手段相結(jié)合，例如熒光法、比色法、電化學(xué)方法等［32-38］。其中以凝血酶作為模板目標(biāo)物，基于適體識(shí)別的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法被大量報(bào)道［39-41］。另外，基于適體識(shí)別的血小板生長(zhǎng)因子、免疫球蛋白、溶酶體等蛋白質(zhì)的分析檢測(cè)方法也被建立［42-46］。近年來(lái)，新型納米材料的出現(xiàn)也為基于適體識(shí)別的蛋白質(zhì)分析檢測(cè)方法提供了新的思路。Li等［47］應(yīng)用銀納米簇建立了凝血酶的適體識(shí)別分析檢測(cè)方法，檢測(cè)限為5 nmol／L。Liu等［48］構(gòu)建了基于石墨烯的分析檢測(cè)平臺(tái)，采用適體作為識(shí)別元素，不僅可以檢測(cè)蛋白質(zhì)，還可以檢測(cè)小分子和DNA片段。為了不斷提高蛋白質(zhì)的檢測(cè)靈敏度，DNA擴(kuò)增技術(shù)被引用到了基于適體識(shí)別的分析檢測(cè)方法之中。Zhang等［49］建立了基于適體識(shí)別、鏈取代擴(kuò)增和指數(shù)擴(kuò)增的血小板生長(zhǎng)因子的分析檢測(cè)方法，檢測(cè)限低至0.9 pmol／L。Wang等［50］建立了血小板生長(zhǎng)因子的支鏈滾換擴(kuò)增的檢測(cè)方法，檢測(cè)限低至1.6 fmol／L。

2.6 生物毒素檢測(cè)

適體還在生物毒素的分析檢測(cè)中得到應(yīng)用。Gruz-Aguado等篩選得到赭曲霉素A的適體并初步應(yīng)用于其分析檢測(cè)［51］。隨后，熒光、比色、電化學(xué)的和酶聯(lián)免疫的適體分析檢測(cè)赭曲霉素方法也都被建立起來(lái)［52-55］，檢測(cè)限最低可達(dá)0.07 ng／mL。黃曲霉素和微囊藻毒素的適體分析檢測(cè)方法被建立并應(yīng)用于樣品檢測(cè)［56-57］。

3 結(jié)論

經(jīng)過(guò)20多年的發(fā)展，適體篩選技術(shù)得到不斷改進(jìn)和完善，目標(biāo)物范圍不斷拓展。適體作為一種理想的識(shí)別分子，在分析檢測(cè)方面得到了快速發(fā)展。但適體技術(shù)在分析檢測(cè)方面仍然存著一定問(wèn)題和局限性，例如檢測(cè)靈敏度和分析效率有待提高。近年來(lái)，新型納米材料，例如納米金、碳納米管和石墨烯等，不斷與基于適體識(shí)別的分析檢測(cè)方法相結(jié)合，使這些方法得以改善。另外，適體的本質(zhì)是核酸，這使適體能夠很好地與核酸擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，這對(duì)基于適體識(shí)別的分析檢測(cè)方法靈敏度的提高有重要意義。隨著篩選技術(shù)的發(fā)展、新型適體的研究和制備、適體與新型納米材料以及核酸擴(kuò)增技術(shù)的結(jié)合，適體必能在分析檢測(cè)以及更多的領(lǐng)域展現(xiàn)更高的活力和應(yīng)用價(jià)值。

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