厚華艷，梁 武，2，呂茂杰，楊保收＊

（1.天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司瑞普生物研究院，天津 300308；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100094）

豬傳染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia，PCP）是由胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacilluspleuropneumoniae，App）引起的高度傳染性、致死性的呼吸道疾病。該病的主要病變特征為肺部出血、壞死和纖維素性滲出，呈急性和慢性臨床特征，各年齡段豬只均可感染，感染且未死亡豬只呈生長(zhǎng)緩慢或無癥狀帶菌，成為主要傳染源，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，以莢膜多糖的組成和結(jié)構(gòu)為依據(jù)已發(fā)現(xiàn)有15個(gè)App血清型，其各個(gè)血清型的莢膜多糖都有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)組成，在免疫學(xué)上不同于其他型。根據(jù)App的生長(zhǎng)是否需要NAD因子（煙酰胺腺嘌呤二核甘酸）將App分為生物Ⅰ型和生物Ⅱ型2個(gè)生物型，生物Ⅰ型即為依賴外源NAD因子才能生長(zhǎng)，菌株毒力強(qiáng)，生物Ⅱ型生長(zhǎng)過程中不需要NAD因子，菌株毒力弱。以莢膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）的抗原性為依據(jù)可將生物Ⅰ型App分為13個(gè)血清型（1～12，15），其中5型分為5a和5b兩個(gè)亞型，將生物Ⅱ型App分為兩個(gè)血清型（13，14）。每個(gè)血清型毒力不同但均可引發(fā)疾病。PCP的致病因子是其在宿主體內(nèi)定殖、持續(xù)感染及引起呼吸道及肺部損傷相關(guān)的毒力因子，主要有外毒素、脂多糖、莢膜多糖、外膜蛋白、轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白、蛋白酶和菌毛等，其中外毒素是App引起宿主肺部損傷最重要的毒力因子［1］。

App對(duì)頭孢噻呋、氟苯尼考、地米考星等抗菌藥比較敏感［2］，但長(zhǎng)期使用抗菌藥極易造成抗藥性及肉制品的藥物殘留，因此疫苗接種成為預(yù)防和控制本病行之有效的措施。全菌體滅活苗是預(yù)防PCP的“第一代疫苗”，是豬傳染性胸膜肺炎的傳統(tǒng)疫苗，它的優(yōu)點(diǎn)是安全、不存在散毒和造成新疫源的危險(xiǎn)，不會(huì)返祖返強(qiáng)，便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸，但是其保護(hù)力有限。滅活疫苗作為一種“死”苗，在滅活過程中某些抗原的免疫原性遭到破壞，最終影響其免疫效果，菌影疫苗也是一種“死”苗，實(shí)際是細(xì)菌的空殼，它是利用噬菌體ΦX174的E基因在革蘭陰性菌中表達(dá)后，在菌體上形成一個(gè)通道，使細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)及DNA都流失到體外，最終引起細(xì)菌的裂解失活而制備的一種疫苗，該疫苗菌體衣殼部分完整，具備良好的免疫原性，但其同滅活疫苗一樣缺乏分泌的外毒素，因此其交叉保護(hù)力有限［3］。弱毒活疫苗可提供針對(duì)多種血清型的交叉保護(hù)力，免疫效果強(qiáng)于滅活疫苗，但是弱毒株遺傳背景不明確，在基因上沒有被限定，在應(yīng)用中存在著毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)。

隨著App毒力因子致病性及免疫原性研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)App的某些毒力因子，尤其是生長(zhǎng)過程中分泌到外界的Apx毒素在免疫保護(hù)中發(fā)揮重要作用。因此毒力因子相關(guān)的亞單位疫苗的研究開始引起人們的重視。本文主要針對(duì)豬傳染性胸膜肺炎亞單位疫苗的候選抗原、抗原制備、重組亞單位疫苗等方面進(jìn)行綜述。

1 常規(guī)亞單位疫苗

1.1 菌體表面結(jié)構(gòu)

莢膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、外膜蛋白（outer membrane protein，OMP）及脂蛋白等菌體表面結(jié)構(gòu)是最初經(jīng)鑒定具有免疫原性的物質(zhì)［4］。但是，CPS、LPS及OMP有很高的異源性，免疫動(dòng)物不能對(duì)異源的血清型產(chǎn)生保護(hù)。脂蛋白有很高的免疫原性和免疫保護(hù)性，使用弱的去污劑處理可以促使菌體外膜釋放具免疫原性的脂蛋白，這種細(xì)胞釋放的上清物質(zhì)（cell-free supernatant，CFS）可以用于制備非重組亞單位疫苗［5］。但是評(píng)價(jià)OMP和脂蛋白產(chǎn)生的免疫保護(hù)性僅限于康復(fù)期血清的免疫印跡試驗(yàn)，而對(duì)于在動(dòng)物體內(nèi)的免疫保護(hù)性還存在很多爭(zhēng)議。比如，Van Den Bosch H 等［6］發(fā)現(xiàn)在免疫豬體內(nèi)與免疫血清具有反應(yīng)性的PalA對(duì)PCP沒有免疫保護(hù)性；Neil J O等［7］發(fā)現(xiàn)高度保守并具免疫原性的外膜蛋白comL、lolB、lppC、ompA不能對(duì)PCP產(chǎn)生免疫保護(hù)作用。

Ⅳ型菌毛在App其致病過程中發(fā)揮重要作用，ApfA蛋白是其主要亞單位蛋白，且其在App血清型中有很高同源性。Lenka S等［8］、Zhou Y 等［9］均認(rèn)為ApfA蛋白有很高免疫原性可作為App亞單位疫苗的候選抗原。

1.2 鐵攝取系統(tǒng)

App的鐵攝取系統(tǒng)包括轉(zhuǎn)鐵蛋白、血紅蛋白、鐵絡(luò)環(huán)肽和氧肟酸鹽鐵載體等，鐵攝取相關(guān)蛋白具有免疫保護(hù)性可作為亞單位疫苗的候選抗原。60、62、65ku的轉(zhuǎn)鐵蛋白B存在于所有App血清型中，60 ku的Tbp免疫豬后僅對(duì)同源的血清型產(chǎn)生有限的保護(hù)性。鐵絡(luò)環(huán)肽和血紅蛋白受體FhuA和HgbA在所有的App血清型中都很保守，豬只感染試驗(yàn)顯示血紅蛋白受體HgbA是很重要的毒力因子可以做為亞單位疫苗的候選抗原［10］。TonB2周質(zhì)蛋白在細(xì)胞質(zhì)膜到外膜受體質(zhì)子運(yùn)輸過程中發(fā)揮作用，Liu J等［11］發(fā)現(xiàn)TonB2是App的重要抗原并能產(chǎn)生有效保護(hù)作用。

1.3 外毒素

外毒素（Actinobacilluspleuropneumoniae-RTX-toxin，Apx）是由多種革蘭陰性細(xì)菌產(chǎn)生的一種外毒素，該毒素含有富含甘氨酸和天冬氨酸的調(diào)控元，在C端有9次～40次的重復(fù)，此調(diào)控元可以結(jié)合鈣離子，是毒素生物活性的關(guān)鍵。Apx毒素是App的主要毒力因子，屬于分泌型RTX家族成員，并具有很強(qiáng)的免疫原性和免疫保護(hù)性。Apx毒素中和抗體保護(hù)中性粒白細(xì)胞免于被殺并使其有效清除細(xì)菌。免疫豬通過氣霧法攻毒App 1型可以產(chǎn)生IgG1亞類抗溶血素抗體。提純ApxⅠ和ApxⅡ制備的溶血素疫苗在豬體內(nèi)可以對(duì)App 1型產(chǎn)生很好的保護(hù)性［12］。Apx毒素和其他細(xì)菌的復(fù)合物組合的免疫試驗(yàn)顯示，Apx毒素在抵抗細(xì)菌侵襲中是不可或缺的。目前，幾乎所有商業(yè)化的App亞單位疫苗比如“二代疫苗”都包含Apx毒素。

1.4 其他毒力因子

App有很多毒力因子只能在體內(nèi)表達(dá)（比如ApxⅣ），但有研究數(shù)據(jù)顯示支氣管肺泡液可上調(diào)ApxⅣ基因的表達(dá)，Buettner使用PPLO培養(yǎng)基在鐵限制條件誘導(dǎo)ApxⅣ基因的表達(dá)，并首次在體外培養(yǎng)的 App的 DIVA（differentiating infected from vaccined animals，DIVA）亞單位疫苗中鑒定到 ApxⅣ蛋白［13］。目前有效亞單位疫苗抗原的發(fā)現(xiàn)還是很有限的，還需要更有力的基因工程及遺傳學(xué)方法。

盡管App有很多毒力因子及具有免疫原性的蛋白，但單一抗原組分的亞單位疫苗只能提供部分保護(hù)，且交叉保護(hù)力弱。在PCP亞單位疫苗研究中，多以Apx毒素為主要成分，多種抗原組合的亞單位疫苗為主，其免疫效果明顯高于單一組分的亞單位疫苗。Van Den Bosch H 等［6］將3種毒素和轉(zhuǎn)鐵蛋白為組分的亞單位疫苗與滅活疫苗的免疫效果相比較，發(fā)現(xiàn)前者免疫組的發(fā)病率低、肺部病變顯著減少。Porcilis App是一種包含 ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和42ku OMP的一種亞單位疫苗，可誘導(dǎo)產(chǎn)生交叉保護(hù)，并產(chǎn)生高水平的相應(yīng)抗體［12］。在法國(guó)、意大利、荷蘭、瑞士、澳大利亞等國(guó)家進(jìn)行的田間試驗(yàn)進(jìn)一步證明，該疫苗可以極其顯著地降低死亡率和臨床癥狀，幾乎無肺部損傷。

2 PCP亞單位疫苗抗原成分制備

2.1 CPS、LPS、OMP制備

Willson P J等［14］利用鹽析法提取1型 App的細(xì)胞碎片，包括多糖、LPS和OMP蛋白等物質(zhì)與相應(yīng)佐劑混合制成疫苗，免疫豬可獲得免疫保護(hù)性。關(guān)于PCP亞單位疫苗抗原成分CPS、LPS及OMP的制備方法，劉霞等［15］用十六烷基溴化銨-無水乙醇法制備App的CPS，用酚-水法制備LPS，用N-十二烷?；彼岱ㄌ崛⊥饽さ鞍祝瑑?yōu)化其免疫劑量后免疫小鼠獲得較強(qiáng)的免疫保護(hù)作用。上述試驗(yàn)方法操作簡(jiǎn)單、快速，對(duì)試劑、儀器設(shè)備要求低，但提取的產(chǎn)物濃度較低，不適用于大量生產(chǎn)。

2.2 Apx毒素表達(dá)純化

溶血毒素（Apx）是決定App致病性強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素，App能產(chǎn)生四種溶血毒素，即ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ。ApxⅠ、ApxⅡ具有溶血活性和細(xì)胞毒性，而ApxⅢ只有細(xì)胞毒性，ApxⅣ是新發(fā)現(xiàn)的一種Apx毒素，具有弱溶血活性，且體外不能分泌。Yoshihisa等采用親和層析法提純App溶血毒素（包括ApxⅠ和ApxⅡ），具有很高活性。但是Bohach認(rèn)為大腸埃希菌α-溶血素屬于RTX家族蛋白且與LPS形成大分子復(fù)合物，ApxⅠ及ApxⅡ均屬于RTX家族成員，且 ApxⅠ（105ku）和 ApxⅡ（103ku）不能通過300ku的超濾膜，充分證明了ApxⅠ和ApxⅡ與LPS形成大分子復(fù)合物，因此提純的ApxⅠ和ApxⅡ免疫豬只后觀察的癥狀均為溶血毒素與LPS復(fù)合物產(chǎn)生的，而很小劑量的LPS就會(huì)引起豬只的多種臨床癥狀，所以盡可能的分離溶血毒素-LPS復(fù)合物才會(huì)獲得較安全的溶血毒素亞單位疫苗［16］。

研究表明，App在體內(nèi)和體外不同條件下如溫度、鐵濃度、pH、滲透壓、NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）濃度等所表達(dá)的毒力因子是不同的。培養(yǎng)液中NAD濃度對(duì)生物Ⅰ型App的生長(zhǎng)有較大影響，低濃度NAD的培養(yǎng)條件能夠使App分泌更多的毒素［17］，培養(yǎng)液中游離的Ca2＋可影響ApxⅠ的分泌，但不影響其活性，ApxⅡ、ApxⅢ的分泌不需要Ca2＋，但其活性卻需Ca2＋作為輔助因子，因此為提高ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ毒素分泌及活性，馬艷芳在培養(yǎng)App時(shí)在血清型3、7、10的LB培養(yǎng)液中加入0.02%NAD，在10型App擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)在LB培養(yǎng)液中加入終濃度為1mmol／L的CaCl2，在提取、純化ApxⅡ、ApxⅢ時(shí)，在Tris-HCl緩沖液中加入終濃度為1mmol／L的CaCl2。馬艷芳對(duì)毒素純化工藝流程進(jìn)行優(yōu)化，即將Sephadex D-200凝膠過濾層析、超濾管超濾同時(shí)進(jìn)行，保證毒素活性不會(huì)降低，并提高了樣品的純度和產(chǎn)量。此方法簡(jiǎn)單快速，對(duì)設(shè)備要求低，純化結(jié)果能夠滿足實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步試驗(yàn)研究的需要［18］。

3 重組亞單位疫苗

由于Apx毒素的良好免疫原性，人們使用基因工程方法對(duì)App的毒力因子進(jìn)行了重組表達(dá)，并對(duì)其進(jìn)行免疫原性研究。Seah J N 等［19］將 ApxⅠA基因的N端部分編碼區(qū)（40aa～380aa）在體外表達(dá)后免疫試驗(yàn)動(dòng)物，免疫動(dòng)物能抵抗至少3種血清型App的攻擊。嚴(yán)克霞等［20］體外表達(dá)App的ApxⅡ的結(jié)構(gòu)基因apxⅡA，其復(fù)性的重組毒素Ⅱ具有良好的免疫原性。王春來等［21］體外重組表達(dá)了豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的5種主要毒力因子rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢ、rApxⅣ和rOMP重組蛋白，以不同組分分組免疫小鼠，結(jié)果表明，rApxⅣ能夠產(chǎn)生高滴度抗體并能產(chǎn)生很強(qiáng)的保護(hù)力。邵美麗等［22］體外重組表達(dá)了豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的6種主要毒力因子rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢ、rApxⅣ、rApfa和rOMP，以不同組分組合免疫小鼠，rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢ和rOMP組合免疫組可對(duì)小鼠產(chǎn)生高效的交叉保護(hù)力，增加免疫次數(shù)其抗體水平也會(huì)增加，而rApfa并沒有提高免疫保護(hù)力，可能是因?yàn)閞Apfa的加入使rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢ和rOMP的抗體滴度下降所致。Shin M K等［23］將霍亂毒素B與ApxⅡA融合表達(dá)于一種植物草料種子中，飼喂后小鼠誘導(dǎo)其產(chǎn)生了針對(duì)Apx特異的免疫反應(yīng)。

陳夏冰等［24］依據(jù)基因組雜交和轉(zhuǎn)錄譜分析重組表達(dá)了表面蛋白APJL-0126、HbnA和OmpW，免疫小鼠，可誘導(dǎo)產(chǎn)生高低度抗體，可作為PCP亞單位疫苗的添加組分，以提高免疫保護(hù)效力。Lee S H等［25］將App的ApxⅢ的N末端與豬肺炎支原體P97黏附素的R1和R2重復(fù)片段融合表達(dá)，稱為蛋白Ap97，制成疫苗免疫動(dòng)物獲得很好的免疫效果。Seo K W 等［26］表達(dá)1型App的ApxⅡA的439-801的氨基酸片段，制成疫苗鼻內(nèi)免疫小鼠，產(chǎn)生全身性的黏膜免疫反應(yīng)，并可對(duì)5型App分泌的ApxⅠ、ApxⅡ產(chǎn)生交叉免疫保護(hù)。

大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)是目前掌握最為成熟的的表達(dá)系統(tǒng)，其細(xì)胞繁殖快、產(chǎn)量高、IPTG誘導(dǎo)表達(dá)相對(duì)簡(jiǎn)單，成為重組蛋白最常用的表達(dá)系統(tǒng)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者多采用pGEX-6p-1或pET表達(dá)載體表達(dá)Apx毒素及OMP蛋白，OMP蛋白以可溶性形式表達(dá)；Apx毒素以包涵體形式表達(dá)，變性復(fù)性后進(jìn)行純化。大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)在于遺傳背景清楚、繁殖快、成本低、表達(dá)量高、表達(dá)產(chǎn)物容易純化、穩(wěn)定性好、抗污染能力強(qiáng)及適用范圍廣。但是原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白翻譯后缺乏加工機(jī)制，如二硫鍵的形成、蛋白糖基化和正確折疊，得到具有生物活性的蛋白幾率較小。

4 討論

亞單位疫苗最大優(yōu)點(diǎn)是使用時(shí)不必檢測(cè)患豬血清型，可以在全世界通用。Apx毒素是App的主要保護(hù)性抗原，與免疫保護(hù)作用密切相關(guān)，是疫苗的重要組分，但單一抗原組分的亞單位疫苗只能提供部分保護(hù)，且交叉免疫保護(hù)效果差。在PCP亞單位疫苗研究中，人們將Apx毒素做為多抗原亞單位疫苗的主成分，研究含多種抗原的亞單位疫苗的最適組合及發(fā)現(xiàn)App亞單位疫苗候選抗原將是我們的研究重點(diǎn)之一。常規(guī)亞單位疫苗抗原均是天然提取的App毒力因子，其提取純化方法均為傳統(tǒng)的物理、化學(xué)方法，成本高、價(jià)格昂貴，提取產(chǎn)物濃度較低，且App在體內(nèi)和體外不同條件下所表達(dá)毒力因子是不同的。因此如何篩選合適的培養(yǎng)條件以利于毒力因子的高效表達(dá)，并簡(jiǎn)化生產(chǎn)過程，獲取大量抗原，將成為亞單位疫苗努力的方向。基因工程方法獲取抗原制備重組亞單位疫苗，生產(chǎn)過程簡(jiǎn)單，成本較低，產(chǎn)物純度濃度均較高，且利于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，為亞單位疫苗抗原的獲取提供了新思路。

［1］Chiers K，De Waele T，Pasmans F，et al.Virulence factors ofActinobacilluspleuropneumoniaeinvolved in colonization，persistence and induction of lesions in its porcine host［J］.Vet Res，2010，41（5）：65-80.

［2］王曉赟，李孝文，孫 武，等.氟苯尼考雙混懸型乳劑對(duì)人工感染豬胸膜肺炎的臨床療效試驗(yàn)［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33（5）：128-131.

［3］吳憶春.動(dòng)物用菌影疫苗研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（9）：95-98.

［4］Ramjeet M，Deslandes V，GouréJ，et al.Actinobacilluspleuropneumoniaevaccines：from bacterins to new insights into vaccination strategies［J］.Anim Health Res Rev，2008，9（1）：25-46.

［5］Goethe R，Gonzales O F，Lindner T，et al.A novel strategy for protectiveActinobacilluspleuropneumoniaesubunit vaccines：detergent extraction of cultures induced by iron restriction［J］.Vaccine，2000，19：966-975.

［6］Van Den Bosch H，F(xiàn)rey J.Interference of outer membrane protein PalA with protective immunity againstActinobacillus pleuropneumoniaeinfections in vaccinated pigs［J］.Vaccine，2003，21：3601-3607.

［7］Oldfield N J，Donovan E A，Worrall K E，et al.Identification and characterization of novel antigenic vaccine candidates ofActinobacilluspleuropneumoniae［J］.Vaccine，2008，26（16）：1942-1954.

［8］Sadilkova L，Nepereny J，Vrzal V，et al.TypeⅣfimbrial subunit protein ApfA contributes to protection against porcine pleuropneumonia［J］.Vet Res，2012，43（1）：1-12.

［9］Zhou Y，Li L，Chen Z，et al.Adhesion protein ApfA ofActinobacilluspleuropneumoniaeis required for pathogenesis and is apotential target for vaccine development［J］.Clin Vac Immunol，2013，20（2）：287-294.

［10］Shakarji L，Mikael L G，Srikumar R，et al.Fhua and HgbA，outer membrane proteins ofActinobacilluspleuropneumoniae：their role as virulence determinants［J］.Can J Microbiol，2006，52：391-396.

［11］Liu J，Chen Y，Yuan F，et al.Cloning，expression，and characterization of TonB2fromActinobacilluspleuropneumoniaeand potential use as an antigenic vaccine candidate and diagnostic marker［J］.Can J Vet Res，2011，75（3）：183-190.

［12］Tumamao J Q，Bowles R E，Van Den Bosch H，et al.Comparison of the efficacy of a subunit and a live streptomycin de pendent porcine pleuropneumonia vaccine［J］.Austra Vet J，2004，82：370-374.

［13］Buettner F F R，Konze S A，Maas X，et al.Proteomic and immunoproteomic characterization of a DIVA subunit vaccine againstActinobacilluspleuropneumoniae［J］.Proteome Sci，2011，9：23.

［14］Willson P J，Rossi-Campos A，Potter A A.Tissue reaction and immunity in swine immunized withActinobacilluspleuropneumoniaevaccines［J］.Can J Vet Res，1995，59：299-305.

［15］劉 霞.豬胸膜肺炎放線桿菌亞單位成分制備、免疫原型研究及型特異性見解ELISA方法的建立［D］.山東泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

［16］Haga Y，Ogino S，Ohashi S，et al.Protective efficacy of an affinity-purified hemolysin vaccine against experimental swine pleuropneumonia［J］.J Vet Med Sci，1997，59（2）：115-120.

［17］王 輝，刁有祥，孟凡磊.不同NAD含量條件下培養(yǎng)的豬胸膜肺炎放線桿菌對(duì)小白鼠致病性和免疫保護(hù)性的影響［J］.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，36（4）：400-404.

［18］馬艷芳.豬胸膜肺炎放線桿菌溶血毒素ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ的提取純化及對(duì)小鼠致病性和免疫原性研究［D］.山東泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

［19］Seah J N，F(xiàn)rey J，Kwang J.The N-terminal domain of RTX toxin ApxI ofActinobacilluspleuropneumoniaeelicits protective immunity in mice［J］.Infect Immun，2002，70（11）：6464-6467.

［20］嚴(yán)克霞，劉建杰，吳 斌，等.豬胸膜肺炎放線桿菌毒素Ⅱ基因的克隆、表達(dá)及其免疫原性［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2006，14（4）：493-497.

［21］Wang C，Wang Y，Shao M，et al.Positive role for rApxIVN in the immune protection of pigs against infection byActinobacillus pleuropneumoniae［J］.Vaccine，2009，27（42）：5816-5821.

［22］Shao Meili，Wang Yong，Wang Chunlai，et al.Evaluation of multicomponent recombinant vaccines againstActinobacillus pleuropneumoniaein mice［J］.Acta Veterinaria Scandinavica，2010，52：52.

［23］Shin M K，Jung M H，Lee W J，et al.Generation of transgenic corn-derivedActinobacilluspleuropneumoniaeApxIIA fused with the cholera toxin B subunit as a vaccine candidate［J］.J Vet Sci，2011，12（4）：401-403.

［24］陳夏冰.胸膜肺炎放線桿菌保守表面蛋白的鑒定與免疫原性研究［D］.湖北武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

［25］Lee S H，Lee S，Chae C，et al.A recombinant chimera comprising the R1and R2repeat regions ofM.hyopneumoniaeP97and the N-terminal region ofA.pleuropneumoniaeApxⅢ elicits immune responses［J］.BMC Vet Res，2014，10（1）：43.

［26］Seo K W，Kim S H，Park J，et al.Nasal immunization with major epitope-containing ApxIIA toxin fragment induces protective immunity against challenge infection withActinobacilluspleuropneumoniaein a murine model［J］.Vet Immunol Immunopathol，2013，151（1）：102-112.