鄒 慧，李丹丹，陳 靜，勞雪芬，曹 錚，尚秋辰，許小琴*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009)

富硒女貞子對(duì)熱應(yīng)激乳腺上皮細(xì)胞增殖、凋亡及抗氧化功能的影響

鄒 慧1，2，李丹丹1，2，陳 靜1，2，勞雪芬1，2，曹 錚1，2，尚秋辰1，2，許小琴1，2*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009)

為闡明富硒女貞子及其主要成分對(duì)高溫體外培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞增殖、凋亡及抗氧化功能的影響，以42 ℃作為熱應(yīng)激溫度，37 ℃作為對(duì)照溫度，于42 ℃培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞分別添加不同質(zhì)量濃度的富硒女貞子水煎液、齊墩果酸、蛋白質(zhì)，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD活性。結(jié)果表明，各質(zhì)量濃度的富硒女貞子水煎液、齊墩果酸及蛋白質(zhì)均能顯著提高熱應(yīng)激狀態(tài)下乳腺上皮細(xì)胞的增殖活性(P<0.05)、顯著降低細(xì)胞的凋亡率(P<0.05)、顯著提高細(xì)胞培養(yǎng)上清中SOD的活性(P<0.05)，且富硒女貞子組明顯優(yōu)于普通女貞子組。結(jié)果提示，富硒女貞子水煎液、齊墩果酸及蛋白質(zhì)對(duì)熱應(yīng)激引起的乳腺細(xì)胞增殖活性降低及細(xì)胞凋亡有明顯的改善作用，并能提高熱應(yīng)激狀態(tài)下乳腺細(xì)胞的抗氧化功能。

熱應(yīng)激；硒；女貞子；凋亡；乳腺上皮細(xì)胞

熱應(yīng)激是指機(jī)體應(yīng)對(duì)環(huán)境高溫所產(chǎn)生的非特異性應(yīng)答反應(yīng)[1]，近年來(lái)對(duì)熱應(yīng)激的研究已達(dá)到細(xì)胞水平。不少研究發(fā)現(xiàn)[2-3]，高溫會(huì)導(dǎo)致乳腺上皮細(xì)胞增殖活性降低且誘導(dǎo)其凋亡。補(bǔ)中益氣類(lèi)中草藥大多具有抗氧化、緩解機(jī)體熱應(yīng)激的功效，馬得瑩等將女貞子作為飼料添加劑有效改善了熱應(yīng)激下蛋雞的生產(chǎn)性能及抗氧化功能，減輕熱應(yīng)激對(duì)蛋雞的危害[4]。但目前將中草藥用于細(xì)胞熱應(yīng)激方面的報(bào)道很少，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)體外培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行高溫處理，并添加富硒女貞子及其主要成分，從細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡方面來(lái)探索富硒女貞子對(duì)乳腺細(xì)胞熱應(yīng)激的干預(yù)作用，為闡明富硒女貞子抗熱應(yīng)激的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要細(xì)胞與試劑

MCF-7人乳腺上皮細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；富硒女貞子(硒含量1.88 μg·g-1)、對(duì)照藥女貞子由本實(shí)驗(yàn)室保存提供[5-6]；改良型RPMI-1640培養(yǎng)基(HyClone)；胎牛血清(銀香國(guó)際)；胰蛋白酶-EDTA消化液(Solarbio)；四唑藍(lán)(MTT，Sigma公司)，臨用前配成5 mg·mL-1，漩渦混合儀混勻，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，4 ℃避光保存；二甲基亞砜(DMSO，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；FITC Annexin V 凋亡試劑盒(BD公司)。

1.2 主要儀器

核酸蛋白濃度檢測(cè)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Revco公司)；倒置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠產(chǎn)品)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠，SWcg1F)；MP200A分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；XW-80微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)；FACS Aria 流式細(xì)胞儀。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藥物制備 精確稱取女貞子粉末，提取富硒女貞子蛋白質(zhì)[7]、齊墩果酸[8]，臨用前配制好工作濃度，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌。富硒女貞子水煎液中硒含量為1.77 μg·g-1(普通女貞子水煎液硒含量為0.225 μg·g-1)，富硒女貞子齊墩果酸中含硒量為4.9 ng·g-1(普通女貞子中齊墩果酸的含硒量為0.3 ng·g-1)，富硒女貞子中蛋白質(zhì)的含硒量為0.681 μg·g-1(普通女貞子中蛋白質(zhì)的含硒量為0.014 μg·g-1)[9]。

1.3.2 乳腺上皮細(xì)胞活率測(cè)定 將乳腺上皮細(xì)胞以1.5 ×105·mL-1的量接種于96孔板中，每孔100 μL，37 ℃ 培養(yǎng)12 h，觀察每孔細(xì)胞貼壁80%～90%后分組試驗(yàn)。設(shè)3大組：37 ℃對(duì)照組、42 ℃熱應(yīng)激組、42 ℃給藥組，每組4個(gè)重復(fù)，其中給藥組分為富硒女貞子水煎液、蛋白質(zhì)、齊墩果酸組以及普通女貞子水煎液、蛋白質(zhì)、齊墩果酸組。給藥組換成含不同藥物的維持液(胎牛血清濃度為2%)，37 ℃對(duì)照組和熱應(yīng)激組換成維持液，對(duì)照組37 ℃培養(yǎng)，熱應(yīng)激組和給藥組置于42 ℃培養(yǎng)1、3、6、8 h后采用MTT法檢測(cè)各時(shí)間段內(nèi)細(xì)胞的存活率。

1.3.3 SOD活性的測(cè)定 將乳腺上皮細(xì)胞以1×105·mL-1的量接種于6孔板中，每孔1 mL，37 ℃ 培養(yǎng)24 h，觀察每孔細(xì)胞貼壁80%～90%分組試驗(yàn)，設(shè)3大組：37 ℃對(duì)照組、42 ℃熱應(yīng)激組、42 ℃給藥組(同上)，每組6個(gè)重復(fù)。給藥組換成含不同藥物的維持液，37 ℃對(duì)照組和熱應(yīng)激組換成維持液，對(duì)照組37 ℃培養(yǎng)，熱應(yīng)激組和給藥組置于42 ℃培養(yǎng)3 h后放回37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)12 h，然后收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，采用黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定SOD活性。

1.3.4 細(xì)胞凋亡率的測(cè)定 將乳腺上皮細(xì)胞以4×105·孔-1的量接種于6孔板中，每孔1 mL，37 ℃ 培養(yǎng)12 h，觀察每孔細(xì)胞貼壁80%～90%分組試驗(yàn)，設(shè)3大組：37 ℃對(duì)照組、42 ℃熱應(yīng)激對(duì)照組、42 ℃給藥組(同上)，每組6個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)給藥組換成含不同藥物的維持液，對(duì)照組和熱應(yīng)激對(duì)照組換成維持液，對(duì)照組37 ℃培養(yǎng)，熱應(yīng)激組和給藥組置于42 ℃培養(yǎng)3 h后采用Annexin V-FICT/PI試劑盒及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 富硒女貞子對(duì)熱應(yīng)激乳腺上皮細(xì)胞增殖活性的影響

采用改良的MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，結(jié)果表明：42 ℃的熱應(yīng)激組細(xì)胞在培養(yǎng)1、3、6、8h后增殖活性均顯著低于37 ℃培養(yǎng)的常溫對(duì)照組(P<0.05)；與42 ℃熱應(yīng)激組相比，各濃度的富硒女貞子水煎液組(圖1)、齊墩果酸組(圖2)、蛋白質(zhì)組(圖3)均能顯著提高細(xì)胞的增殖活性(P<0.05)，且富硒組明顯優(yōu)于普通女貞子組，其中富硒女貞子水煎液的作用效果為極顯著(P<0.01，圖中未標(biāo)注)，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到8mg·mL-1時(shí)作用效果最佳，在熱應(yīng)激1、3、6、8h后較熱應(yīng)激組細(xì)胞增值率提高分別達(dá)80.9%、35%、40%、34.7%。

不同字母代表有顯著差異(P<0.05)，下同The data with different superscript letters in column differ significantly (P<0.05)，the same as below圖1 富硒女貞子水煎液對(duì)熱應(yīng)激乳腺細(xì)胞增殖活性的影響Fig.1 The effect of water exact of se-LLF on mammary epithelial cells after heat treatment

圖2 富硒女貞子齊墩果酸對(duì)熱應(yīng)激乳腺細(xì)胞增殖活性的影響Fig.2 The effect of oleanolic acid exact of se-LLF on mammary epithelial cells after heat treatment

2.2 富硒女貞子對(duì)熱應(yīng)激乳腺上皮細(xì)胞SOD活性的影響

本試驗(yàn)采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活力，結(jié)果如表1所示：各質(zhì)量濃度水平的富硒女貞子水煎液、齊墩果酸、蛋白質(zhì)均顯著提高42 ℃熱應(yīng)激下乳腺上皮細(xì)胞SOD的活性(P<0.05)，且水煎液、齊墩果酸、蛋白質(zhì)濃度分別達(dá)到8 mg·mL-1、10 μg·mL-1及800 μg·mL-1時(shí)作用效果最佳，與熱應(yīng)激組差異極顯著(P<0.01)。此外，8、10 mg·mL-1的富硒女貞子水煎液提高SOD活性的作用效果極顯著優(yōu)于普通女貞子(P<0.01)，各濃度富硒女貞子蛋白質(zhì)和齊墩果酸提高SOD活性的作用效果優(yōu)于普通女貞子，但差異不顯著(P>0.05)。

圖3 富硒女貞子蛋白質(zhì)對(duì)熱應(yīng)激乳腺細(xì)胞增殖活性的影響Fig.3 The effect of protein exact of se-LLF on mammary epithelial cells after heat treatment

表1 富硒女貞子對(duì)熱應(yīng)激乳腺上皮細(xì)胞SOD活性的影響

Table 1 The effect of se-LLF on antioxidant activity of mammary epithelial cells after heat treatment

U·mL-1

同列肩注小寫(xiě)字母表示不同組別與對(duì)照組的比較；同列肩注大寫(xiě)字母表示富硒女貞子與女貞子的比較。同列肩注相同字母差異不顯著(P>0.05)，同列肩注相鄰字母差異顯著(P<0.05)，同列肩注相間字母差異極顯著(P<0.01)；其中水煎液低、中、高劑量分別為5、8、10 mg·mL-1，齊墩果酸為5、10、20 μg·mL-1，蛋白質(zhì)為400、800、1 000 μg·mL-1(下同)

The same column shows a comparison of the shoulder note uppercase different groups and the control group；note the shoulder with lowercase letters column comparison with SeLigustrumlucidum's.Note the shoulder with the same letter column is no significant difference (P> 0.05)，note adjacent letters column shoulder with significant differences (P<0.05)，note the shoulder with white letters out significant difference (P<0.01).The low，medium and high concentration of water extract of se-LLF are 5，8 and 10 mg·mL-1.The low，medium and high concentration of oleanolic extract of se-LLF are 5，10 and 20 μg·mL-1.The low，medium and high concentration of protein extract of se-LLF are 400，800 and 1 000 μg·mL-1(The same as below)

2.3 富硒女貞子對(duì)熱應(yīng)激乳腺上皮細(xì)胞凋亡的影響

本試驗(yàn)采用細(xì)胞流式術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果如表2所示，37 ℃培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞狀態(tài)良好，凋亡細(xì)胞僅為細(xì)胞總數(shù)的2.8%，42 ℃熱應(yīng)激3 h細(xì)胞凋亡率極顯著上升達(dá)到14%(P<0.01)。與42 ℃熱應(yīng)激組相比，各質(zhì)量濃度水平的富硒女貞子水煎液、齊墩果酸、蛋白質(zhì)均能極顯著降低細(xì)胞凋亡率(P<0.01)，其中8 mg·mL-1的富硒女貞子水煎液、10 μg·mL-1的齊墩果酸以及800 μg·mL-1的蛋白質(zhì)作用效果最佳，降低細(xì)胞凋亡比例分別達(dá)到74%、66%及68%。此外，8 mg·mL-1的富硒女貞子水煎液、5 μg·mL-1的齊墩果酸以及400 μg·mL-1的蛋白質(zhì)降低細(xì)胞凋亡率的作用效果顯著優(yōu)于普通女貞子(P<0.05)，其他質(zhì)量濃度的富硒女貞子水煎液、齊墩果酸和蛋白質(zhì)降低細(xì)胞凋亡率的的作用效果亦優(yōu)于普通女貞子，但差異不顯著(P>0.05)。具體凋亡圖譜見(jiàn)圖4a～t。

(圖4，轉(zhuǎn)下頁(yè))

(Fig.4，continued on the next page)

(接上頁(yè))

(Continued)

a.37 ℃對(duì)照組；b.42 ℃熱應(yīng)激組；c～e.富硒女貞子水煎液組，分別為5、8、10 mg·mL-1；f～h.普通女貞子水煎液組，濃度同富硒女貞子水煎液組；i～k.富硒女貞子齊墩果酸組，分別為5、10、20 μg·mL-1；l～n.普通女貞子齊墩果酸組，質(zhì)量濃度同富硒女貞子齊墩果酸組；o～q.富硒女貞子蛋白質(zhì)組，分別為400、800、1 000 μg·mL-1；r～t.普通女貞子蛋白質(zhì)組，質(zhì)量濃度同富硒女貞子蛋白質(zhì)組a.37 ℃ contrast group；b.42 ℃ heat stress group；c-e.Water extract of se-LLF groups (5，8，10 mg·mL-1)；f-h.Water extract of LLF groups (5，8，10 mg·mL-1)；i-k.Oleanolic extract of se-LLF groups (5，10，20 μg·mL-1)；l-n.Oleanolic extract of LLF groups(5，10，20 μg·mL-1)；o-q.Protein exact of se-LLF groups (400，800，1 000 μg·mL-1)；r-t.Protein exact of LLF groups (400，800，1 000 μg·mL-1)圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組乳腺上皮細(xì)胞的凋亡圖譜Fig.4 Apoptosis chart of cultured mammary epithelial cells detected of different group by flow cytometry

表2 富硒女貞子對(duì)熱應(yīng)激乳腺上皮細(xì)胞凋亡的影響

Table 2 The effect of se-LLF on apoptosis of mammary epithelial cells after heat treatment %

水煎液WaterexactofLLF齊墩果酸Oleanolicacid蛋白質(zhì)Protein富硒Se-enriched普通Ordinary富硒Se-enriched普通Ordinary富硒Se-enriched普通Ordinary低5.50±0.23cA6.10±0.38cdA7.80±0.44dA11.60±0.32dB6.80±0.1dA10.70±0.55dB中3.70±0.18bA5.20±0.52cB4.70±0.67bA5.30±0.19cA4.50±0.72cA5.70±0.89cA42℃高5.10±0.21cA5.40±0.29cA5.70±0.28cA6.30±0.84cA6.30±0.13dA7.00±0.47cA對(duì)照14.00±0.33f37℃2.80±0.15a

3 討 論

3.1 富硒女貞子能提高熱應(yīng)激乳腺上皮細(xì)胞SOD活性

在正常情況下，機(jī)體內(nèi)活性氧(ROS)自由基的產(chǎn)生、利用、清除保持著動(dòng)態(tài)的平衡。當(dāng)機(jī)體處于熱應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，體內(nèi)ROS的量會(huì)相對(duì)升高，超過(guò)機(jī)體的清除能力，引起細(xì)胞DNA氧化損傷。SOD廣泛存在于生物體內(nèi)，能維持機(jī)體中自由基產(chǎn)生和清除動(dòng)態(tài)平衡，是一種重要的抗氧化酶，因此SOD活性能間接地反映機(jī)體清除氧自由基的能力。有報(bào)道稱，女貞子水提物可提高肉仔雞血清和組織中SOD活性[13]，從而提高肉雞的抗氧化功能。硒作為體內(nèi)抗氧化酶系的組分，以直接清除自由基和影響非酶類(lèi)抗氧化劑的代謝等方式在體內(nèi)發(fā)揮重要的抗氧化作用，硒的抗氧化功能是其他生理功能的基礎(chǔ)[14]，研究表明[15-16]，在飼料中添加一定量的硒可以有效地改善熱應(yīng)激狀態(tài)下動(dòng)物的抗氧化性能，并能提高機(jī)體的抵抗力。本研究佐證上述研究結(jié)果，富硒和普通女貞子及其主要成分均能提高熱應(yīng)激乳腺上皮細(xì)胞的抗氧化功能，女貞樹(shù)通過(guò)花果葉面噴施硒肥而收獲的富硒女貞子藥材中硒含量顯著提高，硒和女貞子協(xié)同作用，使得富硒女貞子的效果明顯優(yōu)于普通女貞子。

3.2 富硒女貞子能提高熱應(yīng)激乳腺上皮細(xì)胞增殖活性

本研究中，42 ℃熱應(yīng)激組乳腺上皮細(xì)胞增殖活性始終顯著低于37 ℃對(duì)照組，這表明高溫對(duì)乳腺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)造成嚴(yán)重的損傷，這與多人的研究結(jié)果一致[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)在熱應(yīng)激條件下，細(xì)胞功能產(chǎn)生許多的異常，包括對(duì)蛋白質(zhì)合成的抑制、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的缺失、新陳代謝的改變、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的改變，從而減少了細(xì)胞的增殖[11-12]。在添加富硒女貞子水煎液及其主要成分后，有效緩解了高溫對(duì)乳腺上皮細(xì)胞增殖活性的抑制，其中富硒女貞子水煎液及齊墩果酸促進(jìn)熱應(yīng)激乳腺細(xì)胞增殖效果甚至明顯高于37 ℃常溫對(duì)照組。這表明富硒女貞子能顯著提高熱應(yīng)激對(duì)乳腺上皮細(xì)胞增殖活性的影響，使其恢復(fù)到正常水平，并以8 mg·mL-1的富硒女貞子水煎液的效果最佳，這種作用與提高細(xì)胞SOD活性的趨勢(shì)一致。推測(cè)，富硒女貞子促進(jìn)細(xì)胞在熱應(yīng)激狀態(tài)下的增殖活性可能與其提高細(xì)胞SOD活性有關(guān)，其作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

3.3 富硒女貞子能降低熱應(yīng)激乳腺上皮細(xì)胞凋亡率

高溫誘導(dǎo)體外培養(yǎng)細(xì)胞凋亡已被許多學(xué)者證實(shí)，高溫會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞線粒體損傷，釋放促凋亡因子，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[17-18]。本研究采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果表明高溫顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡，添加富硒女貞子水煎液及其主要成分后，有效降低細(xì)胞凋亡率。有報(bào)道稱，細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平的輕微增高促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，而胞內(nèi)ROS水平的顯著增高則快速觸發(fā)細(xì)胞的凋亡[19]，而SOD活性以及抗ROS活力與細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)[20]。由此推斷，富硒女貞子可能是通過(guò)提高細(xì)胞SOD活性，改善細(xì)胞在熱應(yīng)激狀態(tài)下的抗氧化功能從而降低細(xì)胞的凋亡率。

綜上所述，富硒女貞子水煎液、齊墩果酸及蛋白質(zhì)均能提高熱應(yīng)激狀態(tài)下乳腺細(xì)胞的抗氧化功能，對(duì)熱應(yīng)激引起的乳腺細(xì)胞增殖活性降低及細(xì)胞凋亡有明顯的改善作用。

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(編輯 白永平)

Influence of Se-enrichedLigustrumlucidiumFruit on Proliferation，Apoptosis and Antioxidant Activity of Mammary Epithelial Cells under Heat Stress

ZOU Hui1，2，LI Dan-dan1，2，CHEN Jing1，2，LAO Xue-fen1，2，CAO Zheng1，2，SHANG Qiu-chen1，2，XU Xiao-qin1，2*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China；2.JiangsuCo-innovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses，Yangzhou225009，China)

The experiment was conducted to study the effects of se-enrichedLigustrumlucidiumFruit on proliferation，apoptosis and antioxidant activity of mammary epithelial cells cultured under heat circumstanceinvitro.The heat stress model temperature was set as 42 °C and the temperature 37 °C was set as the control.In the experiment，heat-stressed mammary epithelial cells were cultured with different concentration of water extract，protein and oleanolic acid extract of Se-LLF.The growth and apoptosis rate of cultured mammary epithelial cells were detected by MTT and flow cytometry，respectively，and the content of SOD in the supernatant fluid of cultured mammary epithelial cells was detected by xanthine oxidase.The results showed that the proliferation of mammary epithelial cells cultured under high temperature was significantly promoted in each experimental concentration of water extract，protein and oleanolic acid extract of Se-LLF (P<0.05).The apoptosis rate decreased significantly (P<0.05)，the activity of SOD (P<0.05) was increased significantly，and the results were better than those of the ordinaryLigustrumlucidumgroup.In conclusion，water extract，protein and oleanolic acid extract of Se-LLF can not only improve the proliferation and apoptosis rate of heat-stressed mammary epithelial cells，but also improve their antioxidant capacity.

heat stress；selenium；FructusLigustriLucidi；apoptosis；mammary epithelial cells

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.022

2014-09-19

國(guó)家自然科學(xué)基金(31172354)；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目；江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心資助項(xiàng)目

鄒 慧(1989-)，女，江蘇蘇州人，碩士生，主要從事中草藥藥理作用與獸醫(yī)臨床應(yīng)用的研究，E-mail：zouhui1314@126.com

*通信作者：許小琴，教授，主要從事中獸醫(yī)醫(yī)藥科學(xué)研究，E-mail：xuxq@yzu.edu.cn

S853.74

A

0366-6964(2015)06-1047-08