盛曉丹，徐懷英，劉 霞，黃迪海，曲新澤，秦卓明1，*

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所，濟南 250100；2.山東省健牧生物藥業(yè)有限公司，濟南 250100)

傳染性支氣管炎病毒S1和N基因遺傳變異頻率的分析

盛曉丹1，2#，徐懷英1#，劉 霞2，黃迪海2，曲新澤2，秦卓明1，2*

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所，濟南 250100；2.山東省健牧生物藥業(yè)有限公司，濟南 250100)

旨在探討中國北方地區(qū)傳染性支氣管炎病毒(IBV)的流行和分子變異，進而探討IBV的遺傳演變規(guī)律。利用生物信息學方法對IBV纖突蛋白(S1)和核蛋白(N)編碼基因進行分析比較。結(jié)果顯示：2012—2013年發(fā)生在山東、天津等北方地區(qū)的IBV流行株高度同源，其S1基因核苷酸(氨基酸)相似性為94.0%～100%(93.1%～100%)，N基因為98.4%～99.1%(98.1%～99.8%)，而與經(jīng)典疫苗株H120相似性均較低，且至少在S1基因的3個高變區(qū)產(chǎn)生了較多的點突變、缺失和插入，且變異集中在第53—150和250—290位，以高變區(qū)HVR I居多，GM/13在 62—65位缺失4個氨基酸。進一步的分析表明：IBV流行株S1基因與1998年在我國北方流行的A2株核苷酸相似性最高，為94.9%～97.2%，年核苷酸(nt)變異頻率平均為2.4 nt×10-3；而N基因則與LX4株相似性最高，為93.0%～93.5%，年變異頻率平均為5.1 nt×10-3。IBV流行株可能是A2-like和LX4-like毒株的重組，且N基因的變異頻率明顯高于S1基因。

IBV；S1基因；N基因；遺傳變異頻率

傳染性支氣管炎(infectious bronchitis，IB)是由傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)引起的發(fā)生于雞的一種急性、高度接觸性呼吸道疾病，主要侵害雞的呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)和消化系統(tǒng)。IBV屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，為單股正鏈RNA，約27 kb[1]。

IBV含有3種主要結(jié)構(gòu)蛋白，即纖突蛋白(spike，S)、膜蛋白(membrane，M)和核蛋白(nucleocapsid，N)[2]。S蛋白位于IBV囊膜，由S1和S2兩個亞單位組成[3]，編碼540個氨基酸，可誘導機體產(chǎn)生中和抗體和血凝抑制(haemagglutination inhibition，HI)抗體[4]，是IBV基因組中最重要和最易發(fā)生變異的部位[5]。研究表明，S1基因同源性越低，交叉保護越差[6-8]。N蛋白位于病毒內(nèi)部，常與RNA結(jié)合構(gòu)成螺旋狀核衣殼。早期認為N蛋白在IBV的進化過程中保守，但近年來的研究表明，N基因亦存在廣泛的變異。

本研究對2012—2013年在中國北方地區(qū)分離的IBV進行分離鑒定，克隆其S1和N基因，綜合前期研究的結(jié)果，與國內(nèi)外經(jīng)典IBV疫苗株進行同源性比較分析，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，并首次對其核苷酸變異頻率進行分析比較。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 從遼寧、天津、山東等多個疑似感染IBV的雞群中，采集氣管、腎和肺等組織，按常規(guī)通過SPF雞胚進行病毒分離鑒定，獲得13株IBV(表1)。

1.1.2 主要試劑 RNAiso Plus、M-MLV、RNA酶抑制劑及dNTP混合物、TaqDNA聚合酶均購自寶生物工程(大連)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。SPF雞與雞胚由山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所SPF雞場提供。

1.2 動物回歸試驗

選取不同地域有代表性的4株IBV分離株TJ-1/13、GM/13、LY-1/13和LY-3/13，按1∶10稀釋，分別通過滴鼻點眼途徑接種10只7 d SPF雞，每只0.1 mL，同時設SPF雞對照10只，觀察14 d，記錄實驗雞發(fā)病情況。

表1 IBV病毒分離時間和臨床病變

Table 1 Main IBV isolates and pathogenicity listed in different time and fields

毒株Strains分離年Year分離地點Location縮寫Abb.臨床病變PathogenicityCKSDXT20122012煙臺YantaiXT/12NephritisCKSDZL20122012濰坊WeifangZL/12NephritisCKSDMH20122012濰坊WeifangMH/12NephritisCKSDFX20122012威海WeihaiFX/12NephritisCKTJ-220122012天津TianjinTJ-2/12NephritisCKTJ-320122012天津TianjinTJ-3/12NephritisCKTJ-120132013天津TianjinTJ-1/13NephritisCKTJ-220132013天津TianjinTJ-2/13NephritisCKHBCZ20122012滄州CangzhouCZ/12NephritisCKLNLY-120132013遼陽LiaoyangLY-1/13NephritisCKLNLY-220132013遼陽LiaoyangLY-2/13NephritisCKLNLY-320132013遼陽LiaoyangLY-3/13NephritisCKSDGM20132013濰坊WeifangGM/13Nephritis

1.3 引物設計

參照GenBank已公布的IBV基因組S1和N基因序列，利用Primer primier5.0設計2對引物，引物由上海生物工程有限公司合成。S1和N基因擴增產(chǎn)物分別為1 783和1 488 bp。S1-F：5′-GCA-ACGCCAGTTGTTAATTTG-3′，S1-R：5′-CAG-CTTTAACGAACCATCTGG-3′；N-F：5′-AGCA-ATAGCAAGAAAAGCGC-3′，N-R：5′-GCACAT-AATCACAATCAATGCC-3′。

1.4 RT-PCR擴增與測序

按RNAiso Pus說明書從尿囊液中提取病毒RNA，通過RT-PCR擴增S1和N基因。程序：42 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s；56 ℃退火30 s；72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；最終延伸10 min。將經(jīng)過電泳鑒定的PCR產(chǎn)物送往北京六合華大公司測序。

1.5S1和N基因同源性比較、系統(tǒng)發(fā)育分析和核苷酸變異頻率分析

2 結(jié) 果

2.1 病毒的分離鑒定

2012—2013年在北方發(fā)生的IBV，臨床發(fā)病以腎的病變?yōu)橹?，呼吸道癥狀輕微，主要病變?yōu)槟I腫脹、淤血，并伴有不同程度的尿酸鹽沉積。經(jīng)SPF雞胚傳代，大多數(shù)IBV毒株盡管第1代未出現(xiàn)病癥，但在第2代以后陸續(xù)出現(xiàn)了典型的“侏儒胚”變化：個體發(fā)育較小，頭、爪合抱在一起，雞胚蜷縮，活性較差。取雞胚尿囊液分別進行IBV特異性RT-PCR檢測和HA檢測。結(jié)果HA檢測陰性，均擴增出IBV目的片段。

2.2 動物回歸試驗

在SPF雞接種4種IBV分離毒2～3d后，攻毒組均出現(xiàn)甩鼻、咳嗽等呼吸道癥狀，死亡率在不同毒株間有差異，TJ-1/13、GM/13、LY-1/13和LY-3/13死亡雞只分別為3、6、4和2。以GM/13死亡最多，60%死亡，LY-3/13最少，僅20%死亡。死亡雞與臨床發(fā)病雞群剖檢癥狀相同，表現(xiàn)為輸尿管尿酸鹽沉著，腎大并伴有尿酸鹽沉積，發(fā)病雞脫水嚴重。未攻毒組SPF雞生長發(fā)育正常。

2.3 測序結(jié)果

13株IBVS1基因核苷酸(nt)為1 720bp，4株N基因為1 440bp，分別編碼540和409個氨基酸(aa)。

2.4 S1基因同源性比較和分子特征分析

13株IBV流行株之間S1核苷酸(氨基酸)序列相似性為94.0%～100%(93.1%～100%)；與1998年在北方流行的A2毒株nt(aa)相似性最高，為94.9%～97.2%(94.6%～96.6%)；與LX4的nt(aa)相似性僅為93.1%～94.2%(92.5～94%)；而與經(jīng)典疫苗株H120的S1nt(aa)相似性不足74%(75%)。

以中國常用疫苗株H120、M41和歐洲疫苗株4/91為參照，對我國IBV主要流行株進行氨基酸變異位點分析(表2)。11株IBV流行株S1蛋白氨基酸的突變主要集中在第53—150和250—290位。此外，在多處發(fā)生明顯的點突變，其中LY-3/13、GM/13、LY-1/13在第56—69位的變異最大，且GM/13在62—65位缺失4個氨基酸。GM/13、LY-1/13與TJ-1/13的S蛋白切割識別位點均為HRRRR，而LY-3/13則為HRCRR。

比較還證實：同一基因型毒株氨基酸替代較一致，如在53位點，Mass-like毒株均為異亮氨酸(I)，4/91-like毒株均為纈氨酸(V)，SD-like與A2-like毒株均為色氨酸(S)；而不同基因型的IBV毒株氨基酸則有較大差異，如在56位點，Mass-like毒株為谷氨酸(E)，4/91-like毒株為色氨酸(G)，SD-like毒株為賴氨酸(K)，而A2-like毒株為組氨酸(H)或酪氨酸(Y)。值得關注的是，有些位點的氨基酸為不同分支毒株所共有，如在62位點Mass-like、4/91-like與A2-like毒株均為S；而1997—1999年的3個山東毒株SD-B-97、SD-D-98、SD-HD-99等在相同位點均為蘇氨酸(T)，反應出毒株之間的內(nèi)在聯(lián)系性，同時顯示出毒株的特異性。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育

根據(jù)IBVS1基因的核苷酸序列同源性可將IBV至少分為八大類，包括A2-like、4/91-like、Mass-like、Conn-like、T-like等(圖1)，其中，13株2012—2013年在北方分離的IBV流行株與A2株系統(tǒng)發(fā)育關系最密切，而與疫苗株H120、H52、M41、4/91等遺傳關系相對較遠。

2.6N基因同源性比較和系統(tǒng)進化

4株IBV流行株N基因之間核苷酸(氨基酸)相似性較高，為98.4%～99.1%(98.8%～99.8%)，但與經(jīng)典疫苗株H120的相似性相對較低，為85.7%～86.4%(91.0%～91.7%)，表現(xiàn)出明顯差異。對4株IBV分離株的N基因序列進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無堿基的缺失和插入，但存在點突變，且N基因存在廣泛的氨基酸替代，變異主要集中在179-236、340-370位堿性氨基酸區(qū)。系統(tǒng)進化見圖2。

2.7 1998—2013年中國北方地區(qū)IBVS1和N基因的核苷酸變異頻率

由同源性比較可知，IBV流行株在S1基因與我國1998年在北方最早流行的A2同源性最高，核苷酸相似性為94.9%～97.2%，而與LX4的相似性僅為93.4%～95.4%。以A2為參考毒株，則發(fā)現(xiàn)1998—2013年間IBV流行株S1基因的核苷酸年平均變異頻率為2.4×10-3(表3)。

2013年4株IBV流行株在S1基因與我國1998年A2株核苷酸相似性最高，為95.6%～97.2%；與我國1999年在北方最早流行的LX4的相似性為94.7%～96.1%；相應的N基因則與LX4核苷酸相似性最高(93.2%～93.8%)，與A2的相似性僅為90.4%～90.6%(表4)。結(jié)合IBV屬于冠狀病毒，具有“跳躍式復制”的特點，且校對機制不完善的特點，推測IBV分離株在流行過程中可能存在A2-like和LX4-like毒株之間的重組。

以LX4為參考毒株，則發(fā)現(xiàn)1999年以來，IBV流行株N基因的核苷酸年平均變異頻率為5.1×10-3，明顯高于S1基因(表5)。

表3 1998—2013年間IBV流行株S1基因的核苷酸變異頻率

Table 3S1 gene mutation frequency of IBV isolates from 1998 to 2013

毒株Strain分離年Yearofisolationnt變異數(shù)量Variationnumberofnt轉(zhuǎn)換(P)Transition顛換(Q)Transversion變異頻率Mutatonfrequency年平均變異率(×10-3)Mutationfrequencyperyear(×10-3)A219980000TJ-3/1220124834140.035TJ-2/1320134932170.037TJ-2/1220124834140.035TJ-1/1320134932170.037ZL/1220125033170.037XT/1220125033170.037MH/1220126542230.049GM/132013453690.031FX/1220125035150.037LY-3/132013322880.025LY-2/1320136141200.045LY-1/1320136141200.045CZ/1220124932170.0372.4(1.6～3.3)

表4 2013年IBV分離株S1和N基因與A2、LX4及其與疫苗株的核苷酸同源性比較

Table 4 Nucleotide acids homologies of IBV isolates in 2013 comparing with vaccine references

毒株StrainA2LX4H1204/91S1NS1NS1NS1NTJ-1/1396.890.495.393.678.287.178.987.6GM/1397.190.596.193.277.886.978.987.9LY-1/1395.690.694.793.877.487.578.488.1LY-3/1397.290.696.193.278.087.179.287.9

毒株名后是其GenBank登陸號；●表示本研究毒株。圖2同GenBank No.were listed after the names of IBV；● indicates the used strain in this study.The same as below圖1 13株IBV分離株與參考株S1基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of nucleotide sequence of the S1 gene from the 13 IBV isolates in this study and the reference strains

圖2 4株IBV分離株與參考株N基因核苷酸序列系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of nucleotide sequence of the N gene from the 4 IBV isolates in this study and the 22 reference strains

3 討 論

我國IBV流行株血清型和基因型均比較復雜，世界上不同血清型和基因型的IBV株幾乎均可在我國分離到。正是由于IBV存在不同種類的基因型，導致其抗原性多種多樣，進而導致IBV免疫失敗不斷發(fā)生，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[10-12]。本研究自2012年初陸續(xù)從我國遼寧、天津、山東等北方地區(qū)分離到13株IBV，篩選出4株IBV進行動物回歸試驗，證實均可引起雞呼吸道和腎的病變。序列分析表明，IBV流行株與H120等Mass型經(jīng)典疫苗株及新型疫苗4/91株相比，均有較大的差別(分屬于不同的基因型)。

對IBVS1基因大量的研究表明：該基因一般存在3個高變區(qū)(HVR)，分別位于第3—25、52—154和266—294，而這些位點通常與IBV決定抗原性的中和抗體位點密切相關[13]。本研究分離的13株IBV流行株的S1變異位點恰好集中在第53—150和250—290位，提示IBV毒株的分子變異可能是導致IBV抗原性變異的重要基礎，也是疫苗在我國免疫失敗的主要原因[14]。

表5 1999—2013年IBV流行株N基因的核苷酸變異頻率

Table 5Ngene mutation frequency of IBV isolates from 1999 to 2013

毒株Strain分離年Yearofisolationnt變異數(shù)量Variationnumberofnt轉(zhuǎn)換(P)Transition顛換(Q)Tranversion變異頻率Mutationfrequency年平均變異率(×10-3)Mutationfrequencyperyear(×10-3)LX419990000TJ-1/1320137859190.076GM/1320138262200.080LY-1/1320137557180.072LY-3/1320138260220.0815.1(4.8～5.4)

研究表明，IBV的N基因富含堿性氨基酸，相對保守，這一結(jié)果有利于N蛋白與核酸的結(jié)合，但已有報道證實N基因也存在不同程度的變異[15-16]。本試驗證實，4株IBV分離株N基因與H120相比，核苷酸(氨基酸)相似性不足87%(90%)，變異主要以點突變?yōu)橹鳎瑹o核苷酸的插入和缺失，其中在179—236位、340—370位堿性氨基酸區(qū)域變異較大。該氨基酸殘基位于第一個線性B細胞抗原表位(175—241位)[17]、CTL的抗原表位(290—409位)[18]和線性B細胞抗原表位(310—370位、360—409位)區(qū)域內(nèi)，而這種變異往往會改變病毒誘導的宿主B淋巴細胞的反應性。

IBV基因組為不分節(jié)段的正股單鏈RNA，具有特殊的轉(zhuǎn)錄機制，在先導RNA序列與基因內(nèi)部起始位點之間有7～18個核苷酸是相同的，且RNA聚合酶沿著模板“跳躍前進”，這正是導致IBV具有較高重組率的重要原因，也是促成IBV發(fā)生自然突變的原因之一[19-20]。本研究分離鑒定的4株IBV，其S1基因與A2株相似性最高，而其N基因則與LX4株最高，由此推斷IBV分離株可能是A2-like和LX4-like類型毒株在S1和N基因?qū)用嫔系闹亟M，有待通過實驗室進一步證實[20]。此外，綜合本實驗室近二十年對IBV的研究結(jié)果，首次對其S1和N基因的核苷酸變異頻率進行統(tǒng)計學比較，計算出了IBV在不同年代的基因變異頻率。上述工作有待進一步深入研究。

盡管中國IBV十分復雜，但其變異有著十分明顯的“時間和地域性”特點。本研究分離到的13株IBV高度一致，且與1998年在我國北方發(fā)生的A2-like類型毒株密切相關，而與歐洲株4/91-like明顯不同，是中國所特有的毒株[21-22]。因此，應加強對IBV流行株的跟蹤研究，研制合適的疫苗，這對合理防控IB意義重大。

4 結(jié) 論

IBV流行株是A2-like和LX4-like在S1和N基因?qū)用嫔系闹亟M。在近十年，IBV流行株N基因的核苷酸年平均變異頻率為5.1×10-3，明顯高于S1基因的變異頻率(2.4×10-3)。

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(編輯 白永平)

Genetic Variation Frequency ofS1 andNGene of Infectious Bronchitis Virus

SHENG Xiao-dan1，2#，XU Huai-ying1#，LIU Xia2，HUANG Di-hai2，QU Xin-ze2，QIN Zhuo-ming1，2*

(1.InstituteofPoultryScience，ShandongAcademyofAgriculturalScience，Jinan250100，China；2.ShandongJianmuBiologicalPharmaceuticalCo.，Ltd.，Jinan250100，China)

This study was undertaken to investigate the prevalence and molecular variation of infectious bronchitis virus in the northern area of China.Thirteen infectious bronchitis viruses (IBV) strains obtained from commercial chickens in northern China between 2012 and 2013 were isolated and identified by the sequencing of the entireS1 gene.The variants were distinguished by phylogenetic analysis and alignment in comparison with the vaccination-challenge tests that were performed using heterogeneous strains.The results showed that both theS1 andNgene of the prevailing IBV shared higher homologies.Furthermore，S1 gene shared nucleotide (amino acid) homology of 94.0%-100% (93.1%-100%)，andNgene had nucleotide (amino acid) 98.4%-99.1% homology (98.1%-99.8%)，receptively.Compared with the classical vaccine strain，there were at least three hyper-variable regions were found inS1 gene，and point mutations，deletions and insertions of IBV strains were also occurred at the genomic level，which were concentrated in the 53-150，and 250-290.Four amino acids were found missing in GM/13 at 62-65.Further analysis showed that the IBV epidemic strains shared highest homology (94.9%-97.2%) with A2 strains and the nucleotide (nt) mutation frequency averaged 2.4 nt×10-3/year in view ofS1 gene；while，theNgene was the LX4 strains of the homologous highest (93.0%-93.5%)，the average annual variation in frequency 5.1 nt×10-3/year.Those findings suggest that the recent IBV epidemic strains may be recombinant of A2 and LX4 type strains，andNgene mutation frequency is greater than of theS1 gene.

infectious bronchitis virus；S1 gene；Ngene；mutation frequency

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.015

2014-09-24

國家自然科學基金(31372332)；科技部農(nóng)轉(zhuǎn)資金(SQ2013ECC600059)；山東省科技攻關重點支持項目(2009GG10009006)；濟南市成果轉(zhuǎn)化支持項目(2012CG92)

盛曉丹(1985-)，女，山東濰坊人，助理研究員，主要從事動物傳染病防控研究，E-mail：sxd1985wl@163.com；徐懷英(1976-)，女，山東冠縣人，副研究員，主要從事動物傳染病和免疫學研究，E-mail：hyingxu@163.com。二人對本文同等貢獻

*通信作者：秦卓明，E-mail：qinzm1997@163.com

S852.659.6

A

0366-6964(2015)06-0989-09