陳 晨，胡雄貴，朱 吉，任慧波，鄧 緣，彭英林

(湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)沙 410131)

豬脂肪發(fā)育相關(guān)miRNAs的功能研究進(jìn)展

陳 晨*，胡雄貴，朱 吉，任慧波，鄧 緣，彭英林*

(湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)沙 410131)

脂肪組織與豬肉品質(zhì)密切相關(guān)，是影響豬胴體品質(zhì)的一大因素。了解豬脂肪組織的生長(zhǎng)發(fā)育及代謝調(diào)控機(jī)制，對(duì)于畜牧生產(chǎn)及疾病治療具有重大意義。miRNAs(microRNAs)是一類內(nèi)源性的、非編碼的、長(zhǎng)度為18～24 nt的小分子RNA，其主要通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后水平起作用。大量研究表明，miRNAs參與調(diào)控脂肪細(xì)胞分化、脂肪形成、脂肪酸代謝、膽固醇合成等多個(gè)生命過(guò)程。然而目前已報(bào)道的豬miRNAs僅有326個(gè)，且miRNAs調(diào)控豬脂肪發(fā)育的研究十分欠缺。本文對(duì)近年來(lái)豬脂肪相關(guān)miRNAs的挖掘和鑒定研究工作進(jìn)行回顧，同時(shí)也關(guān)注了miRNAs調(diào)控豬脂肪發(fā)育的研究。

豬；脂肪發(fā)育；miRNAs；調(diào)控機(jī)制

豬是重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，也是中國(guó)第一大肉品來(lái)源。脂肪組織與肉品質(zhì)密切相關(guān)，是影響豬肉品質(zhì)的一大因素，同時(shí)胴體瘦肉率也是評(píng)估胴體品質(zhì)的一個(gè)重要方面。因此，脂肪組織的發(fā)育和肉品質(zhì)一直受到科學(xué)家們的廣泛關(guān)注，對(duì)豬脂肪組織的生長(zhǎng)發(fā)育及代謝調(diào)控研究具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。miRNAs是一類內(nèi)源性的、進(jìn)化高度保守的非編碼小分子RNA。許多研究已表明，miRNAs在調(diào)控體外和體內(nèi)脂肪形成過(guò)程中扮演著重要角色。迄今為止，最新miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中(Release 20)(http：//www.mirbase.org/)可查詢到的人和小鼠的成熟miRNAs分別達(dá)到2 578個(gè)和1 908個(gè)，而豬中僅有326個(gè)，且miRNAs調(diào)控豬脂肪發(fā)育的研究十分欠缺，因此豬miRNAs的數(shù)量和功能亟待持續(xù)挖掘和深入探索。

本文綜述了近年來(lái)豬脂肪相關(guān)miRNAs的挖掘和鑒定工作，也特別關(guān)注了miRNAs調(diào)控豬脂肪發(fā)育的研究進(jìn)展。

1 脂肪形成概述

脂肪組織是體脂合成的主要器官，同時(shí)也是儲(chǔ)存脂肪細(xì)胞的主要場(chǎng)所。除提供能量外，它還具有維持體溫，緩沖外界機(jī)械沖擊，保護(hù)內(nèi)臟器官、分泌脂肪因子和調(diào)節(jié)生理機(jī)能等作用[1-2]。其中脂肪細(xì)胞的形成對(duì)脂肪組織的發(fā)育起著舉足輕重的作用。

目前普遍認(rèn)為脂肪細(xì)胞來(lái)源于多潛能干細(xì)胞，其經(jīng)歷脂肪母細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞，最終分化形成成熟的脂肪細(xì)胞。前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞的分化過(guò)程由多種分化轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，并伴隨一系列成脂基因和脂代謝合成酶基因的時(shí)序表達(dá)(圖1)。前脂肪細(xì)胞的分化首先要經(jīng)歷細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制階段，即細(xì)胞長(zhǎng)滿達(dá)到接觸抑制，退出細(xì)胞周期并停止有絲分裂。此時(shí)脂肪細(xì)胞早期分化標(biāo)記基因脂蛋白脂肪酶(LPL)和前脂肪細(xì)胞因子1(pref1)高表達(dá)。接著在分化誘導(dǎo)劑(Insulin、DEX和IBMX)的刺激作用下，細(xì)胞再次進(jìn)入細(xì)胞周期并進(jìn)行兩輪有絲分裂克隆擴(kuò)增，然后多種分化轉(zhuǎn)錄因子開始表達(dá)，主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子有CAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白δ、β、α(C/EBPδ、β、α)，脂肪細(xì)胞分化決定因子1/固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(ADD1/SREBP1c)和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)。此后這些轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)脂肪形成相關(guān)基因的表達(dá)，如激素敏感性脂肪酶(HSL)、乙酰輔酶A脫羧酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)、脂肪酸結(jié)合蛋白(ap2/FABP4)、脂聯(lián)素(adiponectin)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT)等。此階段細(xì)胞形態(tài)由纖維狀逐漸趨于橢圓形或圓形，胞內(nèi)出現(xiàn)小脂滴，隨后細(xì)胞進(jìn)入脂滴累積的終端分化狀態(tài)[3-5]。

圖1 脂肪細(xì)胞分化的過(guò)程示意圖Fig.1 Schematic of process of adipocyte differentiation

2 miRNA的生成和作用機(jī)制

miRNA是一類內(nèi)源性的、物種間保守的、具有時(shí)空組織特異性的、長(zhǎng)度為18～24 nt的非編碼小分子RNA[6]。1993年，科學(xué)家們首次在秀麗新小桿線蟲中發(fā)現(xiàn)了具有調(diào)節(jié)其發(fā)育時(shí)序性的miRNA，即lin-4。lin-4與靶mRNAlin-14的3′UTR反向互補(bǔ)結(jié)合，從而抑制了lin-14基因的翻譯[7]。第2個(gè)miRNA let-7也于2000年被發(fā)現(xiàn)[8]，其與lin-4和daf-12基因的3′UTR互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，進(jìn)而抑制靶mRNA的翻譯。

動(dòng)物中miRNA的生成是一個(gè)多步驟的復(fù)雜進(jìn)程，大致可分為3個(gè)階段(圖2)：①核內(nèi)miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉(zhuǎn)錄出一個(gè)長(zhǎng)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本，即primary-miRNA(pri-miRNA)，長(zhǎng)度從幾百至幾千個(gè)核苷酸不等，此初級(jí)轉(zhuǎn)錄本含有成熟的miRNA及多個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)；②pri-miRNA被RNase Ⅲ Drosha和DGCR8形成的蛋白復(fù)合物識(shí)別并剪切形成具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)、長(zhǎng)度約為70 nt的前體miRNA，即precusor-miRNA(pre-miRNA)；③pre-miRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5 從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞質(zhì)中的RNase Ⅲ Dicer酶及結(jié)合蛋白將pre-miRNA切割成長(zhǎng)度約為22 nt的雙鏈miRNA，即miRNA：miRNA*。隨后，雙鏈迅速解螺旋，其中一條鏈降解，另一條鏈即為成熟的miRNA。成熟的miRNA結(jié)合RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)后再與靶基因結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用[9]。

miRNA主要以兩種方式抑制靶基因的表達(dá)：靶mRNA的剪切降解和翻譯抑制。RISC中的AGO蛋白引導(dǎo)miRNA識(shí)別靶基因，當(dāng)miRNA序列與靶mRNA序列完全配對(duì)時(shí)引起靶mRNA的剪切和降解，這種情況多見于植物中。而部分堿基互補(bǔ)配對(duì)(通常是miRNA的“種子序列”即第2～8 nt與靶mRNA的結(jié)合)則傾向于抑制靶mRNA的翻譯，此種作用多見于動(dòng)物中[10]。以前的研究認(rèn)為，成熟的miRNA只與靶mRNA的3′UTR結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用，然而近來(lái)的研究表明miRNA還可與5′UTR及CDS區(qū)結(jié)合[11-12]，這表明miRNA可通過(guò)多種復(fù)雜的途徑來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)從而影響生命過(guò)程。

圖2 miRNA的生物合成過(guò)程及其作用機(jī)制[9]Fig.2 A model for miRNA biogenesis process and its targeting mechanism[9]

3 豬脂肪相關(guān)miRNAs的挖掘和鑒定

miRNAs的挖掘方法主要包括生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、cDNA克隆測(cè)序和高通量測(cè)序等技術(shù)。鑒定miRNAs最經(jīng)典的方法是被譽(yù)為“金標(biāo)準(zhǔn)”的RNA印跡(Northen blotting)，其次還有實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)、原位雜交和芯片等技術(shù)。

基于豬基因組測(cè)序任務(wù)的逐步完成，以及在人和小鼠上鑒定出了相對(duì)較多的miRNAs，計(jì)算機(jī)同源搜索起初成為挖掘豬miRNAs的首要方法[13-14]。R.Wernersson等[13]于2005年采用這種方法對(duì)豬基因組進(jìn)行掃描，共篩選出51個(gè)成熟miRNAs，這也是第一篇關(guān)于豬miRNAs的報(bào)道，這項(xiàng)研究對(duì)后續(xù)miRNAs的挖掘具有重要指導(dǎo)意義。雖然生物信息學(xué)方法可以從全基因組中快速挖掘大量潛在的miRNAs，但預(yù)測(cè)分析結(jié)果仍需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

此后，多位專家學(xué)者開始采用cDNA克隆測(cè)序方法對(duì)豬miRNAs進(jìn)行挖掘，并采用“夾板連接法”對(duì)miRNAs進(jìn)行鑒定[15-16]。I.S.Cho等[16]在180日齡巴克夏豬的背最長(zhǎng)肌和35日齡杜長(zhǎng)大三元雜交豬的背部脂肪組織中共克隆出89個(gè)miRNAs，其中miR-16、miR-21、miR-199a和miR-199a*在脂肪組織中顯著高表達(dá)，而miR-130b、miR-339、miR-450b*、miR-542*和miR-574*則表現(xiàn)出脂肪特異性。這是豬中首次將脂肪組織作為單列研究對(duì)象進(jìn)行miRNAs的挖掘鑒定工作，其研究結(jié)果為深入探索這些miRNAs的生物學(xué)功能奠定了良好基礎(chǔ)。cDNA克隆測(cè)序方法雖然可靠性高，但耗時(shí)長(zhǎng)、效率低，很難鑒定低豐度或組織細(xì)胞特異表達(dá)的miRNAs，這也限制了此方法的大規(guī)模應(yīng)用和推廣。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，高通量測(cè)序方法的出現(xiàn)極大促進(jìn)了miRNAs的挖掘鑒定工作，同時(shí)豬脂肪相關(guān)miRNAs的研究也進(jìn)入了飛速發(fā)展時(shí)期。

早在2009年，A.M.Reddy等[17]采用454測(cè)序方法對(duì)10月齡雜交豬的心、肝與胰腺組織的miRNAs進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用Northern blotting法進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果共鑒定出120個(gè)保守的miRNAs，其中miR-194在肝中顯著高表達(dá)，miR-122則表現(xiàn)出肝特異性。2011年，S.S.Xie等[18]利用芯片技術(shù)對(duì)Solexa測(cè)序鑒定出的miRNAs在脂肪型通城豬和瘦肉型大白豬的肝中進(jìn)行差異表達(dá)的檢測(cè)，并結(jié)合RT-PCR和Northern blotting法對(duì)miRNAs在多個(gè)組織中進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果共篩選出miR-143和let-7等58個(gè)表達(dá)差異的miRNAs。研究也證實(shí)，miR-143和let-7在人、小鼠和豬的脂肪細(xì)胞分化、脂肪形成及脂肪酸代謝過(guò)程中扮演著重要角色[19-22]。肝也是脂肪代謝的重要器官，在脂肪的合成和釋放、脂肪酸分解、膽固醇與磷脂的合成、脂蛋白的合成及運(yùn)輸?shù)壬磉^(guò)程中發(fā)揮著重要作用。因此，梅山豬和大白豬肝差異miRNAs的鑒定在一定程度上為揭示脂肪形成的分子機(jī)制提供參考。同年，C.Chen等[23]以Illumina高通量平臺(tái)為研究手段，以杜洛克與二花臉F2代在脂肪沉積和生長(zhǎng)上存在顯著差異的全同胞雌性個(gè)體為研究對(duì)象，分別對(duì)兩個(gè)體的肝、背最長(zhǎng)肌和腹部脂肪共6個(gè)樣品進(jìn)行miRNAs的挖掘。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)了348個(gè)成熟miRNAs(164個(gè)潛在的新的miRNAs)，其中86個(gè)新的miRNAs是腹脂特異存在的，表明這些miRNAs可能調(diào)控豬的脂肪沉積過(guò)程，為脂肪發(fā)育規(guī)律的深入研究提供新的理論素材。

2011年，G.Li等[24]以7日齡榮昌仔豬和240日齡榮昌大豬的背部脂肪組織為試驗(yàn)材料，采用Solexa方法對(duì)兩個(gè)樣品的miRNAs庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序分析。共鑒定出227個(gè)成熟miRNAs，其中miR-122、miR-103/107和miR-224等93個(gè)miRNAs在大豬背脂中顯著上調(diào)表達(dá)，miR-205、miR-493和miR-136等33個(gè)miRNAs顯著下調(diào)表達(dá)，揭示這些miRNAs可能在豬脂肪發(fā)育和沉積過(guò)程中發(fā)揮各種生理調(diào)控作用。已有研究顯示，miR-122增加肝脂肪酸氧化、抑制膽固醇合成[25]；飼喂高膽固醇日糧的哥廷根迷你豬具有較高的體重、總膽固醇水平和高密度脂蛋白含量[26]，這些表征與miR-122的低水平表達(dá)有關(guān)，暗示了miR-122與豬肥胖之間的相關(guān)性；miR-103加速豬前脂肪細(xì)胞的分化、促進(jìn)脂滴積累[27]；miR-224阻礙小鼠3T3-L1細(xì)胞早期成脂分化[28]。這些研究發(fā)現(xiàn)從側(cè)面支持了測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，而測(cè)序結(jié)果也為這些研究成果提供依據(jù)。然而大部分差異表達(dá)miRNAs介導(dǎo)調(diào)控脂肪發(fā)育的生理功能仍不清楚，具體的分子機(jī)制有待深入研究。

最近，本課題組以150日齡瘦肉型大白豬和脂肪型梅山豬的背部脂肪組織為試驗(yàn)材料，采用Solexa深度測(cè)序方法在兩樣品中共鑒定出215個(gè)成熟miRNAs[29]，其中9個(gè)miRNAs在兩樣品中存在極顯著差異，即miR-215、miR-224、miR-135和miR-146b在大白豬中高表達(dá)；miR-1a、miR-133a、miR-122、miR-204和miR-183在梅山豬中高表達(dá)。本小組后續(xù)的研究也證實(shí)miR-224[28]和miR-135[30]抑制前脂肪細(xì)胞分化和脂肪形成，而miR-183則具有相反的生理功能[31]。此研究結(jié)果不僅驗(yàn)證了Solexa測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，同時(shí)也為揭示miRNAs調(diào)控脂肪形成的表觀分子機(jī)制、剖析中外豬種肉質(zhì)性狀差異的遺傳機(jī)理提供了分子依據(jù)。

肌內(nèi)脂肪是影響豬肉品質(zhì)的主要性狀之一，對(duì)肌肉的嫩度、風(fēng)味和多汁性具有重要的影響[32-33]。但肌內(nèi)脂肪在發(fā)育和代謝上都與其他脂肪組織存在很大差異[34-35]，其形成和調(diào)控機(jī)制仍不清晰?；诖耍琘.Guo等[36]分離得到豬的肌內(nèi)血管干細(xì)胞(IVSC)和皮下血管干細(xì)胞(SVSC)，采用Solexa測(cè)序比較了二者在成脂分化過(guò)程中miRNAs組(microRNAome)差異，并采用qPCR方法對(duì)其中一些miRNAs進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證和組織表達(dá)譜分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了224個(gè)已知豬miRNAs和280個(gè)潛在miRNAs，其中54個(gè)miRNAs在IVSC和SVSC分化過(guò)程中具有相似的表達(dá)模式，10個(gè)miRNAs具有相反的表達(dá)模式。此研究結(jié)果為解析肌內(nèi)和皮下脂肪形成及差異分子機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

4 miRNAs調(diào)控豬脂肪發(fā)育的研究進(jìn)展

2003年，人們?cè)诠壷惺状伟l(fā)現(xiàn)調(diào)控脂肪代謝的miRNA[37]，即miR-14。在隨后十年的研究過(guò)程中，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)人和小鼠中越來(lái)越多的miRNAs在脂質(zhì)代謝過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用，包括脂肪細(xì)胞分化、血脂代謝及胰島素抵抗和分泌等過(guò)程。而豬脂肪相關(guān)miRNAs的功能研究?jī)H有零星報(bào)道(表1)。

表1 豬脂肪形成和脂質(zhì)代謝相關(guān)miRNAs

Table 1 miRNAs associated with adipogenesis and lipid metabolism in pigs

miRNAs功能Function靶基因Target參考文獻(xiàn)ReferencemiR?122膽固醇水平相關(guān)CAT1[26]miR?196a↑脂肪形成-[40]miR?103↑脂肪形成RAI14[27，44]miR?27a↓脂肪形成-[20]miR?143↑脂肪形成-[20]miR?145↓脂肪形成IRS1[52]miR?181↑脂肪形成TNFα[53]miR?33b↓脂肪形成EBF1[54]miR?199a?5p↓脂肪形成Cav1[58]miR?130b↓脂肪形成PPARγ[62，63]miR?374a/b-C/EBPβ[62，64]

↑.表示促進(jìn)脂肪形成；↓.表示抑制脂肪形成

↑.Represents promotion of adipogenesis；↓.Represents inhibition of adipogenesis

4.1 miR-122

2005年，J.Krützfeldt等學(xué)者[38]利用反義寡核苷酸技術(shù)抑制miR-122后發(fā)現(xiàn)小鼠血漿膽固醇水平降低。另一項(xiàng)研究表明[25]，抑制小鼠miR-122導(dǎo)致血漿膽固醇水平降低、肝脂肪酸氧化增強(qiáng)、肝脂肪酸和膽固醇的合成速率降低。2010 年的研究發(fā)現(xiàn)，miR-122通過(guò)影響小鼠肝細(xì)胞SREBP1c、DGAT2、FAS和ACC1等基因的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控脂肪酸和甘油三酯的合成[39]。同年，S.Cirera實(shí)驗(yàn)室[26]發(fā)現(xiàn)，飼喂高膽固醇日糧的哥廷根迷你豬的體重、總膽固醇及高密度脂蛋白水平顯著高于飼喂標(biāo)準(zhǔn)日糧組，而甘油三酯水平和miR-122表達(dá)量卻顯著低于飼喂標(biāo)準(zhǔn)日糧組。作者認(rèn)為豬體重和膽固醇水平的增加與miR-122表達(dá)水平的降低有關(guān)，這與在小鼠中的研究報(bào)道一致。這些研究結(jié)果表明 miR-122 可能是治療膽固醇和脂肪酸代謝疾病的靶標(biāo)。

4.2 miR-196a

2010年，寧小敏[40]首先對(duì)3日齡和180日齡長(zhǎng)白豬的脂肪、肌肉、心、肝、脾、肺和胰腺組織中的miR-196a進(jìn)行時(shí)空表達(dá)譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-196a在7個(gè)組織中均有表達(dá)，3日齡仔豬中miR-196a在脂肪組織中的表達(dá)量最低(相對(duì)表達(dá)量約為0.57)，而180日齡大豬中miR-196a在脂肪組織中的表達(dá)量最高(相對(duì)表達(dá)量約為16.26)，暗示miR-196a可能調(diào)控豬的脂肪組織發(fā)育進(jìn)程。因此，作者進(jìn)一步分析了pcDNA3.0-miR-196a超表達(dá)載體對(duì)豬原代前脂肪細(xì)胞的增殖和分化的影響。結(jié)果顯示，miR-196a對(duì)豬前脂肪細(xì)胞的增殖沒(méi)有明顯影響，而脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵基因PPARγ、C/EBPα和LPL的表達(dá)水平和脂滴積累較對(duì)照組明顯增加。2012年，J.M.Romao等[41]的研究指出，miR-196a在牛腎周脂肪組織中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于背部皮下脂肪組織，這說(shuō)明miR-196a可能對(duì)維持脂肪庫(kù)的特異性起重要作用。然而miR-196a作用的具體分子機(jī)制并不明了，仍需進(jìn)行深入研究。

4.3 miR-103

2011年，G.Li等[27]從杜洛克和斯格豬的雜交公豬后代中各選擇10頭3日齡仔豬和180日齡大豬為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)，miR-103在兩時(shí)期豬的背部皮下脂肪組織、小腦和大腦等13個(gè)組織中廣泛表達(dá)。隨著背部皮下前脂肪細(xì)胞的分化，miR-103的表達(dá)量逐漸升高；反義抑制了miR-103抑制成脂基因(C/EBPα、PPARα、PPARγ和FABP4)的表達(dá)，阻礙了前脂肪細(xì)胞分化和甘油三酯積累。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，RAI14基因與miR-103的表達(dá)趨勢(shì)相反，即在前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中，RAI14基因的表達(dá)水平逐漸降低，蛋白印跡試驗(yàn)證明RAI14為miR-103的靶基因。前期研究已證實(shí)，視黃酸誘導(dǎo)RAI14基因的表達(dá)、抑制豬前脂肪細(xì)胞的分化[42-43]，筆者推測(cè)miR-103可能通過(guò)靶向RAI14基因拮抗視黃酸對(duì)豬前體脂肪細(xì)胞分化的抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)脂肪形成。

李美航等[44]將pre-miR-103腺病毒超表達(dá)載體感染豬原代前脂肪細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，成脂標(biāo)記基因PPARγ和ap2的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著升高，且觀察到明顯的脂滴生成。這說(shuō)明miR-103可促進(jìn)豬前脂肪細(xì)胞的發(fā)育，但遺憾的是作者并沒(méi)有對(duì)miR-103的作用靶標(biāo)和調(diào)控通路進(jìn)行分析和驗(yàn)證。

4.4 miR-27a和miR-143

T.Wang等[20]應(yīng)用miRNA“獲得”和“缺失”技術(shù)即轉(zhuǎn)染miRNA mimics和inhibitor研究miR-27a和miR-143對(duì)豬成熟脂肪細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-27a促進(jìn)甘油和游離脂肪酸的生成，抑制甘油三酯和脂滴的形成；而miR-143則抑制甘油和游離脂肪酸的生成，促進(jìn)甘油三酯和脂滴的形成。研究表明，人和鼠中miR-27和miR-143調(diào)控脂肪代謝的研究結(jié)果與豬中一致。miR-27a/b靶向成脂關(guān)鍵基因PPARγ和線粒體膜電位相關(guān)基因prohibitin(PHB)，抑制人脂肪源多潛能干細(xì)胞和小鼠前脂肪細(xì)胞向成脂方向的分化和脂滴形成[45-48]；在山羊乳腺上皮細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)，miR-27a降低不飽和/飽和脂肪酸比例、下調(diào)脂肪合成相關(guān)基因(PPARγ、SCD和DGAT1)的表達(dá)、抑制甘油三酯積累[49]；miR-143靶向結(jié)合pleiotrophin(PTN)基因的編碼區(qū)從而促進(jìn)小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化和脂肪聚積[50]；大鼠脂肪源基質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制階段或終末分化階段異位表達(dá)miR-143促進(jìn)脂肪形成，miR-143的這種調(diào)控作用是通過(guò)直接靶向MAPK2K5，抑制MAP2K5-ERK5信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的[21]。

4.5 miR-145

前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-145在240日齡榮昌大豬背脂中的表達(dá)量顯著高于7日齡榮昌仔豬[24]；隨著小鼠前脂肪細(xì)胞[51]、豬肌內(nèi)血管干細(xì)胞(IVSC)和皮下血管干細(xì)胞(SVSC)[36]的成脂分化，miR-145的表達(dá)量顯著上調(diào)，表明miR-145可能調(diào)控脂肪細(xì)胞發(fā)育和脂肪形成。隨后Y.Guo等[52]首先利用“天花板”法培養(yǎng)豬的去分化前脂肪細(xì)胞(DFAT)，再將轉(zhuǎn)染ssc-miR-145慢病毒載體的DFAT細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，觀察miR-145對(duì)DFAT細(xì)胞成脂分化程度的影響。結(jié)果表明，隨著DFAT細(xì)胞的分化，miR-145的表達(dá)量逐漸升高。脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中上調(diào)表達(dá)的miRNA可促進(jìn)脂肪形成。此研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-145抑制成脂關(guān)鍵基因(C/EBPα和PPARγ2)的表達(dá)和脂滴積累，蛋白印跡和熒光素酶試驗(yàn)證明胰島素信號(hào)通路關(guān)鍵基因IRS1是miR-145的直接靶標(biāo)，miR-145可能通過(guò)靶向IRS1基因阻斷胰島素信號(hào)通路對(duì)成脂的促進(jìn)作用。

4.6 miR-181

前期研究顯示，miR-181在小鼠前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)量顯著升高[51]；在高脂日糧飼喂的牛背部皮下和腎周脂肪組織中，miR-181的表達(dá)量顯著下調(diào)，暗示miR-181可能調(diào)控脂肪形成[41]。隨后H.Li等[53]對(duì)miR-181調(diào)控豬脂肪細(xì)胞發(fā)育的功能進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，超表達(dá)miR-181上調(diào)豬前脂肪細(xì)胞中脂肪合成相關(guān)基因(PDE3B、LPL、PPARγ、GLUT1、GLUT4、adiponectin和FAS)的表達(dá)、加速脂滴積累、增加甘油三酯含量；且TNF-α是miR-181的靶基因，過(guò)表達(dá)TNF-α能夠拮抗miR-181的促成脂作用。因此，筆者認(rèn)為miR-181通過(guò)靶向TNF-α基因，調(diào)控下游脂肪相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而參與調(diào)控脂肪形成。

4.7 miR-33b

最新的研究結(jié)果顯示[54]，miR-33b靶向成脂激活因子EBF1，抑制脂肪標(biāo)記基因(C/EBPα、PPARγ、ap2、CD36、adiponectin、SCD1和FAS)的表達(dá)，推遲豬前脂肪細(xì)胞的成脂分化，抑制甘油三酯的生成和脂滴積累[54]。此外，研究者以5月齡瘦肉型長(zhǎng)×(杜長(zhǎng)大)和脂肪型梅山×(杜長(zhǎng)大)雜交母豬為研究對(duì)象，對(duì)背膘厚、血液甘油三酯含量和皮下脂肪組織中的miR-33b、成脂基因的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，miR-33b在瘦肉型雜交豬中高表達(dá)，其他測(cè)定基因則在脂肪型雜交豬中高表達(dá)，這也間接支持了miR-33b抑制脂肪形成這一研究結(jié)果。然而，在豬前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中和瘦肉型、脂肪型雜交豬皮下脂肪組織中，miR-33b宿主基因SREBF1的表達(dá)幾乎沒(méi)有差異，這與miR-33b的表達(dá)趨勢(shì)不一致，也與人中的研究結(jié)果截然不同[55]，這可能與研究的物種和組織的不同有關(guān)。研究也已證實(shí)，miR-33a/b協(xié)同宿主基因SREBP共同調(diào)控膽固醇輸出及轉(zhuǎn)運(yùn)、脂肪酸代謝和胰島素信號(hào)通路[56-57]。此外，作者還發(fā)現(xiàn)，豬C/EBPα和PPARγ基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在轉(zhuǎn)錄因子EBF1的結(jié)合位點(diǎn)，然而轉(zhuǎn)錄因子EBF1是否結(jié)合并調(diào)控C/EBPα和PPARγ基因的轉(zhuǎn)錄以及miR-33b是否調(diào)控豬膽固醇代謝仍值得深入研究。

4.8 miR-199a-5p

X.E.Shi等[58]發(fā)現(xiàn)，miR-199a-5p在豬皮下脂肪組織中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于心、肝、脾、肺、腎和肌肉，且其在豬前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，這與小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中miR-199a-5p的表達(dá)模式是一致的[59]。另外，miR-199-5p在7日齡榮昌仔豬背部脂肪組織中的表達(dá)量顯著高于240日齡榮昌大豬[24]。這些都表明，miR-199a-5p可能在豬皮下脂肪組織中發(fā)揮功能。進(jìn)一步的研究顯示，miR-199a-5p促進(jìn)豬前體脂肪細(xì)胞的增殖，抑制成脂標(biāo)記基因(PPARγ、ap2、perilipinA、LPL和FAS)的表達(dá)和脂滴的積累。miR-199a-5p的這種生理功能可能是通過(guò)靶向Cav1介導(dǎo)調(diào)控PI3K/Akt通路和脂滴的轉(zhuǎn)運(yùn)、貯存來(lái)實(shí)現(xiàn)的[58]。此外，在人骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中，miR-199a的表達(dá)量顯著下調(diào)，在干細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-199a可以抑制成脂標(biāo)記基因FABP4的表達(dá)[60]，這與miR-199a-5p在豬中的研究結(jié)果相符。

4.9 miR-130b和miR-374b

早在2010年，E.K.Lee等[61]對(duì)miR-130在人和小鼠前脂肪細(xì)胞中的功能進(jìn)行了系統(tǒng)研究。試驗(yàn)證明，miR-130a/b靶向成脂關(guān)鍵基因PPARγ，抑制leptin、adiponectin、LPL和FABP4等脂肪標(biāo)記基因的表達(dá)，從而阻礙脂肪細(xì)胞分化和甘油三酯積累。直到2013年，科研人員首次在豬中對(duì)miR-130調(diào)控脂肪的形成進(jìn)行功能研究。S.Pan等[62]利用低蛋白日糧飼喂妊娠期和哺乳期梅山母豬來(lái)研究miRNAs對(duì)后代仔豬脂質(zhì)代謝的影響。結(jié)果表明，低蛋白日糧組斷奶仔豬的體重和背膘厚顯著低于標(biāo)準(zhǔn)蛋白日糧組，背脂中miR-130b和miR-374b的表達(dá)量顯著高于標(biāo)準(zhǔn)蛋白日糧組，且miR-130b和miR-374b分別靶向抑制PPARγ和C/EBPβ基因的表達(dá)。隨后該學(xué)者又將miR-130b包裝進(jìn)入微泡，并用此微泡處理豬前脂肪細(xì)胞(即受體細(xì)胞)，同時(shí)進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，受體細(xì)胞能夠超表達(dá)miR-130b；miR-130b通過(guò)靶向PPARγ下調(diào)脂肪形成基因(FAS、perilipin、FTO和GR)的表達(dá)、促進(jìn)脂解基因(HSL)的表達(dá)，從而抑制豬脂肪細(xì)胞中甘油三酯形成[63]，這為治療糖尿病的臨床應(yīng)用提供了新的方法和思路。

2013年，S.Pan課題組的研究發(fā)現(xiàn)，地塞米松(DEX)促進(jìn)豬前脂肪細(xì)胞PPARγ的表達(dá)和脂肪形成，且地塞米松處理的細(xì)胞中miR-374a和miR-374b的表達(dá)上調(diào)，而C/EBPβ基因的表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步分析證實(shí)C/EBPβ為miR-374a/b的靶基因[64]，這與其另一項(xiàng)研究報(bào)道[62]相符。然而在其他物種中，miR-374調(diào)控脂肪形成的研究并未見報(bào)道，僅見miR-374表達(dá)差異的研究，如miR-374a/b在高脂日糧飼喂的牛背部皮下和腎周脂肪組織中的表達(dá)量顯著上調(diào)[41]、miR-374b在人成熟脂肪細(xì)胞中的表達(dá)量顯著降低[61]。因此，miR-374a/b對(duì)前脂肪細(xì)胞的成脂分化和脂肪形成的調(diào)控作用仍值得繼續(xù)深入探討。

5 豬脂肪相關(guān)miRNAs功能研究的不足與問(wèn)題

由以上可以看出，近幾年科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的miRNAs調(diào)控豬的脂肪形成及代謝，但是其功能研究仍存在許多不足之處：①大多脂肪相關(guān)miRNAs的功能研究在人或小鼠中已經(jīng)報(bào)道，在豬中只是簡(jiǎn)單的重復(fù)；②只是研究miRNAs對(duì)脂肪細(xì)胞分化和脂肪形成的作用，并沒(méi)有對(duì)其具體的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入分析，即只停留在“表象”，沒(méi)有深入到“本質(zhì)”；③即使對(duì)miRNAs的調(diào)控機(jī)制和作用靶基因進(jìn)行論證，但試驗(yàn)設(shè)計(jì)并不嚴(yán)謹(jǐn)。人們知道同一miRNA可靶向作用多個(gè)靶標(biāo)，只通過(guò)蛋白印跡和雙熒光素酶試驗(yàn)并不能說(shuō)明miRNA就是通過(guò)此基因來(lái)介導(dǎo)調(diào)控脂肪形成。如果再增加補(bǔ)償試驗(yàn)(在超表達(dá)miRNA的基礎(chǔ)上過(guò)表達(dá)靶基因)將會(huì)更有說(shuō)服力。因此，與小鼠中相比，豬中脂肪相關(guān)miRNAs的功能研究并不徹底，仍值得繼續(xù)深入研究。

另外，利用傳統(tǒng)方法分離得到的豬脂肪基質(zhì)微管中除含有前脂肪細(xì)胞外，還存在大量的血紅細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。此種方法獲得的豬前脂肪細(xì)胞的純度不高，需要經(jīng)過(guò)其他方法去除這些雜細(xì)胞，程序繁雜，且不利于精細(xì)研究前脂肪細(xì)胞的分化機(jī)制。本課題組在實(shí)際操作過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)分離的豬前脂肪細(xì)胞貼壁較少，增殖速度慢，易自分化形成脂滴，且消化傳代后細(xì)胞易變形。這些都局限了豬前脂肪細(xì)胞分化和脂肪形成的研究，堪稱豬脂肪相關(guān)miRNAs功能研究的“瓶頸”。而依靠“天花板”法建立的高純度、高分化率、低成本的豬前脂肪細(xì)胞系或許可作為一種商品化的細(xì)胞系，為進(jìn)一步揭示脂肪細(xì)胞分化和脂肪形成機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

6 展 望

豬的脂肪蓄積能力極強(qiáng)，比嚙齒類動(dòng)物更適合于哺乳動(dòng)物脂肪組織發(fā)育的研究[13，65-66]，并且豬在親緣關(guān)系上比小鼠更接近人類，在生理學(xué)、解剖學(xué)和病理學(xué)等方面與人類極其相似[67-68]。因此，豬逐漸成為生物和醫(yī)學(xué)研究的重要模式生物。隨著研究的不斷深入，今后的研究重心勢(shì)必將從豬miRNAs的挖掘鑒定轉(zhuǎn)向其功能探索，進(jìn)一步分析闡釋miRNAs發(fā)揮作用的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和信號(hào)通路。相信不久以后，miRNAs將在調(diào)控豬生長(zhǎng)發(fā)育和改良肉質(zhì)性狀等方面具有突破性進(jìn)展，同時(shí)也為肥胖和糖尿病等相關(guān)疾病的藥物研發(fā)提供新的思路。

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(編輯 郭云雁)

Progress on the Research of miRNAs Associated with Fat Development in Pigs

CHEN Chen*，HU Xiong-gui，ZHU Ji，REN Hui-bo，DENG Yuan，PENG Ying-lin*

(HunanInstituteofAnimalandVeterinaryScience，Changsha410131，China)

Adipose tissue，an important factor that affects the porcine carcass quality，is closely related with the pork quality.Understanding the regulation mechanisms of adipose tissue development and fat metabolism are important to the animal husbandry production and disease treatment.miRNAs(microRNAs) are a class of endogenous，non-coding，small RNA molecules，which are typically 18-24 nucleotides(nt) in length.miRNAs play an important role in the regulation of gene expression at the post-transcriptional level.A large number of evidences demonstrated that miRNAs have influence on diverse biological processes，such as preadipocyte differentiation，adipogenesis，fatty acid metabolism and cholesterol biosynthesis.However，only 326 porcine miRNAs has been currently reported and rare studies could be read about the porcine miRNAs that regulate the fat development.Herein，it is reviewed that the studies on the discovery and identification of fat-associated miRNAs in pigs in this paper，and the progress on the research of porcine miRNAs that regulate fat development are also summarized.

pig；fat development；miRNAs；regulation mechanism

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.001

2014-06-09

國(guó)家自然科學(xué)基金(31401097)；湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014NK3036)

陳 晨(1986-)，男，河南開封人，助理研究員，博士，主要從事豬分子遺傳育種的研究，Tel：0731-84611058

*通信作者：陳 晨，助理研究員，E-mail：2004chch@163.com；彭英林，研究員，E-mail：ylpeng_1965@163.com

S828；S813.3

A

0366-6964(2015)12-2117-10