鄭寬瑜，吳 闊，董家紅，方 琦，張仲凱

（云南省農業(yè)科學院生物技術與種質資源研究所，云南省農業(yè)生物技術重點實驗室，農業(yè)部西南作物基因資源與種質創(chuàng)制重點實驗室，昆明 650223）

萵苣（Lactucasativa），屬于菊科萵苣屬，是一種很常見的食用蔬菜。在云南種植的萵苣類蔬菜主要有生菜（LactucasativaL.var.ramosaHort.）、油麥菜（LactucasativaL.var.longifoliaLam.）、萵筍（LactucasativaL.var.angustanaIrish）。生菜和油麥菜經濟價值高，生長快，每年種植8～11茬，給農戶帶來豐碩的經濟效益。近年來由于病毒病的感染，嚴重地威脅著萵苣類蔬菜的生產。

番茄斑萎病毒屬（Tospovirus）屬于布尼亞病毒科（Bunyaviridae），其代表種番茄斑萎病毒（Tomato spottedwiltvirus，TSWV）是目前已知寄主范圍最廣的植物病毒，能侵染從單子葉到雙子葉的70個科925種以上的植物，包括番茄、煙草、辣椒、萵苣、馬鈴薯、花生、豌豆、菊花等重要經濟作物和園藝作物，造成嚴重危害［1-2］。Tospovirus病毒粒體為球形，直徑約80～100nm，具有雙層脂膜組成的包膜，表面有鑲嵌在包膜內的糖蛋白突起。該屬病毒基因組為三分體，根據(jù)分子量的大小分別命名為L RNA，M RNA 和S RNA。L RNA為單個開放閱讀框（ORF），編碼病毒復制酶（RdRp）。M RNA 和S RNA 均為雙義RNA，有2個ORFs，通過基因間區(qū)IGR 反向相連。M RNA 病毒鏈編碼運動蛋白（NSm），互補鏈編碼Gn／Gc前體蛋白，Gn／Gc蛋白與薊馬傳播特性及病毒侵入寄主植物相關。S RNA 病毒鏈編碼一個非結構蛋白（NSs），是基因沉默的抑制子，互補鏈編碼核殼體蛋白即N 蛋白［3］。

云南迄今已報道的番茄斑萎病毒屬病毒有TSWV、番茄環(huán)紋斑點病毒（Tomatozonatespotvirus，TZSV）、鳳仙花壞死斑點病毒（Impatiensnecroticspot virus，INSV）、辣椒褪綠病毒（Capsicumchlorosisvirus，CaCV）、花生黃斑病毒（Groundnutyellowspotvirus，GYSV）、朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒（Hippeastrumchlorotic ringspotvirus，HCRV）、馬蹄蓮褪綠斑點病毒（Calla lilychloroticspotvirus，CCSV）等6種病毒，能侵染番茄、辣椒、煙草、花卉等作物［4-9］。番茄斑萎病毒屬病毒由薊馬傳播，云南作為斑萎病發(fā)生區(qū)，傳毒薊馬有西花薊馬［Frankliniellaoccidentalis（Pergande）］、棕櫚薊馬（ThripspalmiKarny）、煙薊馬（ThripstabaciLindeman）、花薊馬［Frankliniellaintonsa（Trybom）］、番茄角薊馬［Ceratothripoidesclaratris（Shumsher）］［10-12］。

自2008年以來，云南種植的萵苣類蔬菜上發(fā)現(xiàn)疑似病毒病植株。田間調查發(fā)現(xiàn)，生長期較短的生菜和油麥菜（平均25d左右），發(fā)病率普遍為15%～20%，較嚴重的達到60%以上；生長期較長的萵筍，部分地塊發(fā)病率達90%上，造成絕產絕收。為確定感染萵苣類蔬菜的病毒毒原，作者通過電子顯微鏡觀察、回接試驗、血清學檢測、病毒基因分析等方法對樣品進行了研究。

1 材料與方法

1.1 病毒樣品及分離物

感病的56份蔬菜樣品包括：30個生菜樣品，分別采自晉寧、嵩明、石林、呈貢、瀘西；18 個萵筍樣品，分別采自瀘西、嵩明、新平；8個油麥菜樣品，采自嵩明。病毒嵩明萵筍分離物（SM-Lettuce）經枯斑寄主昆諾黎單斑分離后機械接種保存于本生煙和黃煙上。病毒也被回接到生菜和油麥菜上。

1.2 電子顯微鏡觀察

取具有典型癥狀的感病組織0.1g，加入100 μL 2.5%的戊二醛，用刀片切碎直至植物汁液溢出。用Formvar膜覆蓋的銅網(wǎng)吸附植物汁液，5 min 后用濾紙吸干銅網(wǎng)上的汁液，2%鉬酸銨負染色3min，置于JEM100CX-Ⅱ型透射電鏡下觀察病毒粒體形態(tài)特征［13］。將病樣組織切成1mm×1mm×3mm的組織塊，浸入2.5%的戊二醛固定液中于4 ℃固定12h，0.2mol／L PBS（pH7.2）淋洗后，浸入1%的OsO4中固定2h，經乙醇梯度脫水后，Epon812環(huán)氧樹脂包埋，AO 超薄切片機切片，5% 檸檬酸鉛和1%醋酸雙氧鈾染色，置于JEM100CX-Ⅱ透射電子顯微鏡觀察細胞病理切片［14］。

1.3 ELISA 檢測

根據(jù)癥狀和病毒粒子形態(tài)特征，初步判定病毒分離物為番茄斑萎病毒屬成員。進一步應用購自美國Agdia公司的番茄斑萎病毒（TSWV）以及自制的番茄環(huán)紋斑點病毒（TZSV），參照ELISA 試劑盒說明書，進行DAS-ELISA 檢測。

1.4 RT-PCR擴增、克隆、測序、分析

根據(jù)DAS-ELISA 檢測結果，選擇嵩明萵筍SM-Lettuce，新平萵筍XP-Lettuce，瀘西萵筍LXLettuce-1、LX-Lettuce-2，用購自Invitrogen的TRIzol提取總RNA。采用RT-PCR兩步法對病毒N基因序列（引物序列 TSWV-FR：ATCGGATCCATGTCTAAGGTTAAGCTCAC；TSWV-NR：ATCCTCGAGTTAAGCAAGTTCTGCAAGTTTTGC）進行擴增。第一鏈cDNA合成反應體系為20μL，將總RNA 12 μL和1μL100nmol／L引物混合，70 ℃預變性10min后，迅速插入冰上5min，加入5×RT Buffer 4μL，10mmol／L dNTP 2μL，5 U／μL M-MLV Reverse Transcriptase（Promega）1μL，40U／μL RNase Inhibitor 1μL，42℃延伸90min。PCR 反應條件為：94℃預變性5min；94 ℃變性45s，55 ℃退火45s，72 ℃延伸1min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析后，切取目標條帶，用DNA 回收試劑盒（Sangon）回收，然后連接到pGEMT Easy載體（Promega）上，轉化大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α，涂布含有氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基上，篩選陽性克隆。送華大基因公司測序。利用DNAMAN 5.0 進行序列處理、分析。進化樹構建采用MEGA 5.05軟件，以NJ（neighbor-joining）方法構建，進化樹各分支的可信度用Bootstrap檢測（1000次重復）。用于序列比較分析的TSWV 核衣殼蛋白基因序列（N基因序列）來自GenBank，序列注冊號如下：韓國紅椒分離物TSWV-KDRP（EF195230）、云南番茄分離物TSWV-KM（HQ402595）、韓國紅椒分離物TSWV-Ghae（HQ260977）、新西蘭萬壽菊分離物TSWV-MAF02（KC494482）、云南番茄分離物TSWVYN（JF960235）、日本菊花分離物TSWV-Tospo-C（AB038341）、巴西番茄分離物TSWV-BR01（D00645）、新西蘭鳳仙花分離物TSWV-MAF09（KC494488）。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀

疑似病毒病植株，通常心葉先顯癥，葉片由棕黃色逐漸變?yōu)楹谏?，隨后老葉開始出現(xiàn)褪綠斑，后期形成壞死斑。若在苗期或移栽后即感染病毒，植株表現(xiàn)為生長緩慢，嚴重矮化，最后整個植株死亡（圖1）。

圖1 田間萵筍和生菜感染TSWV癥狀Fig.1 Symptoms of TSWV on Lactuca sativa L.var.angustanaIrish and Lactuca sativa L.var.ramosa Hort.in the field

2.2 電子顯微鏡觀察結果

經鉬酸銨負染色制樣后電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，病樣粗汁液中含有較典型的球形病毒粒體，直徑約80～100nm，未檢測到其他形態(tài)的病毒粒體（圖2a）。超薄切片電鏡觀察發(fā)現(xiàn)細胞中含有典型球形病毒粒體，病毒粒體具包膜，直徑80～85nm，其形態(tài)與報道的Tospovirus病毒粒體相似［5］，有囊膜包裹的病毒粒體聚集體分布于細胞質內（圖2b）。

圖2 侵染萵筍的TSWV病毒粒子電鏡照片F(xiàn)ig.2 Electron micrographs of viral particles from TSWV infected L.sativa L.var.angustanaIrish

2.3 序列分析

ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，56個樣品中，有53個樣品與TSWV抗體呈陽性反應，與TZSV 抗體呈陰性反應，其余3個紅河瀘西的萵筍樣品與TZSV 抗體呈陽性反應。根據(jù)樣品采集地點選擇嵩明萵筍SM-Lettuce，新平萵筍XP-Lettuce，瀘西萵筍LX-Lettuce-1、LXLettuce-2樣品進行了RT-PCR擴增目的片段回收、克隆和測序。結果表明，擴增獲得777個堿基的片段，該序列編碼258個氨基酸。NCBI網(wǎng)站BLAST 分析發(fā)現(xiàn)萵苣類蔬菜與報道的TSWV 番茄分離物核苷酸同源性為99%～100%。表明感染萵苣類蔬菜的病毒主要是TSWV。將云南萵苣類蔬菜上的TSWV 與部分國內外的TSWV 的核殼體蛋白氨基酸序列繪制成系統(tǒng)發(fā)生進化樹，進化樹表明云南的4個萵筍分離物與云南番茄分離物TSWV-KM HQ402595、TSWVYN JF960235，以及韓國的2個辣椒分離物TSWVKDRP EF195230、TSWV-Ghae HQ260977 聚在同一分支（圖3）。云南TSWV 萵苣分離物和TSWV 番茄分離物同源性最高，結果說明感染云南萵苣和番茄的TSWV屬于同一分離物，沒有發(fā)生變異。

圖3 TSWV 不同分離物N 蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of different TSWV isolates based on the deduced amino acid sequence of the N protein

3 討論

萵苣類蔬菜是一類常用的食用蔬菜，病毒病害常常是其主要威脅，國外報道了10余種感染萵苣的病毒［15-16］。國內報道感染萵苣類蔬菜的病毒有萵苣花葉病毒、黃瓜花葉病毒、蒲公英黃花葉病毒［17］。萵苣花葉病毒屬于馬鈴薯Y 病毒屬病毒，病毒粒子為線狀，大小為11nm×720nm；黃瓜花葉病毒、蒲公英黃花葉病毒粒子均呈球形，直徑30nm。本試驗電鏡觀察到的病毒粒子為80～100nm，血清學檢測結果表明，病樣汁液能與TSWV 抗體呈陽性反應，結果表明危害云南萵苣類蔬菜的病毒主要為TSWV，只有采自瀘西的3個生菜樣品被TZSV 感染。從萵筍上的病毒分離物接種回接萵筍、生菜、油麥菜，能產生與田間相同的癥狀。

調查發(fā)現(xiàn)病田傳毒薊馬主要為西花薊馬［10］。西花薊馬自2000年首次在昆明國際花卉節(jié)緬甸參展的盆景上檢測到，隨后2003年在北京發(fā)現(xiàn)，近年已在全國許多地方發(fā)現(xiàn)［18-19］。因西花薊馬是TSWV 高效傳播介體，由其傳播的TSWV自2008年以來在云南、山東、北京等地廣泛發(fā)生危害［4，20-21］。

對病田周圍中間寄主調查發(fā)現(xiàn)，田間雜草鬼針草帶毒率較高，其次為苦苣菜，初侵染為苗期薊馬從鬼針草等帶病雜草或作物上傳入，移栽后，除從鬼針草等帶病雜草或作物上傳入，如果防控措施不到位，二次侵染也是重要的傳播方式。

因目前缺少抗病品種，當前對萵苣類蔬菜上發(fā)生的番茄斑萎病毒病害的管理應該采取“綜合防控，預防為主”的措施。預先除草殺蟲，苗床及田塊周邊避免種植易感作物，掛放西花薊馬有偏好的藍色粘板，根據(jù)薊馬種群動態(tài)及時噴施殺蟲劑。

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