董 娜，李 淦，張亞娟，任翠翠，茹振鋼

（河南科技學(xué)院小麥中心，河南省高等學(xué)校作物分子育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，新鄉(xiāng) 453003）

小麥白粉病是由專性寄生真菌Erysiphegraminisf.sp.tritici引起的世界性病害，各主要產(chǎn)麥國(guó)均有分布。20世紀(jì)70年代以來，隨著麥田肥水條件的改善及高產(chǎn)田群體密度加大，我國(guó)由小麥白粉病危害造成的損失日益嚴(yán)重。一般年份小麥白粉病可使小麥減產(chǎn)5%～19%，嚴(yán)重危害時(shí)可減產(chǎn)30%［1-2］。

選育和推廣抗病小麥品種是防治小麥白粉病最為經(jīng)濟(jì)、有效和環(huán)保的措施。目前，已在小麥基因組的41個(gè)位點(diǎn)鑒定出了57個(gè)主效抗白粉病基因，其中包括22個(gè)復(fù)等位基因，并將一部分有效抗病基因轉(zhuǎn)育到栽培品種中［3］。然而，由于白粉菌生理小種變異快、群體組成復(fù)雜，抗病基因會(huì)因?yàn)榘追鄄【玖︻l率變化或新的毒力型的出現(xiàn)而喪失抗性，例如，Pm1、Pm3a、Pm3b、Pm3c、Pm3f、Pm5、Pm7、Pm8等抗病基因已在中國(guó)喪失抗性，最近幾年，Pm4a在中國(guó)大部分地區(qū)也基本喪失抗性［4］。而來源于簇毛麥的Pm21對(duì)現(xiàn)有的白粉菌生理小種均表現(xiàn)免疫，在不同小麥遺傳背景下抗病性表現(xiàn)穩(wěn)定，是目前已知抗白粉病基因中最好的抗病基因［5-7］。來源于高大山羊草的抗白粉病基因Pm13，在普通小麥的遺傳背景條件下也能完全表達(dá)其抗性，表現(xiàn)中至高抗［4，8-9］。作為優(yōu)異的抗病基因資源，Pm21和Pm13正在成為育種工作者關(guān)注的重點(diǎn)。

因此，本研究利用與抗白粉病基因Pm21 和Pm13共分離的分子標(biāo)記SCAR1400［6］和SCAR564［10］，對(duì)河南科技學(xué)院小麥中心收集的354份小麥種質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，了解現(xiàn)有育種材料中抗性基因Pm21 和Pm13的分布狀況，以期為小麥抗白粉病材料的合理利用以及抗白粉病基因聚合育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料種植及白粉病抗性調(diào)查

354份小麥種質(zhì)由河南科技學(xué)院小麥中心收集和保存，其中河南省各育種單位育成的品種或品系118份，其余236份為從全國(guó)多個(gè)麥區(qū)收集到的育成品種或品系。所有小麥種質(zhì)于2013年秋播種于河南科技學(xué)院小麥中心位于新鄉(xiāng)市輝縣的種質(zhì)圃中，每份種質(zhì)均播種兩行，畦埂上種誘發(fā)行（‘石家莊8號(hào)’），常規(guī)田間管理，第二年春季小麥返青后取樣檢測(cè)。白粉病為田間自然發(fā)病，于小麥灌漿中期調(diào)查不同品種上白粉病的發(fā)病嚴(yán)重度，病級(jí)劃分按照盛寶欽等［11］的0～9級(jí)法。其中0和0；為免疫，1～2級(jí)為高抗，3～4級(jí)為中抗，5～6級(jí)為中感，7～8級(jí)為高感，9級(jí)為極感。

1.2 引物的合成

文中所用的分子標(biāo)記引物由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，序列見表1。

表1 試驗(yàn)用分子標(biāo)記及序列Table 1 Markers and their sequences used in this study

1.3 基因組DNA 提取

取小麥幼苗葉片0.2g左右放入1.5mL離心管中，液氮研磨后，采用CTAB 法［12］提取基因組DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取效果。

1.4 標(biāo)記檢測(cè)

PCR擴(kuò)增于ABI Gene Amp PCR System 9700型PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系20μL，包括2×TaqMaster Mix（購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）10μL，10μmol／L特異引物各0.5μL，模板DNA50～100ng，余下用ddH2O 補(bǔ)足。SCAR1400的擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；94℃變性50s、55℃退火50s、72℃延伸2min，36個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10min，4 ℃保存；SCAR564的擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5min；94 ℃變性50s、55℃退火50s、72℃延伸50s，36個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠（含goldview染料），110V下電泳40min左右，然后利用凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果并拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pm21基因的分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

利用與Pm21基因共分離的標(biāo)記SCAR1400檢測(cè)該基因在354份種質(zhì)中的分布情況，含有Pm21基因的材料可擴(kuò)增出大小為1400bp的目標(biāo)條帶（圖1）。在檢測(cè)的354份材料中有21份材料能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的DNA 條帶，說明這21份材料中含有Pm21基因，檢出率為5.9%。其余333份材料中均未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，說明這些材料中不含Pm21基因。攜帶Pm21 基因的21 份材料分別為：‘石H083-366’、‘BH50890-1-1’、‘06Y06’、‘南農(nóng)02Y393’、‘09P80’、‘09P131’、‘09P283’、‘黔麥18 號(hào)’（‘黔0205’）、‘黔早麥15-3’、‘黔979-1’、‘黔9963-3’、‘黔9961-2’、‘YN06’、‘綿 雜 麥168’（‘ML2651’）、‘MR168’、‘09品A6’、‘09品E6’、‘內(nèi)麥836’、‘內(nèi)麥9號(hào)’、‘綿陽39’和‘綿麥367’（‘綿陽06-367’）。其中‘內(nèi)麥836’、‘內(nèi)麥9號(hào)’、‘綿麥367’和‘綿雜麥168’為國(guó)審品種，‘黔麥18號(hào)’為貴州省審定品種，其余16份為育種中間材料或育成品系。這21份種質(zhì)搜集于9個(gè)育種單位，部分種質(zhì)原育種單位提供有雜交組合來源，成株期白粉病抗性調(diào)查結(jié)果表明，攜帶Pm21的種質(zhì)對(duì)白粉病菌表現(xiàn)免疫（表2）。

圖1 Pm21基因的分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果Fig.1 PCR pattern amplified by SCAR marker of Pm21

表2 攜帶Pm21或Pm13種質(zhì)的來源及對(duì)白粉病抗性Table 2 Sources and powdery mildew resistance of wheat germplasms carrying Pm21or Pm13

2.2 Pm13基因的分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

用于檢測(cè)Pm13 基因的是與之共分離的標(biāo)記SCAR564，含有Pm13的材料可擴(kuò)增出大小為564bp的特異性條帶（圖2）。結(jié)果表明，在檢測(cè)的354份材料中只有1份材料‘中大01’能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的DNA條帶，說明‘中大01’含有Pm13，檢出率為0.28%。而其余353份材料中均未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，說明這些材料中均未攜帶該基因。在檢測(cè)的354份材料中僅有一份攜帶有Pm13基因，檢出率極低，可能是因?yàn)樵摶蚰壳霸谟N中利用較少，而且本研究檢測(cè)的種質(zhì)材料數(shù)量也相對(duì)有限。另外，從電泳圖上可看到明顯的引物二聚體條帶，可能跟引物設(shè)計(jì)質(zhì)量、反應(yīng)體系中引物濃度及退火溫度有關(guān)。田間鑒定結(jié)果表明，攜帶Pm13的種質(zhì)‘中大01’對(duì)白粉病菌表現(xiàn)高抗（表2）。

圖2 Pm13基因的分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果Fig.2 PCR pattern amplified by SCAR marker of Pm13

2.3 Pm21和Pm13的分布情況

本研究檢測(cè)的354份種質(zhì)資源收集于全國(guó)16個(gè)省、自治區(qū)或直轄市，其中河南省最多，有118份，其次為陜西、江蘇、山東和北京等地。不同來源的種質(zhì)中，Pm21和Pm13的分布極不平衡。攜帶Pm21的種質(zhì)有21份，分布于四川、江蘇等6省，其中四川來源的攜帶Pm21的種質(zhì)數(shù)量最多，有8份，占該地檢測(cè)種質(zhì)總數(shù)的32%，其次為江蘇和貴州，各有5份，分別占各自檢測(cè)總數(shù)的13.5%和71.4%，陜西、河北和云南的材料中各有1份，分別占2.4%、3.2%和25%。攜帶Pm21的5個(gè)審定品種‘內(nèi)麥836’、‘內(nèi)麥9號(hào)’、‘綿麥367’、‘綿雜麥168’和‘黔麥18號(hào)’分別來自四川和貴州，均屬西南冬麥區(qū)品種，在小麥主產(chǎn)區(qū)的河南、山東等省育成的品種（系）中，均未檢測(cè)到Pm21的分布。在這354份種質(zhì)中，只有來自河南的小麥品系‘中大01’攜帶Pm13，其余353份材料中均未檢測(cè)到該基因的分布，而且未檢測(cè)到同時(shí)攜帶這兩個(gè)基因的種質(zhì)材料（表3）。

表3 354份種質(zhì)中Pm21和Pm13的分布情況Table 3 Distribution of Pm21and Pm13among 354wheat germplasms

3 討論

抗病基因種質(zhì)資源的有效評(píng)價(jià)是抗病育種的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)抗病性鑒定主要是通過田間或室內(nèi)接種，根據(jù)小麥對(duì)病原的反應(yīng)型進(jìn)行判斷，由于小麥抗病性涉及兩種生物的互作，其反應(yīng)型易受接種方法、環(huán)境條件和發(fā)育時(shí)期等因素的影響，因此效率低、可靠性差。以PCR 為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)可從DNA 水平對(duì)種質(zhì)材料的基因型進(jìn)行直接鑒定，具有操作簡(jiǎn)便、快速且不受環(huán)境條件影響等優(yōu)點(diǎn)，為抗病基因檢測(cè)提供了有效手段［13］。

SCAR1400和SCAR564是分別與Pm21 和Pm13共分離的以PCR 為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，在輔助育種中已有較多的應(yīng)用［14-17］。張?jiān)銎G等［15］利用小麥抗白粉病基因Pm4、Pm13和Pm21的特異性PCR 標(biāo)記對(duì)含有Pm4b、Pm13、Pm21的小麥品系復(fù)交F2代進(jìn)行檢測(cè)，從中選擇出含有聚合Pm4b＋Pm21＋Pm13、Pm4b＋Pm13、Pm4b＋Pm21 和Pm13＋Pm21的抗病植株。陳濤等［16］利用與抗白粉病基因Pm21和Pm13 連鎖的特異標(biāo)記，在含有抗白粉病基因Pm21和Pm13的雜交F4代群體中進(jìn)行輔助檢測(cè)，從114個(gè)單株中檢測(cè)出4 株同時(shí)具有Pm21和Pm13的特異標(biāo)記。本研究中，利用SCAR1400和SCAR564分別擴(kuò)增出了1400bp 和564bp 的特異DNA 條帶，帶型清晰，與前人研究結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了這些標(biāo)記的高度特異性以及在不同遺傳背景中的穩(wěn)定性，并從354 份種質(zhì)材料中鑒定出攜帶Pm21的材料21份，攜帶Pm13的材料1份，這些材料可作為抗白粉病育種的重要親本資源。

在檢測(cè)的354份種質(zhì)中，Pm21和Pm13的分布極不平衡，僅有‘中大01’攜帶Pm13，其余353份種質(zhì)中均未檢測(cè)到該基因；攜帶Pm21的有21份，但大部分為育種中間材料或育成品系，只有‘內(nèi)麥836’、‘內(nèi)麥9號(hào)’、‘綿麥367’、‘綿雜麥168’和‘黔麥18號(hào)’為審定品種，且均屬于長(zhǎng)江上游冬麥區(qū)，在小麥主產(chǎn)區(qū)的河南、山東和安徽等省育成的品種（系）中，則未檢測(cè)到該基因的存在，而且也未檢測(cè)到同時(shí)攜帶這兩個(gè)基因的材料。因此，為了培育持久抗病品種，本課題組正致力于將Pm21 和Pm13 聚合，并轉(zhuǎn)到適于黃淮麥區(qū)的遺傳背景中。

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