漆艷香，張 賀，喻群芳，謝藝賢，張 欣，陸 英，張輝強(qiáng)，蒲金基

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，農(nóng)業(yè)部熱帶農(nóng)林有害生物入侵監(jiān)測(cè)與控制重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，?？?571101）

芒果細(xì)菌性黑斑病是由野油菜黃單胞桿菌芒果致病變種（Xanthomonascampestrispv.mangiferaeindicae，Xcm）引起的細(xì)菌性病害，其病原菌是我國(guó)和世界許多國(guó)家的進(jìn)境植物檢疫有害生物之一。自Doidge［1］首先報(bào)道芒果細(xì)菌性黑斑病在南非發(fā)生以來(lái)，該病相繼在印度、巴西、墨西哥、巴基斯坦、澳大利亞、加納、馬來(lái)西亞、日本等國(guó)發(fā)生［2］。1972年，在我國(guó)臺(tái)灣發(fā)現(xiàn)有該病的分布，隨后在廣東、廣西、云南、海南、福建和四川等省（區(qū)）均有發(fā)生并呈上升趨勢(shì)［3-5］。據(jù)調(diào)查，該病在我國(guó)芒果產(chǎn)區(qū)造成的產(chǎn)量損失一般為15%～30%，嚴(yán)重的可達(dá)50%［6］。目前該病在海南已逐漸成為芒果的第一大葉部和果面病害，嚴(yán)重影響了海南芒果的產(chǎn)量和質(zhì)量，而現(xiàn)有防治效果不甚理想。明確病害的發(fā)生與流行規(guī)律，是制定病害防治方法的重要依據(jù)，但目前有關(guān)海南該病發(fā)生規(guī)律的系統(tǒng)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

芒果細(xì)菌性黑斑病暴發(fā)流行的主要初侵染源是越冬病枝、病葉上的病菌，尤以秋梢上的病菌最為重要。關(guān)于該病原菌在病斑中存活期的研究，國(guó)外有一些報(bào)道，但仍未有一致的定論［7-10］。此外，來(lái)源于土壤、水等其他場(chǎng)所的病原菌，其存活期以及在病害發(fā)生和流行中的作用等尚未見(jiàn)系統(tǒng)的研究報(bào)道。針對(duì)芒果細(xì)菌性黑斑病發(fā)生危害嚴(yán)重、而對(duì)該病流行學(xué)研究基礎(chǔ)薄弱的現(xiàn)狀，本文擬在海南省生態(tài)條件下，對(duì)芒果細(xì)菌性黑斑病病原菌在不同場(chǎng)所的越冬存活情況進(jìn)行研究，以期為制定該病的綜合治理措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

芒果細(xì)菌性黑斑病菌（Xanthomonascampestrispv.mangiferaeindicae，Xcm）野生菌株、抗利福平菌株RifXcm 及芒果感病品種‘貴妃’的離體葉片均由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶果樹(shù)病害課題組提供。

1.2 培養(yǎng)基

Xcm 擴(kuò)大培養(yǎng)基（NA 培養(yǎng)基）：蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，瓊脂18g，雙蒸水1 000mL，121℃濕熱滅菌20min，pH 7.0～7.2。

Xcm 半選擇培養(yǎng)基（KC 培養(yǎng)基）［11］：酵母提取物7g，蛋白胨7g，葡萄糖7g，瓊脂18g，雙蒸水1 000mL，121℃濕熱滅菌20min后，溫度降至50℃左右，依次加入頭孢氨芐40mg／L，春雷霉素20mg／L，丙環(huán)唑20mg／L，pH 7.0～7.2。

1.3 人工接種Xcm

1.3.1 健康芒果葉片上接種Xcm 及Xcm 的保存

取1支在28 ℃活化3d的抗利福平菌株RifXcm 斜面純菌種，用無(wú)菌水配制成1.0×106cfu／mL細(xì)菌懸浮液，供接種用。2013 年8 月12 日取芒果感病品種‘貴妃’的健康葉片（本梢期達(dá)到最大面積時(shí)的新成葉）60片，每片葉進(jìn)行葉背針刺接種，每葉共6個(gè)針刺點(diǎn)。取其中40片用滅菌濾紙圓片（直徑4mm）吸足RifXcm 菌懸液，貼在針刺點(diǎn)上。接菌后的葉片放置在吸水紙保濕的培養(yǎng)皿內(nèi)，2 片／皿，20個(gè)重復(fù)，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)期間保持皿內(nèi)有一定濕度，24h 后除去濾紙片，觀察葉片發(fā)病情況。將發(fā)病的葉片裝入尼龍網(wǎng)袋，20片置于室溫保存，另外20片葉用滅菌吸水紙壓制后置于15 ℃生化培養(yǎng)箱保存。無(wú)菌水接種的20片葉用滅菌吸水紙壓制后也置于15 ℃生化培養(yǎng)箱，作為陰性對(duì)照。定期分離和檢測(cè)葉片病斑里Xcm 的存活情況。

1.3.2 土壤中接種Xcm

將種植過(guò)香蕉、番木瓜等不同來(lái)源的土壤各5 kg均勻混合，用PCR 檢測(cè)［12］確認(rèn)混合土不攜帶Xcm，將混合土裝入潔凈盆缽中，每盆裝土3kg。設(shè)無(wú)病殘?bào)w土壤、有病殘?bào)w土壤（每盆埋入剪碎搗爛的‘貴妃’芒果病葉和病枝條約500g）。2013年8 月12日進(jìn)行人工接種，每盆接種200mL RifXcm 菌液（1.0×106cfu／mL），以不接菌為對(duì)照，淋自來(lái)水保持土壤濕潤(rùn)。將接種后的盆缽置于露天開(kāi)放的自然環(huán)境中，定期澆自來(lái)水保持適宜土壤濕度。定期分離和檢測(cè)土壤里Xcm 的存活情況。

從無(wú)病芒果園采集土壤裝入18支試管中（10g土／支），同時(shí)把其中9支試管濕熱滅菌（121 ℃1h）。2013年8月12日往18支試管中分別加入2mL 菌懸液（1.0×106cfu／mL），室溫保存用于定期分離和檢測(cè)土壤里Xcm 的存活情況，每次各檢測(cè)1 支試管。

1.3.3 水中接種Xcm

2013年8月12 日，用無(wú)菌水將活化后并培養(yǎng)48h的RifXcm 配制成1.0×107cfu／mL 菌液，先取200mL菌液加入已盛有1 800mL水庫(kù)水和自來(lái)水的盆缽，置于露天開(kāi)放的環(huán)境中；取30 mL 加入盛有270mL無(wú)菌水的三角瓶（濕熱高壓滅菌），置于室內(nèi)。定期分離和檢測(cè)水里Xcm 的存活情況。

1.4 Xcm 的分離及存活期檢測(cè)

分別采用直接分離、菌落PCR（Bio-PCR）和常規(guī)PCR 3種方法對(duì)人工接種的Xcm 的存活情況進(jìn)行檢測(cè)，如能直接分離出Xcm，則對(duì)獲得的單菌落進(jìn)行Bio-PCR；若不能直接分離出Xcm，則提取樣品DNA 進(jìn)行常規(guī)PCR 擴(kuò)增。

1.4.1 芒果葉片中Xcm 存活期

定期取人工接種的芒果病葉單個(gè)病斑于研缽中，加5mL無(wú)菌水碾碎后，浸泡0.5h。所獲浸提液以2 000r／min離心8min，取上清液用無(wú)菌水進(jìn)行10倍梯度稀釋，各取50μL均勻涂布于含50μg／mL利福平的KC半選擇性平板上，28 ℃下培養(yǎng)3～4d，觀察RifXcm 菌落生長(zhǎng)情況，并對(duì)獲得的單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)驗(yàn)證。

1.4.2 土壤中Xcm 存活期

定期取人工接種Xcm 的無(wú)病殘?bào)w土壤和有病殘?bào)w土壤各10g于研缽中碾碎后加50mL無(wú)菌水，浸泡1h；定期取滅菌與未滅菌的試管各1支，往每支試管中加入10 mL 無(wú)菌水，浸泡0.5h。所獲浸提液以2 000r／min 離心8min，取上清液用無(wú)菌水進(jìn)行10 倍梯度稀釋，各取50μL 均勻涂布于含50 μg／mL利福平的KC半選擇性平板上，28 ℃下培養(yǎng)3～4d，觀察RifXcm 菌落生長(zhǎng)情況，并對(duì)獲得的單菌落進(jìn)行PCR 檢測(cè)驗(yàn)證。

1.4.3 水中Xcm 存活期

定期取水10mL，用無(wú)菌水進(jìn)行10倍梯度稀釋，各取50μL均勻涂布于含50μg／mL利福平的KC半選擇性平板上，28℃下培養(yǎng)3～4d，觀察RifXcm 菌落生長(zhǎng)情況，并對(duì)獲得的單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)驗(yàn)證。

1.5 Xcm 的PCR 檢測(cè)

分別按植物DNA 小量提取試劑盒（Omega）和PowerSoil DNA Isolation Kit（MoBio）說(shuō)明書提取芒果葉片gDNA、水gDNA 和土壤gDNA。菌落PCR與常規(guī)PCR均采用Xcm 的特異性引物，XcmHF（5′-GGT GGT CGA ACT CGT CGG CAT-3′）／XcmHR（5′-GCC TGC GCC TGG ATC GGT AT-3′）進(jìn)行擴(kuò)增［12］。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為321bp。

擴(kuò)增體系均為25μL：10×PCR buffer（Mg2＋plus）2.5μL，dNTP mixture（各2.5mmol／L）2μL，正向和反向引物各（20μmol／L）各0.5μL，高保真Taq酶（TaKaRa）（5 U／μL）0.2μL，模板DNA（20 ng／μL）1μL，補(bǔ)滅菌雙蒸水至25μL。引物擴(kuò)增條件：94 ℃3 min；94 ℃45s，62 ℃1min，72 ℃1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃5min。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Xcm 在葉片病斑上的存活期

每隔30d對(duì)接種葉片進(jìn)行半選擇性平板直接分離和Bio-PCR 驗(yàn)證，同時(shí)提取葉片DNA 進(jìn)行PCR 檢測(cè)，以確定葉片中Xcm 的存活情況。RifXcm 菌株在含利福平的KC 培養(yǎng)基上菌落乳白色、圓形、輕微凸起、邊緣整齊、黏液狀。分離結(jié)果表明，接種120d后，采用選擇性培養(yǎng)平板能分離出Xcm（表1，圖1），接種150d 后直接分離不到Xcm，180d后室溫保存的葉片用2 種方法都檢測(cè)不到Xcm，而只有低溫保存的葉片gDNA 能檢測(cè)到Xcm（表1，圖2），210d后低溫保存的葉片用常規(guī)PCR檢測(cè)不到Xcm，說(shuō)明Xcm 在葉片病斑內(nèi)常溫下至少存活5 個(gè)月，15 ℃低溫下至少可存活6個(gè)月。

表1 Xcm 在人工接種葉片上的存活期1）Table 1 Survival period of Xcm in mango leaves with RifXcm inoculated

2.2 Xcm 在土壤和水中的存活期

2.2.1 直接分離和Bio-PCR

每隔7d采用直接分離法從人工接種的無(wú)病殘?bào)w土壤、病殘?bào)w土壤、室內(nèi)未滅菌土、滅菌土、水庫(kù)水、自來(lái)水和無(wú)菌水等7種場(chǎng)所中分離Xcm，并用菌落PCR檢測(cè)驗(yàn)證KC半選擇性培養(yǎng)基上獲得的疑似單菌落是否為活的Xcm。結(jié)果表明，接種28d后的無(wú)病殘?bào)w土壤、病殘?bào)w土壤、室內(nèi)未滅菌土和滅菌土中都能分離到Xcm，35d后無(wú)病殘?bào)w土壤和室內(nèi)未滅菌土中均分離不到Xcm，49d后病殘?bào)w土壤中分離不到Xcm，70d后室內(nèi)滅菌土中分離不到Xcm。同樣，接種28d后水庫(kù)水、自來(lái)水及無(wú)菌水中都能分離到Xcm，35d后水庫(kù)水中分離不到Xcm，49d后自來(lái)水中分離不到Xcm，175d后滅菌水中仍能分離到Xcm。

圖1 接菌120d后菌落PCR 檢測(cè)芒果葉片XcmFig.1 Detection of Xcm from mango leaves at 120d after inoculation by colony PCR

圖2 接菌180d后常規(guī)PCR 檢測(cè)芒果葉片XcmFig.2 Detection of Xcm from mango leaves at 180d after inoculation by conventional PCR

2.2.2 PCR 檢測(cè)

由于Xcm 在自然環(huán)境中易受環(huán)境因素和其他微生物的影響，人工模擬接種后，Xcm 在28d后數(shù)量減少，用常規(guī)分離培養(yǎng)方法靈敏度有限，無(wú)法直接分離目標(biāo)菌Xcm，因此，本試驗(yàn)進(jìn)一步選用靈敏度更高的PCR 檢測(cè)方法，用試劑盒提取土壤和水中的細(xì)菌gDNA，用Xcm 特異性引物PCR 檢測(cè)不同場(chǎng)所中Xcm 的存活情況。

從接種后的第35 天起，提取供試土壤gDNA進(jìn)行PCR 檢測(cè)。結(jié)果表明，接種42d后無(wú)病殘?bào)w土壤和室內(nèi)未滅菌土中仍然檢測(cè)到Xcm，在第49天則檢測(cè)不到；在接種含病殘?bào)w的土壤中63d之內(nèi)均能檢測(cè)到Xcm，而室內(nèi)滅菌土在77d之內(nèi)還能檢測(cè)到Xcm，表明Xcm 在病殘?bào)w土壤和室內(nèi)滅菌土存活期稍長(zhǎng)，但也非常有限，分別為49～63d和70～77 d。由此可知，Xcm 在土壤中存活期短，不可能在田間土壤中越冬而成為第2年初侵染源。

從接種后的第35 天起，提取供試水gDNA 進(jìn)行PCR 檢測(cè)，結(jié)果表明，接種42d后，水庫(kù)水檢測(cè)不到Xcm，56d 后自來(lái)水中檢測(cè)不到Xcm，說(shuō)明Xcm 在水庫(kù)水和自來(lái)水中存活期有限，分別為35～42d和49～56d。而在無(wú)菌水中，280d之內(nèi)還能檢測(cè)到Xcm，說(shuō)明Xcm 在無(wú)菌水中至少能存活10個(gè)月。由此可知，Xcm 在自然水中存活期較短，也不可能在田間水中越冬而成為第2年初侵染源。

3 結(jié)論與討論

大量研究表明，控制和清除病害的初侵染源，是植物病害防治的關(guān)鍵技術(shù)之一，因此弄清楚芒果細(xì)菌性黑斑病菌在不同場(chǎng)所中的存活期是十分必要的。本研究通過(guò)人工接種的方法研究了芒果細(xì)菌性黑斑病菌在葉片、土壤和水等場(chǎng)所中的存活時(shí)間，結(jié)果表明，芒果細(xì)菌性黑斑病菌在接種葉片病斑內(nèi)常溫下至少可存活5個(gè)月，15 ℃低溫下至少可存活6個(gè)月。這一研究結(jié)果與前人研究基本一致［7］，他們認(rèn)為“病株病斑內(nèi)的病原菌存活期較長(zhǎng)，是病害發(fā)生發(fā)展的最主要的再浸染源”。此外，由于芒果為常綠果樹(shù)，只要有充足的雨水或灌溉，周年均可抽梢生長(zhǎng)。3-5月抽生的枝梢為春梢，6-8月為夏梢，9-11月為秋梢，12-2月為冬梢，而在海南秋梢是主要結(jié)果母枝。這一研究結(jié)果表明，前一年的秋梢、夏梢葉片病斑內(nèi)的病菌均能安全越冬成為第2 年初侵染源，其中以秋梢病斑內(nèi)的病菌最為重要。

植物病原細(xì)菌單獨(dú)在土壤中的存活期一般是很短的［13］。芒果細(xì)菌性黑斑病菌在無(wú)病殘?bào)w土壤、病殘?bào)w土壤和室內(nèi)未滅菌土存活期均有限，其中以病殘?bào)w土壤存活期稍長(zhǎng)（49～63d），研究結(jié)果與Pruvost ＆Manicom［14］的結(jié)論一致，他認(rèn)為“自然情況下黑斑病菌在土壤中的存活期有限”。因此，年前這些場(chǎng)所的病菌均不能越冬成為翌年的初侵染源。但假若夏季病果園土壤中有一定數(shù)量的病原菌存在，就有可能借雨水濺散至植株枝葉上而成為再侵染源。另外，病菌在水庫(kù)水和自來(lái)水中的存活期分別為35～42d和49～56d，因此來(lái)自病果園的雨后流水（帶菌）流經(jīng)無(wú)病果園時(shí)，有傳病的可能。而有關(guān)芒果細(xì)菌性黑斑病菌在作為主要初侵染源之一的枝條及其他初侵染源如未顯癥葉片及雜草等上的存活期，還有待進(jìn)一步研究。

［1］Doidge E M.A bacterial disease of the mango，Bacillusmangiferaen.sp［J］.Annals of Applied Biology，1915，2（1）：1-45.

［2］中華人民共和國(guó)天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，中華人民共和國(guó)廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局.GB／T 28094-2011，芒果細(xì)菌性黑斑病菌檢疫鑒定方法［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011.

［3］Liao C H.Studies on mango fruit spotⅠ.Symptoms and causal organisms［J］.Journal of Taiwan Agricultural Research，1972，21（2）：146-150.

［4］Liao C H.Studies on mango fruit spotⅡ.Pathogenicity［J］.Bulletin of the Taiwan Agricultural Research Institute，1975（32）：62-66.

［5］文衍堂，黃圣明.芒果細(xì)菌性黑斑病癥狀與病原菌鑒定［J］.熱帶作物學(xué)報(bào)，1994（1）：79-85.

［6］董春，何漢生.芒果細(xì)菌性黑斑病研究進(jìn)展［J］.果樹(shù)科學(xué)，1999，16（S1）：47-51.

［7］Gagnevin L.Analyse de la diversitégénétique deXanthomonaspv.mangiferaeindicaeet sa signification dans le pouvoir pathogène et la biologie de la bactérie［D］.INA P-G，Paris，F(xiàn)rance：Implications dans l’épidémiologie de la maladie des taches noires du manguieràl’?le de la Réunion，1998.

［8］Manicom B Q.Factors affecting bacterial black spot of mangoes caused byXanthomonascampestrispv.mangiferaeindicae［J］.Annals of Applied Biology，1986，109（1）：129-135.

［9］Pruvost O，Couteau A，Verniere C，et al.Epiphytic survival ofXanthomonascampestrispv.mangiferaeindicaeon mango buds［J］.Acta Harticulturae，1993（341）：337-344.

［10］Gagnevin L，Pruvost O.Epidemiology and control of mango bacterial black spot［J］.Plant Disease，2001，85（9）：928-935.

［11］Pruvost O，Roumagnac P，Gaube C，et al.New media for the semi selective isolation and enumeration ofXanthomonascampestrispv.mangiferaeindicae，the causal agent of mango bacterial black spot［J］.Journal of Applied Microbiology，2005，99（4）：803-815.

［12］中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所.NY／T2257-2012，芒果細(xì)菌性黑斑病原菌分子檢測(cè)技術(shù)規(guī)范［S］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2012.

［13］許志剛.普通植物病理學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1997：150-177.

［14］Pruvost O，Manicom B Q.Xanthomonascampestrispv.mangiferaeindicae，cause of bacterial black spot of mangoes［M］∥Swings J G，Civerolo E L.Xanthomonas.London，United Kingdom：Chapman ＆ Hall，1993：91-95.