霍世英，徐玉梅，高俊明＊，王建明，趙增旗

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，太谷 030801；2.新西蘭皇家研究院土地環(huán)境研究所，奧克蘭 1072）

劍線蟲屬（XiphinemaCobb，1913）隸屬于矛線目（Dorylaimida），長(zhǎng)針科（Longidoridae），劍亞科（Xiphinematinae）。劍線蟲作為一類重要的植物外寄生線蟲，可寄生于植物根部，影響根系長(zhǎng)勢(shì)，甚至造成根部腫大或壞死等癥狀。美洲劍線蟲組（Xiphinemaamericanumgroup）屬于劍線蟲屬，在我國(guó)北京、山東、浙江等多省市都有報(bào)道，為我國(guó)分布最廣泛的劍線蟲屬內(nèi)種群，但美洲劍線蟲組內(nèi)部分種間的差異非常小，甚至交叉重疊，rDNA 序列的相似性很高，其有效種數(shù)量存在爭(zhēng)議，如Lamberti等［1］認(rèn)為有49個(gè)有效種，Luc等［2］認(rèn)為有34 個(gè)有效種。1998 年Luc等［2］在排除了地理因素后認(rèn)為X.brevicollum與X.incogitantum、X.parvum、X.sheri、X.taylori、X.pseudoguirani幾個(gè)種之間形態(tài)學(xué)差別甚微，其形態(tài)測(cè)量數(shù)據(jù)存在明顯的重疊，都應(yīng)歸X.brevicollum的二級(jí)同物異名，其形態(tài)學(xué)偏差屬于種內(nèi)變異。Luc等［2］進(jìn)一步指出，X.brevicollum是孤雌生殖的種，其各個(gè)群體其實(shí)為一個(gè)克隆或若干克隆的混合體，再加上其廣泛的地理分布，群體間存在較大的變異是很正常的。在山西境內(nèi)尚未有X.brevicollum的報(bào)道，本文在山西太谷采集的線蟲樣品中，對(duì)分離到的劍線蟲進(jìn)行了形態(tài)觀察和測(cè)量，并對(duì)rDNA-ITS1、rDNA-ITS2和28S序列進(jìn)行了擴(kuò)增、測(cè)序及系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集和線蟲的分離

采集地點(diǎn)：山西省太谷縣山西農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，在一株枝葉枯黃的松樹根際距地表5～30cm 深處挖取土壤500g左右放入塑料袋中混勻封口，標(biāo)明采樣地、采樣時(shí)間、寄主植物等，帶回實(shí)驗(yàn)室，4 ℃下保存，用于線蟲分離鑒定。采用淺盤分離法分離線蟲：在塑料筐里均勻鋪兩層紙巾，再用電子秤稱取100g土樣，均勻鋪在塑料筐中的紙巾上面，將塑料筐放在淺盤中，往淺盤中加入400mL 水，放置48h后倒掉塑料筐中的土樣，將淺盤中的線蟲懸浮液倒入600目孔篩，篩掉線蟲懸浮液中多余水分，至篩中剩余懸浮液約30～50mL，轉(zhuǎn)移至50mL的試管中，靜置3h備用。

1.2 線蟲形態(tài)鑒定

參照武揚(yáng)等的方法［3］。

1.3 線蟲DNA的提取

參照Wu等的方法［4］略作改進(jìn)。用移液槍吸取10μL ddH2O 放入0.2mL PCR 管中，用挑針挑取單條線蟲放入其中，加入含8μL WLB 液（含125 mmol／L KCl，25 mmol／L Tris-HCl，pH 8.3，3.75 mmol／L MgCl2，2.5mmol／L DTT，1.125%Tween 20）管中，并向管中加入2μL 蛋白酶K（600μg／mL）?；靹蚝?，將管放入-70 ℃冰箱過夜，次日轉(zhuǎn)入PCR 儀，65 ℃孵育1h、95 ℃10 min。最后經(jīng)14 000r／min離心1min，即得粗提DNA 的懸浮液。其上清即可直接用于PCR 擴(kuò)增或者于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 分子檢測(cè)

①PCR 反應(yīng)體系：在0.2mL PCR 管中分別加入10μL mix（2×Taqpolymerase，2×PCR buffer，2×dNTPs），6μL ddH2O，10μmol／L 的上下游引物各1μL，線蟲粗提DNA 2μL。

②ITS1區(qū)擴(kuò)增：以粗提DNA 懸浮液的上清為模板，采用通用的上游引物 V1（5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′）和下游引物V4（5′-ACGAGCCGAGTGATCCACCG-3′）［5］。擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃3min；95℃30s，50℃30s，72℃90s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃5min；4 ℃保溫.

③ITS2區(qū)擴(kuò)增：以粗提DNA 懸浮液的上清為模板，采用通用的上游引物V1，下游引物V2（5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′）［5］。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃4min；95℃30s，52℃30s，72℃90s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃5min；4 ℃保溫。

④28S區(qū)擴(kuò)增：以粗提DNA 懸浮液的上清為模板，采用通用的上游引物D2A（5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3′）［6］，下游引物D3B（5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′）。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃4 min；94℃45s，53℃1min，72℃2min，35 個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃保溫。

⑤構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹：取5μL PCR 反應(yīng)產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳（100V，100mA）分離。電泳后經(jīng)EB 染色，紫外檢測(cè)儀上觀察記錄和拍照。由上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)人工校對(duì)后與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行BLAST 比較，并從數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)種屬序列，構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 山西短頸劍線蟲的形態(tài)分析

顯微觀察結(jié)果見圖1a～h。雌線蟲經(jīng)熱殺死后呈腹面彎曲的“C”形，體長(zhǎng)1.71～2.26mm，兩端漸細(xì)。唇區(qū)圓形，縊縮明顯，高度為（3.7±0.6）μm（2.3～5.2μm），側(cè)器孔為馬鞍狀；齒尖針細(xì)長(zhǎng)、高度硬化，長(zhǎng)度為（87.0±3.3）μm（76.2～105.3 μm）；齒針導(dǎo)環(huán)為雙環(huán)，后環(huán)高度骨化，后導(dǎo)環(huán)到前端距離為（72.3±2.1）μm（64.4～78.0μm）；齒尖針基部呈叉狀，齒托基部呈顯著的凸緣狀，凸緣處體寬為（35.8±2.7）μm（30.5～42.4μm）；陰門位于體長(zhǎng)中間偏上，子宮內(nèi)無特殊分化，生殖腺對(duì)生、均發(fā)育完全，生殖腺較短、前后卵巢長(zhǎng)度相等。尾短圓錐形，有輕微指狀突起，尾長(zhǎng)略長(zhǎng)于肛門處體寬。未見雄蟲。

圖1 山西短頸劍線蟲雌蟲的形態(tài)特征Fig.1 The morphological characteristic of Xiphinema brevicollumfrom Shanxi Province

雌線蟲的形態(tài)測(cè)量值見表1，根據(jù)Loof等［7］多歧檢索表，從山西太谷縣松樹根際得到的劍線蟲特征代碼為A2-B？-C3-D5／（6）-F2-G1-H2-I4，該蟲被鑒定為X.brevicollum。

表1 山西短頸劍線蟲的形態(tài)測(cè)量值1）Table 1 The microscopic measurement of Xiphinema brevicollumfrom Shanxi Province

續(xù)表1 Table 1 （Continued）

2.2 分子生物學(xué)特征

利用MrBayes 3.1.2 軟件對(duì)該線蟲的ITS1、ITS2和28SRNA 基因中的D2D3區(qū)序列構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行進(jìn)化分析。

（1）ITS1 區(qū)分子生物學(xué)特征：通過GenBank中BLAST比對(duì)可知太谷縣松樹根際的Xiphinema分離物ND-46 與AY359856（X.brevicollum）、FM211422（X.brevicollum）、AY359858（X.diffusum）、AY430190（X.brevicollum）和FM211425（X.brevicollum）的相似性在94%以上，在貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）上ND-46與FM211422（X.brevicollum）、FM211425（X.brevicollum）、AY359858（X.diffusum）、AY430190（X.brevicollum）在同一分支上，證實(shí)了Luc等［2］的觀點(diǎn)，即X.diffusum為X.brevicollum的同物異名，所以根據(jù)比對(duì)和進(jìn)化分析可以得出ND-46為X.brevicollum。

圖2 基于rDNA-ITS1區(qū)序列的劍線蟲屬貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The Bayesian tree based on rDNA-ITS1region of the genus Xiphinema

（2）ITS2 區(qū)分子生物學(xué)特征：經(jīng)BLAST 比對(duì)可知，太谷縣松樹根際的Xiphinema分離物ND-46與JX218046（X.brevicollum）和FM211420（X.brevicollum）相似性在94%，在貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）可以看到ND-46與JX218046（X.brevicollum）親緣關(guān)系最近，在同一分支上，因此可以得出ND46為X.brevicollum。

（3）28SRNA 基因中D2D3區(qū)分子生物學(xué)特征：在BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)ND-46與KF430800（X.brevicol-lum），HM163210（X.inaequale），AY601601（X.brevicollum）的相似性在99%，在貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）上它們也都在同一支上，親緣關(guān)系很近。從比對(duì)與進(jìn)化分析可以進(jìn)一步得出ND-46為X.brevicollum。

圖3 基于rDNA-ITS2區(qū)序列的劍線蟲屬貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The Bayesian tree based on rDNA-ITS2region of the genus Xiphinema

圖4 基于28SRNA基因D2D3區(qū)的劍線蟲屬貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The Bayesian tree based on D2D3region of 28SRNA gene of the genus Xiphinema

3 討論

劍線蟲屬是線蟲門中種類最多的一個(gè)屬，其分類方法繁多，但劍線蟲屬內(nèi)種的多歧檢索表得到了全世界的普遍接受?；贚oof等［7-11］多歧檢索表，從山西太谷松樹根部得到的劍線蟲特征代碼為A2-B？-C3-D5／（6）-F2-G1-H2-I4，但是據(jù) Lamberti等［12］的統(tǒng)計(jì)，在美洲劍線蟲組內(nèi)已被描述的組內(nèi)種有49個(gè)，其形態(tài)特征十分相似，也沒有明顯的種間差異，在劍線蟲屬形態(tài)分類多歧檢索表中［6］它們應(yīng)用相同的鑒定代碼，很難將其依據(jù)形態(tài)區(qū)分。

劍線蟲的鑒定目前普遍采用的方法是rDNARFLP。Vrain等［5，13］應(yīng)用此方法區(qū)分了16個(gè)美洲劍線蟲群體rDNA 中ITS 區(qū)的特征；Knoetze等［14］和Ni等［15］運(yùn)用rDNA-RFLP方法分別鑒定了南非和中國(guó)臺(tái)灣的一些劍線蟲屬群體。隨著劍線蟲屬分子分類研究的不斷豐富，利用某些基因區(qū)段特別是rDNA 的分子系統(tǒng)發(fā)育分析的研究越來越引起線蟲界的普遍接受［16-18］，基于rDNA-ITS、D2D3序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹不僅從一定水平上揭示了劍線蟲屬的美洲劍線蟲組Xiphinemaamericanumgroup內(nèi)種群間的親緣關(guān)系及與其他種間關(guān)系，也從另外一個(gè)角度證明了在山西太谷松樹根際得到的劍線蟲與X.brevicollum親緣關(guān)系較近。

基于形態(tài)特征與貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹的雙向研究表明：在山西太谷縣松樹根際發(fā)現(xiàn)的這一美洲劍線蟲為X.brevicollum。

［1］Lamberti F，Hockland S，Agostinelli A，et al.TheXiphinemaamericanumgroup.Ⅲ.Keys to species identification［J］.Nematologia Mediterranea，2004，32（1）：53-56.

［2］Luc M，Coomans A，Loof P A A，et al.TheXiphinemaamerianumgroup（Nematoda：Longidoridae）.2.Observation onXiphinemabrevicollumLorfello da Costa，1961and comments on the group ［J］.Fundamental and Applied Nematology，1998，21（5）：475-490.

［3］武揚(yáng)，劉斌，梁定東，等.一種改進(jìn)的植物線蟲快速固定和脫水方法［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2006，32（2）：123-126.

［4］Wu Y，Zheng J，Robbins R T.Molecular characterization of aXiphinemahunaniensepopulation with morphometric data of all four juvenile stages［J］.Journal of Nematology，2007，39（1）：37-42.

［5］Vrain T C.Restriction fragment length polymorphism separates species of the Xiphinemaamericanumgroup［J］.Journal of Nematology，1993，25（3）：361-364.

［6］De Ley P，F(xiàn)elix M A，F(xiàn)risse L M，et al.Molecular and morphological characterisation of two reproductively isolated species with mirror-image anatomy（Nematoda：Cephalobidae）［J］.Nematology，1999，1：591-612.

［7］Loof P A A，Luc M.A revised polytomous key for the identification of species of the genusXiphinemaCobb，1913（Nematoda：Longidoridae）with exclusion of theX.amerieanum-group：Supplement1［J］.Systematic Parasitology，1993，24：185-189.

［8］Loof P A A，Luc M.A revised polytomous key for the identification of species of the genusXiphinemaCobb，1913（Nematoda：Longidoridae）with exclusion of theX.americanumgroup［J］.Systematic Parasitology，1990，16（1）：35-66.

［9］Loof P A A，Coomans A，Baujard P.On five species of the genusXiphinemaCobb，1913（Nematoda：Longldoridae）recently described from India［J］.Nematology，2001，3：277-283.

［10］Loof P A A，Luc M，Baujard P.A revised polytomous key for the identification of species of the genusXiphinemaCobb，1913（Nematoda：Longldoridae）with exclusion of theX.americanum-group：Supplement 2［J］.Systematic Parasitology，1996，33：23-29.

［11］Loof P A A，Luc M，Coomans A.TheXiphinemaamerieanumgroup（Nematota：Dorylaimida）.1.Comments upon the key to species published by Lamberti and Carone（1992）［J］.Fundamental Applied Nematology，1993，16（4）：355-358.

［12］Lamberti F，Molinari S，Moens M，et al.TheXiphinemaamericanumgroup.1.Putative species，their geographical occurrence and distribution，and regional polytomous identification keys for the group［J］.Russian Journal of Nematology，2000，8（1）：65-84.

［13］Vrain T C，Wakarchuk D A，Levesque A C，et al.Intraspecific rDNA restriction fragment length polymorphism in theXiphinemaamericanumgroup［J］.Fundamental and Applied Nematology，1992，15（6）：563-573.

［14］Knoetze R，Burger J T，Meyer A J.Discrimination of someXiphinemaspecies from South Africa by rDNA-RFLP analysis［J］.African Plant Protection，2000，6（2）：25-30.

［15］Ni H F，Cheng Y H，Chen R S，et al.Discrimination ofXiphinemaspecies from Taiwan by rDNA-RFLP analysis［J］.Plant Pathology Bulletin，2003，12（4）：235-241.

［16］He Yu，Subbotin S A，Rubtsova T V，et al.A molecular phylogenetic approach to Longidoridae（Nematoda：Dorylaimida）［J］.Nematology，2005，7：111-124.

［17］Oliveira C M G，Hubschen J，Brown D J F，et al.Phylogenetic relationships amongXiphinemaandXiphidorusnematode species from Brazil inferred from 18SrDNA sequences［J］.Journal of Nematology，2004，36（2）：153-159.

［18］Ye W M，Szalanski A L，Robbins R J.Phylogenetic relationships and genetic variation inLongidorusandXiphinemaspecies（Nematoda：Longdoridae）using ITS1sequences of nuclear ribosomal DNA［J］.Journal of Nematology，2004，36（1）：14-19.