張大為，羅進倉，周昭旭，魏玉紅，劉月英

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，蘭州 730070）

蘋果蠹蛾［Cydiapomonella（L.）］屬鱗翅目，卷葉蛾科，小卷蛾亞科，以幼蟲蛀食蘋果、梨、桃、李、沙果等多種果樹的果實，造成大量落果，是水果生產(chǎn)上的毀滅性檢疫害蟲。該蟲寄主范圍廣、繁殖能力強、危害程度高、適應能力強，是世界溫帶落葉果樹的重要害蟲［1］。蘋果蠹蛾最早起源于歐亞大陸中南部［2］，1957年在我國新疆首次被記錄為害［3］，2007 年 和2009年分別被列入中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄和全國農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物名單［4-5］。蘋果蠹蛾1987年傳入甘肅省酒泉地區(qū)［6］，后逐年向東擴散，現(xiàn)已越過祁連山、烏鞘嶺等天然屏障，繼續(xù)向東傳播，在甘肅蘭州以西均有分布報道［7-8］。目前，蘋果蠹蛾有進一步東侵的趨勢，在黑龍江、遼寧也有其發(fā)生為害報道，已對我國黃土高原和環(huán)渤海灣兩大蘋果優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)形成東西夾攻之勢，嚴重威脅我國的果品生產(chǎn)。

國內(nèi)學者對蘋果蠹蛾的研究，主要集中在生物學［9-10］、生態(tài)學［8，11-14］、綜合防治［15-19］及適生性［7，20-21］等方面，有關(guān)蘋果蠹蛾種群遺傳多樣性的研究還比較少。馮紀年等分析了10個蘋果蠹蛾地理種群，認為已經(jīng)存在一定程度的種群分化，在我國由西向東傳播［22］；門秋雷等篩選了6個在中國蘋果蠹蛾種群中可以穩(wěn)定擴增的微衛(wèi)星位點［23］；李玉婷等認為河西地區(qū)蘋果蠹蛾種群遺傳多樣性較低，已經(jīng)存在一定程度遺傳分化［24］。在國外，有學者認為，由于蘋果蠹蛾自身活動能力限制，不同種群間存在遺傳多樣性的原因是種群之間缺乏基因交流［25］。一些研究發(fā)現(xiàn)，同一個國家不同地理區(qū)域內(nèi)的蘋果蠹蛾種群之間并不存在顯著的遺傳分化［26-28］。也有些研究發(fā)現(xiàn)，即使是在相隔距離小于10km的兩個蘋果蠹蛾種群之間也存在顯著的遺傳分化［29］。因此，為探明甘肅省境內(nèi)蘋果蠹蛾不同地理種群間的遺傳分化及擴散路徑，有必要對其分子遺傳變異情況進行研究。本文利用9對引物對甘肅省9個不同地理種群的遺傳多樣性進行了研究，以明確甘肅蘋果蠹蛾種群間的遺傳變異、種群分化及傳播擴散路徑，為制定蘋果蠹蛾的防控阻截策略提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

試驗用樣本均采集于2011年4-8月，在甘肅省內(nèi)蘋果蠹蛾危害區(qū)選取有代表性的果園，于果樹老翹皮下、枝干縫隙處及蛀果內(nèi)采集蘋果蠹蛾越冬代老熟幼蟲及第1代4～5齡幼蟲。采集完畢后，記錄采樣地點經(jīng)緯度等信息（表1）。采集樣本在饑餓24h后，單頭浸泡于含無水乙醇的指形管內(nèi)帶回實驗室，若液體變色則更換無水乙醇，所有樣本保存于-20℃冰箱備用。

表1 試驗樣本采集信息Table 1 Sample collection information

1.2 引物篩選

各微衛(wèi)星位點擴增所用的引物序列參考Franck等［2］和Zhou 等［30］發(fā)表的微衛(wèi)星序列（表2），委托上海捷瑞生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。經(jīng)過篩選，選取了9對擴增條帶清晰、重復性較好的引物用于對蘋果蠹蛾DNA 樣品擴增。

1.3 基因組DNA 的提取與檢測

采用Tiangen公司DP304-2動物組織基因組DNA提取試劑盒提取單頭蘋果蠹蛾樣本總DNA，經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用尤尼柯（上海）儀器有限公司生產(chǎn)的Unico 4802H 型紫外可見分光光度計檢測，估算DNA的濃度與純度，并稀釋至45ng／μL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴增及產(chǎn)物檢測

PCR擴增反應在PTC-100PCR 儀（MJ Research Company）上進行，反應體積為25μL，其中DNA 模板1μL（45ng／μL），10×PCR buffer 2.5μL，上、下游引物各0.5μL，TaqDNA聚合酶1μL，ddH2O 17.5μL。PCR反應程序為：94℃預變性5min；95℃變性30s，55～60℃（根據(jù)各引物退火溫度有所不同）退火30s；72 ℃延伸30s，30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。反應結(jié)束后，產(chǎn)物于4℃保存?zhèn)溆?。擴增產(chǎn)物通過6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE）進行檢測，采用JY 600＋電泳儀和DYC-30型垂直電泳槽（北京六一儀器廠），電壓10V／cm，約2h，在指示劑到達膠板最底端時，結(jié)束電泳，采取硝酸銀染色法顯色，然后根據(jù)標準分子量marker（本研究采用PBR322DNA／Mspl，北京天根生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）標示擴增條帶大小，并根據(jù)結(jié)果讀帶，采用數(shù)碼相機拍照，保存膠板圖像。

表2 試驗所用9對微衛(wèi)星引物Table 2 Microsatellite primers used in this study

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

假設(shè)群體處于Hardy-Weinberg 平衡，排除模糊不清和無法準確識別的條帶，對SSR 擴增的多態(tài)性條帶，按照電泳圖譜中同一位置上DNA 帶進行量化統(tǒng)計，有條帶的量化為1，無條帶的量化為0，生成0，1二維矩陣。利用POPGENE 1.32軟件對全部位點及全部種群和個體進行遺傳參數(shù)分析，結(jié)合NTSYSpc 2.1軟件進行遺傳多樣性評價［31］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蘋果蠹蛾種群的遺傳多樣性分析

遺傳多樣性分析（表3）表明，蘋果蠹蛾9個地理種群的觀測等位基因Na為1.045 5～1.272 7，平均為1.131 3，有效等位基因Ne為1.032 1～1.192 8，平均為1.092 8，Nei氏基因多樣性指數(shù)為0.018 8～0.113 0，平均為0.054 4，Shannon指數(shù)為0.027 5～0.164 9，平均為0.106 9，多態(tài)位點百分率為4.55%～27.27%，平均為13.13%。可以看出9個種群中，蘭州七里河和臨澤種群遺傳多樣性較高，Shannon指數(shù)分別為0.164 9和0.137 4。

表3 甘肅不同地理種群蘋果蠹蛾的遺傳變異參數(shù)Table 3 Genetic variation parameters of different geographical populations of the codling moth in Gansu

2.2 遺傳相似度、遺傳距離以及地理距離相關(guān)性

利用POPGENE 1.32軟件對9個種群的遺傳相似度和遺傳距離（表4）計算發(fā)現(xiàn)，相似度在0.325 8～0.817 0之間，其中高臺種群和臨澤種群遺傳相似度最低，相互遺傳相似度最高的是甘州種群和金塔種群。

表4 甘肅不同地理種群蘋果蠹蛾遺傳距離（左下）和遺傳相似度（右上）Table 4 Genetic distance（L＋B）and genetic similarity（R＋U）between pairwise geographical populations of codling moth in Gansu Province

利用Google地理距離計算器Google maps distance calculator，獲得了9 個采樣點的直線地理距離，通過NTSYSpc軟件中的MXCOMP 程序分析遺傳距離與地理距離的相關(guān)性，得到了地理距離與遺傳距離的相關(guān)關(guān)系圖（圖1），圖中可以看出，數(shù)據(jù)分布散亂，沒有明顯的規(guī)律性，Mantel檢測結(jié)果，相關(guān)系數(shù)r＝-0.078 9，P＝0.653 0（P＞0.05），表明相關(guān)程度較低。由此可見，甘肅9個蘋果蠹蛾地理種群間的遺傳距離與地理距離間無顯著相關(guān)性。

圖1 蘋果蠹蛾9個地理種群之間遺傳距離和地理距離相關(guān)性Fig.1 Correlation between genetic distance and geographic distance among 9populations of the codling moth

2.3 聚類分析

2.3.1 UPGMA 遺傳圖譜

通過POPGENE 1.32軟件得到種群間的遺傳相似度，利用NTSYSpc 2.1軟件得到甘肅9個蘋果蠹蛾種群的UPGMA 聚類圖（圖2）?？梢钥吹?，甘州種群與金塔種群聚為一支，兩者與肅州種群合為一個分支；臨澤種群與總寨種群聚為一個分支；七里河種群與敦煌種群聚為一支；高臺種群與民勤種群聚為一支。

圖2 蘋果蠹蛾種群Nei氏遺傳相似度UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA dendrogram of 9geographical populations of the codling moth based on Nei’s genetic identity

2.3.2 各分支遺傳多樣性統(tǒng)計

通過表5數(shù)據(jù)可以看出，在甘肅蘋果蠹蛾種群的4個分支中，分支Ⅰ即甘州、金塔、肅州種群分支的遺傳多樣性水平明顯高于其他種群分支，遺傳多樣性水平由高到低依次是分支Ⅰ＞分支Ⅳ＞分支Ⅱ＞分支Ⅲ。

2.3.3 各分支間F統(tǒng)計及基因流

種群間分化系數(shù)Fst越大表明種群分化程度越高［32］，表6 可以看出，甘肅省蘋果蠹蛾4 個種群分支的遺傳分化系數(shù)平均為0.695 6，七里河和敦煌種群分支的遺傳分化系數(shù)最高，為0.857 9，最低為臨澤與總寨種群分支的0.531 4；各分支的基因流在0.082 8～0.441 0之間，平均為0.247 2。

3 討論

遺傳多樣性可以反映一個物種適應環(huán)境的能力，多態(tài)信息含量、Shannon指數(shù)及Nei氏基因多樣性指數(shù)均是衡量種群遺傳多樣性的指標，當多態(tài)信息含量＞0.5時［33］，為高度多態(tài)位點，本研究中4大分支的多態(tài)信息含量為95.45%，表明本研究所用的微衛(wèi)星標記能夠有效地反映蘋果蠹蛾群體的遺傳多樣性變異情況。Nei氏指數(shù)和Shannon 指數(shù)表明，甘肅省蘋果蠹蛾種群4大分支的遺傳多樣性較低，且敦煌與七里河兩個種群分支遺傳多樣性最低，推測由于隨著入侵過程、遺傳漂變及瓶頸效應的共同影響，造成遺傳多樣性的下降，與李玉婷等［24］研究結(jié)果一致。本研究中種群間的平均Fst值為0.695 6，表明種群的遺傳變異主要發(fā)生在種群間，種群內(nèi)的遺傳變異只占總變異的很少部分，與Chen和Dorn［29］、門秋雷等［23］的研究結(jié)果一致。Fis、Fit的平均值分別為0.054 9和0.181 4，表明研究的4大種群在各種群內(nèi)部存在較嚴重的近交，基因流Nm為0.247 2（＜1）說明4 個種群之間基因交流較少，與Timm 等［25］的研究結(jié)果一致，可能與蘋果蠹蛾侵入甘肅時間較短，且自身飛行擴散能力較弱有關(guān)。

表5 甘肅蘋果蠹蛾各分支間遺傳多樣性統(tǒng)計Table 5 Genetic diversity statistics of different codling moth clades in Gansu

表6 甘肅蘋果蠹蛾4個分支的F 統(tǒng)計及基因流Table 6 F-statistics and gene flow of four population clades of the codling moth in Gansu

本研究發(fā)現(xiàn)甘肅省蘋果蠹蛾種群分布呈現(xiàn)4大分支的格局，金塔、肅州、甘州種群聚為一支；蘭州七里河種群和敦煌種群聚為一支；臨澤、總寨種群聚為一支，此3個分支應為同一個入侵來源，其中敦煌與七里河種群遺傳多樣性最低，表明敦煌種群為最初入侵來源，七里河種群自敦煌傳播而來；高臺、民勤種群與其他3個種群遺傳距離相對較遠，獨立為一支，懷疑為甘肅省蘋果蠹蛾的另一個入侵來源，各分支的遺傳關(guān)系有待于今后采集其他省份及國外種群樣本進行遺傳多樣性分析驗證。臨澤與甘州、肅州與總寨種群采集點之間的直線距離都只有十幾公里，然而幾個種群均聚為不同的分支，遺傳多樣性顯示出較大的差異，這與Chen和Dorn［29］的研究結(jié)果一致。Mantel檢測結(jié)果表明甘肅9 個蘋果蠹蛾地理種群間的遺傳距離與地理距離間無顯著相關(guān)性，與Men等［34］和李玉婷等［35］的研究結(jié)果一致。本研究采樣點均分布在國道省道附近，敦煌與七里河種群地理距離最遠，七里河種群發(fā)現(xiàn)報道最晚，兩者遺傳關(guān)系最近，推測兩地是全省重要的旅游中心及交通樞紐，也進一步印證了蘋果蠹蛾更多是通過借助外力進行點對點傳播擴散的可能性。

綜上，可以判定9個蘋果蠹蛾種群在甘肅省內(nèi)已經(jīng)形成一定程度的遺傳分化，入侵擴散以人為傳播為主，總體趨勢并非自西向東，而是隨外部介質(zhì)的點對點的隨機傳播擴散。目前，甘肅省河西地區(qū)果品產(chǎn)業(yè)規(guī)模相對較小，東部果區(qū)作為黃土高原蘋果優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)之一，在當?shù)匾呀?jīng)形成區(qū)域特色支柱產(chǎn)業(yè)，在蘭州以東尚未有蘋果蠹蛾發(fā)生的相關(guān)報道，因此，蘋果蠹蛾的防控阻截顯得尤為重要，應該遵循以下策略：在蘋果蠹蛾危害區(qū)，進一步強化果農(nóng)對蘋果蠹蛾危害嚴重性的認識與宣貫，做到發(fā)現(xiàn)疫情消滅疫情；全省范圍內(nèi)開展蘋果蠹蛾在其他寄主上發(fā)生的監(jiān)測與測報；進一步強化疫區(qū)果品運輸?shù)臋z驗檢疫，嚴防蘋果蠹蛾進入非疫區(qū)。

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