魏環(huán)宇，管麗蓉，2，王 揚(yáng)，王海寧，劉 勝，李正科，王云月，謝 勇＊

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明 650201；2.云南開(kāi)放大學(xué)化工學(xué)院，昆明 650500；3.云南省曲靖市沾益縣農(nóng)業(yè)局，曲靖 655331）

當(dāng)歸（Angelicasinensis）屬于傘形花科植物，是云南山區(qū)廣為栽培的中草藥之一，但防治當(dāng)歸根結(jié)線蟲(chóng)病和根腐病一直是困擾當(dāng)歸大田生產(chǎn)的重要難題［1-2］。探索高效、簡(jiǎn)便、環(huán)境友好的防治方法成為農(nóng)業(yè)科技工作者長(zhǎng)期努力的目標(biāo)。

合理的作物布局（allocation of crops）是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)取得較好經(jīng)濟(jì)效益、生態(tài)效益和社會(huì)效益的前提。利用農(nóng)業(yè)生物多樣性的原理和技術(shù)，針對(duì)不同地區(qū)作物種類、光熱條件進(jìn)行農(nóng)作物的合理間（套）作或輪作不僅可提高復(fù)種指數(shù)、增加產(chǎn)出，而且可有效控制農(nóng)作物病蟲(chóng)害［3-4］。萬(wàn)壽菊（Tageteserecta）是認(rèn)識(shí)最早的具有開(kāi)發(fā)或應(yīng)用價(jià)值的殺線植物之一，有關(guān)其殺線機(jī)制方面的研究仍在深入［5-7］。利用萬(wàn)壽菊與其他作物輪作或間（套）作來(lái)控制多種線蟲(chóng)病的危害已經(jīng)有了一些成功的嘗試［8］。在殺線機(jī)制研究方面也有報(bào)道，普遍認(rèn)為是萬(wàn)壽菊的根系分泌物殺死線蟲(chóng)或創(chuàng)造了有利于拮抗微生物的土壤生態(tài)環(huán)境［9-10］。然而，萬(wàn)壽菊與其他作物間套作來(lái)控制線蟲(chóng)病害的研究存在較多相互矛盾的結(jié)論［11］。因此，加快萬(wàn)壽菊殺線機(jī)制研究有利于萬(wàn)壽菊殺線活性的有效利用。

作為一種商業(yè)化色素的新來(lái)源，萬(wàn)壽菊的種植面積在云南日益增長(zhǎng)，傳統(tǒng)的區(qū)域性作物布局逐漸被打破，同時(shí)萬(wàn)壽菊與當(dāng)歸這兩種作物間具有很大的作物布局重疊區(qū)，在原有生產(chǎn)水平和生產(chǎn)模式的基礎(chǔ)上，如何充分利用有限耕地，確保較高的復(fù)種指數(shù)并實(shí)現(xiàn)農(nóng)作物病蟲(chóng)害的持續(xù)控制，同時(shí)扶持萬(wàn)壽菊這一新興產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，成為農(nóng)業(yè)科技工作者關(guān)注的科學(xué)問(wèn)題。本課題組在前期研究中進(jìn)行了萬(wàn)壽菊與當(dāng)歸套作控制當(dāng)歸根結(jié)線蟲(chóng)病的初步探索，發(fā)現(xiàn)采用合理的多樣性種植方式可有效控制當(dāng)歸根結(jié)線蟲(chóng)危害，并可提高土地利用率［12］。但由于萬(wàn)壽菊根系分泌物具有廣譜的生物活性，進(jìn)行多樣性種植后，不同種植方式對(duì)土壤微生物產(chǎn)生何種影響，其規(guī)律如何，以及多樣性種植是否具有持續(xù)性等問(wèn)題未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

因此，本研究采用PCR-DGGE 技術(shù)方法，以直接從土壤中提取微生物總DNA 的方式，研究萬(wàn)壽菊多樣性種植對(duì)當(dāng)歸根際土壤真菌群落的影響，初步弄清萬(wàn)壽菊多樣性種植模式中根際土壤真菌群落的變化，為利用萬(wàn)壽菊多樣性種植持續(xù)控制作物病蟲(chóng)害提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

試驗(yàn)材料：當(dāng)歸（A.sinensis）和萬(wàn)壽菊（T.erecta）均為曲靖市沾益縣推廣品種，萬(wàn)壽菊種子由曲靖博浩生物科技股份有限公司提供，當(dāng)歸種子由沾益縣農(nóng)業(yè)局生物資源開(kāi)發(fā)技術(shù)推廣站提供。萬(wàn)壽菊和當(dāng)歸育苗按常規(guī)方法進(jìn)行，苗床期適時(shí)防治病蟲(chóng)害。

試驗(yàn)田位于云南省曲靖市沾益縣菱角鄉(xiāng)排坡村，海拔高度1 952m，山地土壤類型為黃壤。田間試驗(yàn)以當(dāng)歸單作為對(duì)照（A），共設(shè)置3個(gè)處理，分別為萬(wàn)壽菊單作（B）、萬(wàn)壽菊和當(dāng)歸輪作（C）、萬(wàn)壽菊和當(dāng)歸間作（D），除了對(duì)照當(dāng)歸單作的前茬作物為當(dāng)歸外，3個(gè)處理的前茬作物都為萬(wàn)壽菊。每處理3次重復(fù)，共12個(gè)小區(qū)，每小區(qū)面積100m2。周圍設(shè)置當(dāng)歸保護(hù)行。單作模式移栽規(guī)格參照文獻(xiàn)［13］和文獻(xiàn)［14］的方法進(jìn)行，間作模式為2行萬(wàn)壽菊中間間作4行當(dāng)歸，萬(wàn)壽菊與當(dāng)歸株距35cm。大田移栽于5月上旬進(jìn)行，所有處理肥水管理完全一致，生長(zhǎng)期間不施用任何藥劑［12］。

圖1 當(dāng)歸-萬(wàn)壽菊田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖Fig.1 Diagrammatic representation of angelica inter-planting with marigold experiment in field

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司），DGGE 電泳儀（BIO-RAD），電泳儀（BIO-RAD），PCR 儀（Biometra），恒溫水?。ㄉ虾＞陮?shí)驗(yàn)設(shè)備公司），凝膠成像儀LG2020型（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司），旋蒸濃縮儀（BIO-RAD），電子天平等。

1.2 方法

1.2.1 土樣采集方法

對(duì)照（當(dāng)歸單作）和處理（萬(wàn)壽菊單作、當(dāng)歸／萬(wàn)壽菊輪作、當(dāng)歸／萬(wàn)壽菊間作）分別連作當(dāng)歸或萬(wàn)壽菊一年。取樣時(shí)間為前期（移栽當(dāng)天）、中期（移栽后60d）和后期（移栽后120d），取樣方法采用棋盤式五點(diǎn)取樣。根據(jù)處理不同，分別從當(dāng)歸或萬(wàn)壽菊根周圍在距離地表20cm處用自制土樣采集器分別取根區(qū)土，將五點(diǎn)取的土樣混勻后作為該處理的樣品（約500g）。其中，間作（D）在每個(gè)取樣點(diǎn)分別采集當(dāng)歸和萬(wàn)壽菊各10個(gè)土樣經(jīng)1∶1充分混勻后裝袋。采集到的土壤樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，于-20℃冰箱保存，每個(gè)處理和對(duì)照根據(jù)取樣時(shí)間進(jìn)行編號(hào)，即前期、中期、后期（編號(hào)1、2、3）。試驗(yàn)樣品分別為當(dāng)歸單作（A1、A2、A3）、萬(wàn)壽菊單作（B1、B2、B3）、萬(wàn)壽菊／當(dāng)歸輪作（C1、C2、C3）、萬(wàn)壽菊／當(dāng)歸間作（D1、D2、D3）；由于種植前期，即作物移栽當(dāng)天，萬(wàn)壽菊單作與間作的前茬作物都為萬(wàn)壽菊，土樣樣品沒(méi)有重復(fù)取樣，因此共計(jì)采集11個(gè)樣品。

表1 各處理DGGE條帶數(shù)比較及當(dāng)歸多樣性種植與當(dāng)歸單作的顯著性分析1）Table 1 The number of DGGE bands and significance analysis between angelica diversified cropping and its monoculture patterns

1.2.2 基因組DNA 的提取和純化

本試驗(yàn)采用OMEGA 公司的soil DNA Kit試劑盒方法，具體按試劑盒說(shuō)明書并略作改動(dòng)，提取的DNA 樣品于-20 ℃保存［15-16］。

1.2.3 基因組DNA 的PCR 擴(kuò)增

為提高PCR 擴(kuò)增的特異性，本試驗(yàn)采用嵌套式PCR 擴(kuò)增，方法如下。

1.2.3.1 PCR 擴(kuò)增引物

選擇針對(duì)真菌ITS rDNA 基因的高度可變區(qū)序列的保守引物，在正向引物ITS1F 的5′端加一段“GC夾”，以防止在DGGE中分離時(shí)DNA 的完全變性。引物序列為：ITS1F：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA 和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC；ITS2：GCTGCGTTCTTCATCGATGC 和ITS 1FGC：CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA。

1.2.3.2 PCR 反應(yīng)體系

第1次PCR 采用真核生物通用引物對(duì)ITS1F和ITS4，擴(kuò)增序列覆蓋核糖體5.8SrDNA，第1次PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物作為第2次PCR 擴(kuò)增的模板。第2次PCR采用引物對(duì)ITS1F-GC和ITS2，擴(kuò)增片段的大小約250bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：采用20μL反應(yīng)體系，組成為10×TaqBuffer with KCl 2.0μL，2.5mmol／L dNTP Mixture 1.6μL，1.0μmol／L上游引物2.0μL，1.0μmol／L 下游引物2.0μL，Taq酶（5U／μL）0.2μL，模板DNA 2.0μL，無(wú)菌雙蒸水10.2μL。

1.2.3.3 PCR 反應(yīng)條件與產(chǎn)物檢測(cè)

94 ℃預(yù)變性3min；94 ℃變性30s，56 ℃退火30s，72℃延伸45s，30個(gè)循環(huán)；最后在72℃下終延伸5min。PCR 反應(yīng)的產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 PCR反應(yīng)產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析

1.2.4.1 變性膠的制備

使用DGGE梯度膠制備裝置，制備變性劑濃度從30%到50%（其中變性劑為尿素和甲酰胺組成，100%的變性劑為含7mol／L 的尿素和40%的去離子甲酰胺的混合物）的8%的聚丙烯酰胺凝膠，其中變性劑的濃度從膠的上方向下方依次遞增。配制好的膠用0.45μm 的濾膜過(guò)濾，抽真空10min，4 ℃保存。100μL PCR 產(chǎn)物用Bio-Rad旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮5～6倍，用于灌制30%～50%梯度膠。具體過(guò)程為：各取15mL 30%和50%的變性膠，加600μL 的染液到50%高濃度膠中，混勻。然后，分別在30%和50%的變性膠中加入80μL 10%過(guò)硫酸銨和50μL TEMED，快速灌膠，聚合1～2h。將1×TAE 在Bio-Rad DCode mutant detect system 電泳槽中預(yù)熱到65 ℃［16-17］。

1.2.4.2 PCR 樣品的加樣

待膠完全凝固后，將膠板放入裝有電泳緩沖液的裝置中，濃縮樣品與等體積的loading buffer混合后，取25μL上樣到8%聚丙烯酰胺30%～50%梯度變性凝膠孔中。

1.2.4.3 電泳及染色

在60V 的電壓下，65 ℃電泳14h。電泳完畢后，將凝膠采用銀染法染色。具體步驟為：用固定液（10%的冰醋酸）固定凝膠20min后，用去離子水清洗凝膠2次，每次2min。然后將凝膠浸泡在染色液（含0.26g硝酸銀，350mL去離子水）中，放置軌道搖床上20min。取出凝膠，用去離子水清洗5s，立刻放入顯影液（含5.25g氫氧化鈉，1.4 mL 甲醛，350mL水）中，搖晃至條帶清晰完全出現(xiàn)。

在凝膠成像儀中用白光拍照。觀察各個(gè)土壤樣品的PCR 產(chǎn)物經(jīng)變性梯度凝膠電泳（DGGE）分離后的電泳圖譜照片。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Quantity One 分析軟件（Bio-Rad）對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行條帶識(shí)別和原始數(shù)據(jù)獲取，通過(guò)分析樣品電泳條帶的多少來(lái)比較各個(gè)土壤樣品真菌多樣性的指標(biāo)。其中，各處理不同時(shí)期的條帶變化率采用如下公式計(jì)算：

主成分分析和聚類分析由軟件Multibase＿2014完成。顯著性分析采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物總DNA 提取及濃度測(cè)定

本試驗(yàn)采用土壤試劑盒提取微生物的總DNA，試驗(yàn)結(jié)果表明該方法可有效去除土壤中大量含有的腐植酸、色素和其他雜質(zhì)，經(jīng)DNA 純度檢測(cè)，樣品A260／A280的比值在1.6～1.8 之間，表明所提取的DNA 純度較高，可以滿足PCR-DGGE 的需要（圖2）。

圖2 土壤微生物基因組DNA電泳圖Fig.2 Electrophoresis of genomic DNA extracted from soil samples

2.2 基因組DNA的PCR 擴(kuò)增

本試驗(yàn)為了提高樣品所擴(kuò)增片段的特異性，采用nested PCR 方法進(jìn)行。具體為，首先選用真菌通用引物ITS1F和ITS4擴(kuò)增土壤樣品中提取的基因組總DNA，然后以PCR 產(chǎn)物為模板，用引物ITS1FGC和ITS2進(jìn)行第2輪擴(kuò)增（在引物ITS1F的5′端加一段GC夾子，以提高PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠電泳中的解鏈溫度，從而提高擴(kuò)增片段的分離效果）。從圖3可看出，nested PCR 擴(kuò)增片段為一條300bp左右的條帶，與預(yù)期大小一致。

圖3 根際土壤真菌ITS區(qū)段PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 PCR products of ITS region from soil samples on agarose gel

2.3 土壤樣品的變性梯度凝膠電泳（DGGE）帶譜分析

應(yīng)用Quantity One軟件對(duì)DGGE 圖譜進(jìn)行泳道和條帶的自動(dòng)識(shí)別，并完成統(tǒng)計(jì)分析（圖4）。從表1可看出，3個(gè)多樣性種植處理前期（B1、C1、D1）與當(dāng)歸單作模式前期（A1）的條帶差異較大（P＜0.05），說(shuō)明萬(wàn)壽菊已經(jīng)顯著抑制了土壤真菌群體。從各處理的前期階段看，當(dāng)歸單作（A）的泳道條帶數(shù)量最多，達(dá)31條，后期為15條，其土壤中真菌種群數(shù)量在各個(gè)時(shí)期都是最高的。另外，從條帶變化上看，所有處理的條帶數(shù)到后期都低于前期的水平，這可能反映了土壤生態(tài)環(huán)境條件隨季節(jié)變化而形成了不利于真菌的生存條件。值得注意的是，間作處理（D）在中期有一個(gè)明顯的增高過(guò)程。相比較而言，從整個(gè)作物生長(zhǎng)期看，多樣性種植模式（C、D）的真菌群落比單作模式（A、B）的真菌群落更為穩(wěn)定，條帶變化率分別為-39.13%和-30.77%，而單作栽培模式（A、B）條帶變化率達(dá)到-51.61%和-69.23%。

圖4 各處理土壤真菌PCR-DGGE圖譜Fig.4 Electrophoresis of nested-PCR products on DGGE gel

由表1還可以看出，在整個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)中，與前期相比，后期的條帶變化率最高的是萬(wàn)壽菊單作（B）（-69.23%），說(shuō)明在前一年種植萬(wàn)壽菊后，當(dāng)季的萬(wàn)壽菊持續(xù)降低了土壤真菌多樣性。說(shuō)明萬(wàn)壽菊根系分泌物對(duì)一些土壤真菌種類產(chǎn)生了持續(xù)的抑制作用；當(dāng)歸單作處理的真菌多樣性變化也較大，條帶變化率為-51.61%，這也許與當(dāng)歸單作中前期的真菌多樣性基礎(chǔ)水平較高有關(guān)，而萬(wàn)壽菊／當(dāng)歸輪作和萬(wàn)壽菊／當(dāng)歸間作中條帶變化率只有-39.13%和-30.77%。這一結(jié)果說(shuō)明，與當(dāng)歸單作相比，采用萬(wàn)壽菊與當(dāng)歸進(jìn)行間作或輪作可有效穩(wěn)定土壤中的真菌群落。

2.4 不同種植模式當(dāng)歸土壤真菌多樣性的PCA分析

對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行主成分（PCA）分析，結(jié)果表明：每個(gè)處理都具有其特征性的真菌群落，尤其是當(dāng)歸單作的真菌種類組成與萬(wàn)壽菊多樣性種植模式中的真菌種類組成差異較明顯，說(shuō)明萬(wàn)壽菊已經(jīng)顯著影響到了土壤真菌群落的組成。另外，從圖5還可看出，處理內(nèi)，在作物生長(zhǎng)的不同時(shí)期，土壤真菌群落組成隨季節(jié)而變化，但當(dāng)歸單作（A）和萬(wàn)壽菊單作（B）的種類差異變化較??；而萬(wàn)壽菊／當(dāng)歸間作（D）的中、后期與前期差異較大，表明萬(wàn)壽菊化感作用對(duì)間作處理的土壤真菌群落產(chǎn)生了較大的影響。

圖5 各處理不同時(shí)期土壤真菌群落結(jié)構(gòu)主成分分析Fig.5 PCA analysis of fungal community in soils at different growth stages

2.5 不同栽培模式下真菌群落組成的聚類分析

采用最短距離法（nearest distance）進(jìn)行聚類分析和樹(shù)狀圖構(gòu)建（multibase＿2014），比較各處理同一時(shí)期真菌種類組成的差異。結(jié)果表明，在同一時(shí)期，各處理間的真菌種類相似性均表現(xiàn)出較大差異?？傮w而言，對(duì)照當(dāng)歸單作（A）與其他處理的相似性較小，距離達(dá)到3.574 6，后期降低到2.451 4，但自始至終自成一類。這一結(jié)果表明，隨土壤環(huán)境條件的變化，土壤中真菌的種類及其群體也出現(xiàn)了較大的變化，同時(shí)也說(shuō)明萬(wàn)壽菊多樣性種植可明顯改變土壤真菌群落的組成；由圖6還可看出，在整個(gè)生長(zhǎng)期間，萬(wàn)壽菊單作（B）與萬(wàn)壽菊／當(dāng)歸輪作（C）真菌種類的相似性程度最高。

圖6 各處理相同時(shí)期根際土壤真菌群落相似性分析Fig.6 Dendrogram of rhizosphere fungus cluster analysis at individual growth stage

3 討論

在土壤生態(tài)領(lǐng)域的研究中，土壤中微生物的多樣性以及微生物所產(chǎn)生的作用方面越來(lái)越受到關(guān)注［17-20］。土壤是各種植物賴以生存的環(huán)境，同時(shí)也是微生物良好的生存場(chǎng)所。合理的輪作或者間作不僅可以改變土壤的理化性質(zhì)，同時(shí)對(duì)土壤微生物的多樣性也有一定的影響，已有研究表明，輪作作物根系分泌的抑菌物質(zhì)對(duì)土壤中寄生病原菌有一定的抑制作用，這對(duì)減少連作產(chǎn)生的病蟲(chóng)害、提高作物產(chǎn)量具有長(zhǎng)遠(yuǎn)的意義［21］。吳鳳芝等在研究黃瓜連作與輪作土壤微生物多樣性的變化及其影響時(shí)提出輪作有利于土壤微生物種群的多樣性，并可以促進(jìn)和改善土壤生態(tài)環(huán)境［22］。但是也有報(bào)道稱輪作對(duì)土壤的微生物多樣性并非有促進(jìn)作用，如婁陽(yáng)洋等發(fā)現(xiàn)與稻田輪作后棉田中細(xì)菌的數(shù)量較棉田連作明顯降低，多樣性平均指數(shù)也相對(duì)略低，這也許與作物種類和栽培方式或環(huán)境有關(guān)［23］。

已有大量的研究表明，萬(wàn)壽菊的化感效應(yīng)（allelopathy）或活性物質(zhì)對(duì)包括多種真菌在內(nèi)的微生物產(chǎn)生明顯抑制作用［5，7，24-25］，而且也有研究報(bào)道認(rèn)為，萬(wàn)壽菊根系分泌物對(duì)土壤中的拮抗微生物群落產(chǎn)生較大影響［9-10］。本研究通過(guò)萬(wàn)壽菊與當(dāng)歸多樣性種植田間試驗(yàn)，分析不同種植方法對(duì)土壤真菌群落的影響，結(jié)果表明，相對(duì)于當(dāng)歸的單作模式，萬(wàn)壽菊可顯著影響土壤真菌群落的組成（條帶變化率為-30.77%和-69.23%），說(shuō)明萬(wàn)壽菊根系分泌物對(duì)土壤真菌可產(chǎn)生顯著的影響。而且，PCA 分析結(jié)果也顯示，不同的栽培方式可形成各自對(duì)應(yīng)的真菌群落，總的趨勢(shì)是降低了土壤真菌的多樣性。但萬(wàn)壽菊的根系分泌物中是何種物質(zhì)在發(fā)揮作用，這些物質(zhì)對(duì)哪些土壤真菌種類有效，尤其是有益真菌變化規(guī)律是什么，以及萬(wàn)壽菊多樣性種植模式是否具有持續(xù)性等問(wèn)題還需要深入細(xì)致的研究。

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