周潔塵，劉君昂，何苑皞，周國英

（經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)濟(jì)林培育與利用湖南省2011協(xié)同創(chuàng)新中心，長沙 410004）

降香黃檀（Dalbergiaodorifera），又名黃花梨，瀕危種，海南特產(chǎn)，豆科蝶形花亞科的常綠喬木［1］。炭疽病是降香黃檀最主要的病害之一，導(dǎo)致葉片逐漸干枯或穿孔，直至脫落，嚴(yán)重影響植株光合作用，以及芯材的形成，且常大面積暴發(fā)［2-3］。國內(nèi)目前降香黃檀炭疽病的防治主要采用化學(xué)防治技術(shù)［4-5］，長期使用化學(xué)藥劑不僅容易使病菌產(chǎn)生抗性，還易導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境污染［6］。植物源農(nóng)藥是從植物中提取有殺蟲或抗菌作用的活性物質(zhì)，直接或間接加工合成的新型農(nóng)藥［7-8］，其優(yōu)點(diǎn)是對環(huán)境影響較小，殘留少等。目前國內(nèi)外研究者越來越重視植物源農(nóng)藥的研究與開發(fā)［9-12］，但針對降香黃檀炭疽病的植物源藥劑還未見報(bào)道。

本文從13種海南入侵植物中，篩選出對降香黃檀炭疽病菌具有良好抑菌活性的植物，為降香黃檀炭疽病的藥劑研制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試病原菌

病原菌菌種為本實(shí)驗(yàn)室從海南省澄邁國營林場的降香黃檀炭疽病葉中分離，單孢分離純培養(yǎng)獲得，鑒定為膠孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）。

1.1.2 供試植物

13種海南入侵植物［13-15］中，勝紅薊、飛機(jī)草、馬纓丹、菊芹、含羞草、木薯皆采自海南省澄邁國營林場，其余植物分別采自海南省其他各市縣。具體植物名錄見表1。

表1 供試植物名錄Table 1 Thirteen invasive plants tested in this study

1.2 植物粗提取物的制備

將各植物洗凈后置于干燥通風(fēng)處陰干至恒重，放入粉碎機(jī)中粉碎，過40 目篩。得到粉末置于40 ℃烘箱中24h后密封保存。

植物粗提物的制備采用冷浸法［16］，分別以乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯作為提取溶劑，固液比為1∶10，室溫下浸泡3次，每次間隔時(shí)間3d，收集3次濾液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，干燥得到粗提物。加入適量無水乙醇溶解，再加蒸餾水，使乙醇濃度為10%，粗提物濃度為100mg／mL。置于冰箱內(nèi)冷藏備用。

1.3 植物提取物抑菌活性測定

采用濾紙片法［17-18］。將病原菌接種于PD 培養(yǎng)液中，160r／min，28℃振蕩培養(yǎng)4d后得孢子懸浮液。取0.2mL菌懸液加入PDA 平板上，涂布均勻。

用打孔器將濾紙打成直徑6 mm 的圓形紙片，滅菌后置于植物提取物中充分浸泡。以10%乙醇溶液為對照。將浸泡后的濾紙片分別放入含菌培養(yǎng)皿中，28 ℃培養(yǎng)，每種藥液重復(fù)3次。2d后觀察測量抑菌圈直徑，比較抑菌效果。選擇抑菌效果較好的3種植物提取物進(jìn)一步進(jìn)行抑菌活性研究。

1.4 3種植物提取物對炭疽病菌的毒力測定

采用菌絲生長速率法［19］，測定垂序商陸和勝紅薊的乙酸乙酯提取物、飛機(jī)草乙醇提取物對降香黃檀炭疽病菌的毒力。取100mg／mL植物提取物加入到滅菌的55℃PDA 培養(yǎng)基中，制成提取物濃度分別為3.125、6.25、12.5、25、50mg／mL的含藥培養(yǎng)基，以加入等體積的10%乙醇溶液為對照，每處理重復(fù)3個(gè)培養(yǎng)皿。用6mm 打孔器在培養(yǎng)4d后的病原菌菌落邊緣切取菌餅，接入含藥培養(yǎng)基中于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d后，用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算菌絲生長抑制率，并進(jìn)行毒力分析，計(jì)算EC50。

菌絲生長抑制率（%）＝［（對照菌落直徑-菌餅直徑）-（處理菌落直徑-菌餅直徑）］／（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100。

1.5 3種植物提取物對炭疽病菌菌絲形態(tài)的影響

挑取1.4培養(yǎng)的分別經(jīng)垂序商陸和勝紅薊的乙酸乙酯提取物、飛機(jī)草乙醇提取物處理的病原菌菌落邊緣菌絲體，放在載玻片上制成玻片標(biāo)本。在光學(xué)顯微鏡下觀察3種植物提取物對病原菌菌絲形態(tài)的影響并拍照［20］。

1.6 兩種植物乙酸乙酯提取物對炭疽病菌生長量的影響

采用菌絲干重法［21］。取6個(gè)錐形瓶，加入等量PD 培養(yǎng)液，滅菌后分別加入適量垂序商陸和勝紅薊乙酸乙酯提取物，使其最終濃度為EC50，混勻后接入0.2mL炭疽病菌孢子懸浮液。160r／min，28 ℃振蕩培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)48、60、72、84、96、120h后取出一個(gè)錐形瓶，抽濾，得到的菌體置于60 ℃烘箱中烘干至恒重。重復(fù)操作3次，并設(shè)不加藥液空白對照組。稱量菌體干重并繪制生長曲線。

1.7 兩種乙酸乙酯提取物最小抑菌濃度（MIC）及最小殺菌濃度（MBC）的測定

將適量100mg／mL植物提取物加入滅菌的55℃PDA 培養(yǎng)基中，制成提取物濃度分別為2.5、5、7.5、10、12.5 mg／mL 的含藥培養(yǎng)基，以加入等體積的10%乙醇溶液為對照，每處理重復(fù)3個(gè)培養(yǎng)皿。移取0.2mL 菌懸液加入含藥培養(yǎng)皿及對照培養(yǎng)皿中，涂布均勻后，置于28℃下培養(yǎng)。2d后觀察病原菌生長情況，不長菌的最低濃度為提取物MIC。

將上述病原菌繼續(xù)培養(yǎng)5d后觀察，不長菌的最低濃度為提取物MBC［22］。

2 結(jié)果與分析

2.1 13種入侵植物粗提物對炭疽病菌的抑菌作用

由表2可知，同種植物的不同溶劑提取物抑菌活性差異較大。13 種植物中只有飛機(jī)草的4 種溶劑提取物都有一定的抑菌活性，但乙醇提取物的抑菌效果最好；空心蓮子草、含羞草和繁縷對炭疽病菌沒有抑菌作用。垂序商陸乙酸乙酯提取物抑菌效果最明顯，勝紅薊乙酸乙酯提取物次之。

表2 13種植物4種溶劑提取物對炭疽病菌的抑菌圈直徑Table 2 Inhibition zones of 13plant extracts with four solvents against Colletotrichum gloeosporioides on Dalbergia odorifera

2.2 3種入侵植物粗提物對炭疽病菌的毒力

表3和圖1為不同濃度垂序商陸乙酸乙酯提取物、勝紅薊乙酸乙酯提取物和飛機(jī)草乙醇提取物對降香黃檀炭疽病菌的抑制作用結(jié)果。進(jìn)一步分析抑菌效果最好的3種植物提取物的殺菌活性，發(fā)現(xiàn)抑菌作用隨提取物濃度的增加而增強(qiáng)，在最低濃度3.125 mg／mL時(shí)，垂序商陸提取物的抑菌率接近50%，而勝紅薊與飛機(jī)草的抑菌率都較低；最高濃度50mg／mL時(shí)，垂序商陸與勝紅薊的抑制率均達(dá)到100%。

垂序商陸乙酸乙酯提取物對降香黃檀炭疽病菌有較強(qiáng)的抑菌作用，其EC50為3.413 mg／mL；勝紅薊乙酸乙酯提取物的抑菌作用略低，EC50為5.849 mg／mL；而飛機(jī)草乙醇提取物的EC50明顯大于垂序商陸和勝紅薊，達(dá)到21.984mg／mL，說明飛機(jī)草提取物抑菌效果明顯差于垂序商陸乙酸乙酯提取物和勝紅薊乙酸乙酯提取物。

表3 3種入侵植物提取物對炭疽病菌的抑菌率1）Table 3 Inhibition rates of 3invasive plant extracts against Colletotrichum gloeosporioides on Dalbergia odorifera

圖1 不同濃度提取物對降香黃檀炭疽病菌的抑制效果Fig.1 Inhibitory effects of plant extracts at different concentrations against Colletotrichum gloeosporioides on Dalbergia odorifera

表4 3種入侵植物提取物對炭疽病菌的相對毒力Table 4 Toxicity of three plant extracts against Colletotrichum gloeosporioides on Dalbergia odorifera

2.3 3種入侵植物粗提物對炭疽病菌菌絲形態(tài)的影響

圖2為降香黃檀炭疽病菌正常菌絲形態(tài)及藥液處理后的菌絲形態(tài)。從圖中可以看出，正常炭疽病菌菌絲長而舒展，粗細(xì)均勻且飽滿，橫隔明顯且較長，兩側(cè)菌絲壁平行且光滑。而3種植物提取物處理組菌絲都表現(xiàn)出菌絲分支增多，菌絲長度變短。垂序商陸提取物處理菌絲內(nèi)產(chǎn)生小液泡，菌絲畸形，橫隔增多且分布不均勻，高濃度處理組細(xì)胞壁破裂，可能是由于橫隔增多導(dǎo)致。勝紅薊提取物處理菌絲粗細(xì)不均，菌絲膨脹，高濃度處理組菌絲體也出現(xiàn)破裂。飛機(jī)草提取物處理分支較前兩種植物多且菌絲短，兩側(cè)菌絲壁不規(guī)則，高濃度處理組菌絲交聯(lián)、膨脹、嚴(yán)重畸形。

2.4 垂序商陸、勝紅薊提取物對炭疽病菌生長量的影響

根據(jù)圖3可知，降香黃檀炭疽病菌經(jīng)歷適應(yīng)期在72h后進(jìn)入對數(shù)生長期，96h后進(jìn)入衰亡期，含藥培養(yǎng)基也呈現(xiàn)相同趨勢。處理組藥液濃度為2.2中提取物EC50，垂序商陸對病原菌菌絲生長量的抑制效果優(yōu)于勝紅薊，其抑制率在50%以上，原因可能是液體培養(yǎng)基中菌絲與培養(yǎng)基接觸更加充分，也更易受有毒物質(zhì)影響。

2.5 垂序商陸、勝紅薊提取物最小抑菌濃度（MIC）及最小殺菌濃度（MBC）

從表5可知，垂序商陸提取物的MIC為5.0mg／mL，MBC 為10 mg／mL；勝紅薊提取物的MIC 為7.5mg／mL，MBC大于12.5mg／mL。垂序商陸提取物的殺菌作用強(qiáng)于勝紅薊提取物。

表5 最小抑菌濃度及最小殺菌濃度測定結(jié)果1）Table 5 The minimum inhibitory concentration and minimal fungicidal concentration

圖2 3種植物提取物對炭疽病菌菌絲形態(tài)的影響Fig.2 Inhibitory effects of 3plant extracts on mycelium morphology of plant pathogen fungi

圖3 垂序商陸及勝紅薊提取物對炭疽病菌生長量的影響Fig.3 Inhibitory effects of Phytolacca americana and Ageratum conyzoides extracts on hyphal increment of plant pathogen fungi

3 討論

海南島自然地理?xiàng)l件優(yōu)越，產(chǎn)生了其多樣性的生態(tài)系統(tǒng)，但也更易于入侵植物的入侵和擴(kuò)散。據(jù)胡雪華等報(bào)道［23］，海南低海拔地區(qū)受飛機(jī)草、含羞草、勝紅薊等多種植物入侵。外來入侵物種危害入侵地的自然生態(tài)系統(tǒng)，降低物種多樣性，對當(dāng)?shù)氐纳鐣?、文化甚至人們的生活也產(chǎn)生嚴(yán)重影響［24］。植物中抑菌有效成分含量普遍較低，需要大量的植物進(jìn)行植物源農(nóng)藥的研制，采用本土其他藥用植物所需成本過高，而選用當(dāng)?shù)厝肭种参锊粌H成本較低，還可變廢為寶，有利于當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展。本試驗(yàn)研究外來入侵植物的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)10 種入侵植物對降香黃檀炭疽病菌有一定的抑菌效果。垂序商陸乙酸乙酯提取物的EC50為3.413 mg／mL，勝紅薊乙酸乙酯提取物以及飛機(jī)草乙醇提取物EC50分別為5.849、21.984mg／mL。

三種植物都有開發(fā)成植物源農(nóng)藥的潛力，尤其是垂序商陸，其乙酸乙酯提取物的MIC 和MBC 分別為5.0 mg／mL 和10 mg／mL。垂序商陸又名美洲商陸，目前在我國的分布較為廣泛。楊幫等［25］發(fā)現(xiàn)垂序商陸的各部分都含有抑菌活性物質(zhì)，醫(yī)學(xué)上常用根作為瀉下逐水的中藥，具止咳、利尿、消腫功能。根據(jù)已有文獻(xiàn)［26］，垂序商陸中主要抑菌成分是美商陸皂苷元，本試驗(yàn)采用提取物為粗提取物，所以有必要分離得到垂序商陸總皂苷，深入研究總皂苷中起主要作用的皂苷成分，并對其抑菌活性以及在菌體內(nèi)部的作用位點(diǎn)進(jìn)行探討，為植物源農(nóng)藥的研制提供理論依據(jù)。

不同植物中所含的有效成分及含量不同，本試驗(yàn)僅用了4種有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，提取方法為冷浸法，其他溶劑及不同提取方法制備的提取物的抑菌活性還有待進(jìn)一步研究。不同有效成分對微生物的作用位點(diǎn)不同，石志琦等［27］研究了蛇床子素對小麥赤霉病菌的抑制機(jī)制，推測其抑菌機(jī)理為蛇床子素阻斷了Na＋內(nèi)流，從而阻止了對葡萄糖的吸收；張龍等［28］的研究表明，仿生合成的擬銀杏殺菌劑鄰烯丙基苯酚（綠帝）和4-丁?；椒樱ㄣy泰）可使小麥紋枯病菌的菌絲分支間距明顯縮短、菌絲伸長減慢。本試驗(yàn)中垂序商陸及勝紅薊不僅導(dǎo)致菌絲變形，甚至可導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂。目前國內(nèi)外植物提取物的研究多集中在室內(nèi)研究，一些研究表明，離體條件下抑菌活性較強(qiáng)的植物提取物在自然條件下抑菌活性較低，這可能是由于自然環(huán)境中影響因素過多，所以如何將植物提取物有效應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐仍是一大難點(diǎn)。

［1］邱治軍，周光益，陳升華.海南特有珍貴紅木樹種—降香黃檀［J］.林業(yè)實(shí)用技術(shù)，2004（6）：41-42.

［2］伍慧雄，莊雪影，溫秀軍，等.降香黃檀病蟲害調(diào)查［J］.廣東林業(yè)科技，2009，25（6）：86-88.

［3］桑利偉，劉愛勤，孫世偉，等.海南降香黃檀炭疽病病原鑒定及防治［J］.熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，29（8）：23-25.

［4］李步斌.降香黃檀炭疽病與防治［J］.中國科技縱橫，2013（2）：88-89.

［5］劉洪灣，李際，林秀蓮.海南降香黃檀病蟲害調(diào)查與防治［J］.農(nóng)業(yè)災(zāi)害研究，2011，1（2）：32-33.

［6］沈寅出，張一賓.生物農(nóng)藥［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：73-74.

［7］史衛(wèi)國，徐之明，黃清臻，等.植物源農(nóng)藥的進(jìn)展［J］.農(nóng)藥科學(xué)與管理，1997（3）：33-35.

［8］Martínez M L，von Poser G，Henriques A，et al.Simaroubaceae and Picramniaceae as potential sources of botanical pesticides［J］.Industrial Crops ＆Products，2013，44：600-602.

［9］馮俊濤，石勇強(qiáng)，張興.56種植物抑菌活性篩選試驗(yàn)［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2001，29（2）：65-69.

［10］Suhaila M，Suzana S S，Ei S，et al.Antimyeotic screening of 58malaysian plants against plant pathogens［J］.Pesticide Science，1997，47：259-264.

［11］梁劍平，李蓉，衛(wèi)增泉，等.六茜素及其衍生物抑菌活性的QSAR 研究［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2002（1）：13-15.

［12］孟昭禮，羅蘭.人工模擬殺菌劑綠帝對8種植物病原菌德室內(nèi)生測［J］.萊陽農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1998，15（3）：159-162.

［13］徐海根，強(qiáng)勝.中國外來入侵物種編目［M］.北京：中國環(huán)境出版社，2004.

［14］彭宗波，蔣英，蔣菊生.海南島外來植物入侵風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)指標(biāo)體系［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2013，32（8）：2029-2034.

［15］范志偉，沈弈德，劉麗珍.海南外來入侵雜草名錄［J］.熱帶作物學(xué)報(bào)，2008，29（6）：781-792.

［16］殷帥文，王慶先，李強(qiáng)，等.20種植物提取物抑制植物病原菌活性研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2009，21（2）：306-311.

［17］李云雁，宋光森.板栗殼提取物抑菌作用研究［J］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2004，24（4）：61-64.

［18］王儲炎.鹿蹄草提取物的抑菌作用和應(yīng)用研究［D］.重慶：西南大學(xué)，2007.

［19］董紅平，趙特，孫淑君，等.肉桂精油對4種重要果蔬病原真菌的生物活性研究［J］.中國生物防治學(xué)報(bào)，2014，30（2）：282-286.

［20］何靜.蒼耳提取物對有害生物抑制機(jī)理的研究［D］.蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

［21］NYT 1156.19-2013農(nóng)藥室內(nèi)生物測定試驗(yàn)準(zhǔn)則殺菌劑第19部分：抑制水稻稻曲病菌試驗(yàn)菌絲干重法［S］.中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，2013.

［22］黨珍，周濤.幾種植物提取液的抑真菌特性及復(fù)配研究［J］.食品科學(xué)，2009，30（23）：88-91.

［23］胡雪華，肖宜安，曾建軍，等.海南霸王嶺自然保護(hù)區(qū)外來入侵植物的調(diào)查和分析［J］.井岡山大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011，32（1）：131-136.

［24］鄭啟恩.外來種飛機(jī)草和紫莖澤蘭的入侵生物學(xué)特征研究［D］.南寧：廣西大學(xué)，2006.

［25］楊幫，丁偉，趙志模，等.美洲商陸和姜黃提取物抑菌活性的研究［J］.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，27（3）：297-304.

［26］楊幫.中藥植物美洲商陸抗菌活性及作用機(jī)理研究［D］.重慶：西南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

［27］石志琦，沈壽國，徐朗萊.蛇床子素對植物病原真菌抑制機(jī)制的初步研究［J］.農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2004，6（4）：28-32.

［28］張龍，孟昭禮，李健強(qiáng)，等.擬銀杏殺菌劑綠帝和銀泰抑制小麥紋枯病菌機(jī)制初探［J］.麥類作物學(xué)報(bào)，2003，23（4）：109-112.