陳 丹，葉 波，劉燕娟，周鑫鈺，雷湘華，段雍明，朱宏建＊

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2.植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410128；3.湖南省安鄉(xiāng)縣農(nóng)業(yè)局，常德 415000）

水稻紋枯病是由立枯絲核菌（Rhizoctoniasolani）引起的導(dǎo)致水稻減產(chǎn)的重要病害［1］，一般可減產(chǎn)10%～30%，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)可達(dá)50%。近年來(lái)，隨著高產(chǎn)雜交稻品種的推廣，施氮水平的提高，水稻復(fù)種指數(shù)的上升，紋枯病的發(fā)生日趨嚴(yán)重。目前我國(guó)水稻紋枯病的防治主要以井岡霉素為主，然而長(zhǎng)期單一使用井岡霉素易導(dǎo)致R.solani產(chǎn)生抗藥性［2］。而化學(xué)藥劑的使用易帶來(lái)農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等問(wèn)題，這些問(wèn)題已引起國(guó)內(nèi)外有關(guān)專家的高度關(guān)注。因此，加快新型農(nóng)藥品種研制和采用拮抗微生物來(lái)防治水稻紋枯病非常必要。

目前，國(guó)內(nèi)外已報(bào)道了多種真菌、細(xì)菌和放線菌等微生物對(duì)水稻紋枯病具有不同程度防治效果［3-8］。Choi等［9］分離得到兩株熒光假單孢桿菌（Pseudomonasfluorescens）mc75和pc78，兩者互作能抑制紋枯病菌肽的生產(chǎn)和生物膜的形成。Wan等［10］報(bào)道，鏈霉菌（Streptomycesplatensis）F-1對(duì)水稻紋枯病有很好的抑制作用。Rabindran等［11］分離了4株對(duì)水稻紋枯病有抑制作用的熒光假單胞菌，其中PfALR2的防治效果最好。王蘭英等［12］從砂仁中分離的4株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)水稻紋枯病有較好的抑菌活性，其中SRJ2-4抑菌效果最好，抑菌帶寬度達(dá)到18mm，與其他菌株相比達(dá)極顯著水平。朱曉飛等［13］分離篩選到對(duì)水稻紋枯病菌有強(qiáng)拮抗作用的解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）YB-3，具有廣譜高效的植物病原菌拮抗活性。崔宇輝等［14］從采自浙江金華市各地的68份土樣中分離篩選到吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）Sh-43對(duì)水稻紋枯病菌具有較強(qiáng)的拮抗作用，其抑菌帶寬度為28.3mm。曹琦琦等［15］從不同土壤、植物和紋枯病菌菌核樣品中分離篩選到對(duì)水稻紋枯病菌具有較強(qiáng)拮抗活性的細(xì)菌和放線菌菌株各1株，菌絲生長(zhǎng)抑制率分別為75.56%和84.07%。

本試驗(yàn)從湖南省郴州市天鵝山風(fēng)景區(qū)采集的土樣中篩選出一株對(duì)水稻紋枯病菌有拮抗活性的放線菌CZB40菌株，能顯著抑制紋枯病菌的菌核形成。結(jié)合形態(tài)、培養(yǎng)特征以及16SrDNA 序列對(duì)其進(jìn)行了分類鑒定，另外對(duì)其發(fā)酵條件及發(fā)酵液的性質(zhì)進(jìn)行了研究，旨在為進(jìn)一步防治水稻紋枯病提供生防材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品土壤樣品采集于湖南省郴州市天鵝山風(fēng)景區(qū)，于室溫下風(fēng)干，待分離。

1.1.2 供試菌株

本研究所涉及的病原菌均為本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存，分別為水稻紋枯病菌（Rhizoctoniasolani）、草莓灰霉病菌（Botrytiscinerea）、稻瘟病菌（Magnaporthegrisea）、辣椒疫霉病菌（Phytophthoracapsici）、辣椒白絹病菌（Sclerotiumrolfsii）、桃褐腐病菌（Moniliniafructicola）。

1.1.3 供試培養(yǎng)基及試劑

發(fā)酵初始培養(yǎng)基配方為：可溶性淀粉20g、蛋白胨3g、K2HPO40.5g、NaCl 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.5g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.2。拮抗試驗(yàn)培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基。所用試劑均由長(zhǎng)沙鵬潤(rùn)生物公司提供的市售生化試劑（分析純）。

1.2 土壤放線菌的分離、保存

采用稀釋涂布平板法［16］進(jìn)行放線菌的分離。將采集的土壤稀釋成不同濃度的土壤稀釋液，分別滴加到含有3‰抑菌劑（K2Cr2O7）的高氏1號(hào)培養(yǎng)基平板上，用無(wú)菌涂布棒涂勻，靜置30min后，將培養(yǎng)皿放在28 ℃溫箱中倒置培養(yǎng)。采用畫線法純化菌株，所得菌株斜面保存，備用。

1.3 水稻紋枯病拮抗菌的篩選及測(cè)定

按照朱宏建等［17］的方法進(jìn)行拮抗放線菌的篩選及測(cè)定。用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾發(fā)酵液。采用含毒介質(zhì)法進(jìn)行拮抗測(cè)定，每皿中加入菌株過(guò)濾液原液3mL，倒入12mL PDA 培養(yǎng)基（55℃左右）混勻，制成平板，待冷卻后，每皿中央接種水稻紋枯病菌菌餅（直徑5mm），設(shè)清水對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。靜置1h后放入28℃恒溫箱中培養(yǎng)，待對(duì)照菌落長(zhǎng)滿整個(gè)平板，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，記錄結(jié)果并按下式計(jì)算抑制率：

1.4 拮抗菌株對(duì)紋枯病菌菌核形成及萌發(fā)的影響

將生長(zhǎng)狀況一致，直徑為5 mm 的紋枯病菌菌餅置于經(jīng)細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾后的發(fā)酵液與PDA 混合的培養(yǎng)基上，置于28 ℃培養(yǎng)，記錄菌核形成的時(shí)間及菌核數(shù)目。

拮抗菌株對(duì)紋枯病菌菌核萌發(fā)的影響按照鄭愛萍等［18］的方法進(jìn)行。將滅菌的載玻片浸入融化的PDA 瓊脂中，使之附上一層瓊脂，取出放在培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿1片，皿內(nèi)加5mL無(wú)菌水保濕。選取大小、形成時(shí)間一致的菌核置于發(fā)酵菌液中（濃度稀釋為108cfu／mL）處理10s，然后放在附有瓊脂的載玻片上，每片3粒，粒距1.5cm，每處理8片24粒，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后鏡檢菌核的萌發(fā)情況。菌絲的萌發(fā)指數(shù)測(cè)定［19］：在玻片背面距菌核邊緣2 mm 處畫一圈，低倍鏡下觀察，以菌絲長(zhǎng)出圈外者定為萌發(fā)菌絲。萌發(fā)菌絲按以下標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)：0—萌發(fā)菌絲數(shù)為0；1—萌發(fā)菌絲數(shù)為1～20；2—萌發(fā)菌絲數(shù)為21～50；3—萌發(fā)菌絲數(shù)為51～80；4—萌發(fā)菌絲數(shù)為81～140；5—萌發(fā)菌絲數(shù)在140以上。再按以下公式計(jì)算菌絲萌發(fā)指數(shù)：

1.5 拮抗菌株CZB40的分類鑒定

1.5.1 拮抗菌株CZB40形態(tài)觀察和生理生化特性

形態(tài)觀察及生理生化測(cè)定方法均按照阮繼生和Kauffmann 等［20-21］的方法進(jìn)行。

1.5.2 拮抗菌株的分子生物學(xué)鑒定

1.5.2.1 放線菌株DNA 的提取與PCR 擴(kuò)增

參照Kauffmann 等［22］及Nikodinovic等［23］的方法提取放線菌基因組DNA，并采用通用引物1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）和27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30s，56 ℃復(fù)性30s，72 ℃延伸90s，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10min。用1.0%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。采用北京天根生化科技有限公司的瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒回收目的片段，并采用該公司的pGM-T 克隆試劑盒進(jìn)行PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的連接以及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。挑選陽(yáng)性克隆送上海生工生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.5.2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

將測(cè)定的16SrDNA 序列提交到GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)，用BLAST 軟件與GenBank中已知的16SrDNA 序列進(jìn)行同源性比較，選取屬內(nèi)同源性較高的放線菌16SrDNA 序列，用MEGA 4.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，繪制菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹［24］。

1.6 拮抗菌CZB40的抗菌譜測(cè)定

操作方法同1.3。

1.7 發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.7.1 碳、氮源的優(yōu)化

采用單因子變量法，分別以大米粉、蔗糖、馬鈴薯淀粉、玉米粉、麥芽糖、葡萄糖代替對(duì)照培養(yǎng)基中的碳源（可溶性淀粉），進(jìn)行碳源的優(yōu)化；分別以酵母粉、硝酸鉀、大豆粉、硝酸鈉、硫酸銨代替對(duì)照培養(yǎng)基中的氮源（蛋白胨），進(jìn)行氮源優(yōu)化。刮取1.3中篩選到的菌株的孢子接入三角瓶（300 mL 容量）的100mL液體種子培養(yǎng)基中，28 ℃，200r／min振蕩培養(yǎng)48h；液體種子以5%的接種量接入含100mL各種培養(yǎng)基中的三角瓶中（300 mL 容量），28 ℃，200r／min發(fā)酵培養(yǎng)72h。按照1.3中的方法，測(cè)定各個(gè)處理的抑菌效果。

1.7.2 均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化發(fā)酵條件

用獲得的最優(yōu)碳、氮源代替對(duì)照培養(yǎng)基中的碳、氮源作為發(fā)酵培養(yǎng)基，并將碳源、氮源、NaCl、Mg-SO4、K2HPO4、pH、溫度作為影響發(fā)酵條件的7 個(gè)因素，每個(gè)因素分別按一定濃度梯度設(shè)置5個(gè)水平，設(shè)計(jì)U20（57）的均勻設(shè)計(jì)表。按照1.3中的方法，將各個(gè)處理的發(fā)酵液稀釋5倍，進(jìn)行抑菌效果測(cè)定。

1.8 發(fā)酵液穩(wěn)定性的測(cè)定

1.8.1 紫外照射穩(wěn)定性測(cè)定

取CZB40菌株發(fā)酵液100mL置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，在距20 W 紫外燈10cm 處，分別照射1、3、5、7、9、12h，然后用含毒介質(zhì)法測(cè)定其抑菌活性，并以未處理的發(fā)酵液為對(duì)照。

1.8.2 pH 穩(wěn)定性測(cè)定

將菌株發(fā)酵液用1mol／L的NaOH 和1mol／L的HCl分別調(diào)至pH 為4、5、6、7、8、9、10，靜置2h后將其分別調(diào)回自然pH（pH＝7.3），測(cè)定抑菌活性，并以未處理的發(fā)酵液為對(duì)照。

1.8.3 熱穩(wěn)定性測(cè)定

將等體積的菌株發(fā)酵液分別在50、60、70、80、90、100 ℃下處理1h，室溫冷卻，未經(jīng)處理的發(fā)酵液作為對(duì)照，測(cè)定抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 放線菌的分離篩選及拮抗活性測(cè)定

圖1 菌株CZB40與水稻紋枯病菌對(duì)峙培養(yǎng)Fig.1 Strain CZB40confrontation culture with Rhizoctonia solani

從郴州市天鵝山自然風(fēng)景區(qū)采集的18份土壤中篩選得到217個(gè)放線菌菌落，以水稻紋枯病菌為指示菌，篩選出5 株具有拮抗作用的菌株，其中以CZB40菌株的抑菌效果最好（圖1），該菌株的5 倍無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)指示菌的菌絲生長(zhǎng)抑制效果也十分顯著（圖2）其抑制率高達(dá)90.45%。

圖2 菌株CZB40對(duì)水稻紋枯病菌的抑制作用Fig.2 Inhibition of the strain CZB40 against Rhizoctonia solani

2.2 CZB40菌株對(duì)水稻紋枯菌菌核形成及萌發(fā)的影響

按1.4小節(jié)方法處理后，菌核的菌絲萌發(fā)指數(shù)降低了56.30%，菌核形成時(shí)間延長(zhǎng)了36h，平均每皿形成的菌核數(shù)僅為2粒，而以清水為對(duì)照處理的每皿形成的菌核數(shù)為17粒（表1）。

表1 CZB40菌株對(duì)紋枯病菌菌核形成及萌發(fā)的影響（6次重復(fù)）1）Table 1 Effects of CZB40strain on sclerotium formation and germination against Rhizoctonia solani（6replicates）

2.3 放線菌CZB40菌株的分類鑒定

2.3.1 CZB40菌株的形態(tài)特征

CZB40菌株在高氏1號(hào)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，菌落緊密，基內(nèi)菌絲深紅褐色，后期深橙色至紅褐色，可溶色素褐黃色。氣生菌絲很豐富，在掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，氣生菌絲體形成孢子鏈時(shí)，孢子絲直、柔曲，孢子呈長(zhǎng)圓柱形，表面光滑（圖3）。

2.3.2 CZB40菌株的分子生物學(xué)鑒定

PCR擴(kuò)增及上海生工生物工程有限公司測(cè)序及拼接結(jié)果顯示，CZB40菌株的16SrDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為1 474bp。將菌株的16SrDNA 序列提交至GenBank中（KJ751551），并用BLAST 軟件與Gen-Bank中已公開的16SrDNA序列進(jìn)行同源性比較，計(jì)算所測(cè)定的CZB40菌株的16SrDNA 全序列遺傳距離，并根據(jù)遺傳距離用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。結(jié)果表明，CZB40菌株與極暗黃鏈霉菌（S.fulvissimus）的16SrDNA序列相似性達(dá)到99%。

圖3 放線菌CZB40菌株的孢子形態(tài)Fig.3 Morphology of the spores of strain CZB40

圖4 菌株CZB40的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain CZB40

2.3.3 生理生化特性

CZB40菌株在高氏1號(hào)固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)產(chǎn)生褐黃色色素。菌株能分解利用纖維素，使明膠液化，能水解淀粉，能產(chǎn)生硫化氫，能使牛奶胨化，但不能使牛奶凝固。根據(jù)生理生化特征分析，再結(jié)合形態(tài)學(xué)與培養(yǎng)特征及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，將其鑒定為極暗黃鏈霉菌（S.fulvissimus）。

2.4 菌株CZB40抗菌譜測(cè)定結(jié)果

抗菌譜測(cè)定結(jié)果表明，該菌株的發(fā)酵濾液對(duì)供試的多種植物病原菌均有抑制作用，菌絲生長(zhǎng)抑制率為27.94%～85.71%（表2）。其中，對(duì)桃褐腐病菌的抑菌效果較好，抑制率達(dá)到85.71%。在5%和1%水平上顯著高于其他幾種病原菌。

2.5 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.5.1 不同碳、氮源對(duì)菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響

在供試的6種碳源和5種氮源中，最優(yōu)的碳源是玉米粉，對(duì)指示菌的生長(zhǎng)抑制率為91.76%，最優(yōu)的氮源是酵母粉，抑制率為92.50%（表3）。所以，選擇玉米粉和酵母粉作為最優(yōu)的碳源、氮源進(jìn)行發(fā)酵條件研究。

表2 菌株CZB40對(duì)病原菌的抑制效果1）Table 2 Inhibition of strain CZB40against the fungal phytopathogens

表3 不同碳源、氮源對(duì)菌株CZB40發(fā)酵液抑菌活性的影響1）Table 3 Effects of different carbon and nitrogen sources on the antibacterial activity of fermentation broth of strain CZB40

2.5.2 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件

選擇最優(yōu)碳源（玉米粉）、最優(yōu)氮源（酵母粉）、NaCl、MgSO4、K2HPO4、pH、溫度為影響發(fā)酵條件的7個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)置5個(gè)水平，共20個(gè)處理，設(shè)計(jì)U20（57）的均勻設(shè)計(jì)表。將菌株CZB40按表中設(shè)計(jì)的20種發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵，試驗(yàn)結(jié)果用DPS數(shù)據(jù)庫(kù)處理系統(tǒng)進(jìn)行分析和統(tǒng)計(jì)，得到各個(gè)發(fā)酵條件下的濾液對(duì)水稻紋枯病菌的抑制效果，在濾液稀釋10倍時(shí)對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制率最高達(dá)到94.85%，比優(yōu)化前明顯提高（表4）。從表中可知，該菌株的最優(yōu)發(fā)酵條件是玉米粉25g／L、酵母粉5g／L、MgSO40.2g／L、NaCl 0.8g／L、K2HPO40.4g／L、水1 000mL、29℃、pH 6.0。

表4 均勻設(shè)計(jì)發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果1）Table 4 The results of uniform design optimization of fermentation conditions

對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性相關(guān)分析和逐步回歸分析，本例擬合的線性回歸方程和逐步回歸方程經(jīng)方差分析檢驗(yàn)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），因此做線性擬合不合理。再進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸，結(jié)果如下：

模型統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果如下：方程的相關(guān)系數(shù)r＝0.915，F(xiàn)＝7.06，F(xiàn)0.05（8，11）＝2.95，F(xiàn)0.01（8，11）＝4.74，F(xiàn)＞F0.01（8，11）＞F0.05（8，11）。根據(jù)F檢驗(yàn)，回歸方程有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中P＝0.002 1（＜0.05），顯著。按該數(shù)學(xué)模型得到的最佳培養(yǎng)條件是：玉米粉25g／L、酵母粉5g／L、NaCl 0.8g／L、MgSO40.2g／L、K2HPO40.4g／L、pH＝6、T＝29℃。各自變量偏回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表5，菌株發(fā)酵液對(duì)水稻紋枯病菌抑制作用影響最大的變量從大到小依次是：X1X6＞X1X4＞X6X7＞X1X5＞X4X5＞X3X4＞X2X3＞X4X7。

表5 各自變量偏回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 5 Partial regression independent variables significance test of convergence

2.6 抑菌活性成分的特性分析

2.6.1 紫外穩(wěn)定性

菌株發(fā)酵液距20 W 紫外燈10cm 照射1、3、5、7、9、12h后，與原發(fā)酵液相比較，對(duì)水稻紋枯病菌的抑制率變化不大，說(shuō)明菌株CZB40發(fā)酵液對(duì)紫外線不敏感。

2.6.2 酸堿穩(wěn)定性

放線菌菌株CZB40發(fā)酵液在酸性和堿性條件下比較敏感，穩(wěn)定性差。分別用1mol／L 的HCl和1mol／L的NaOH 調(diào)原發(fā)酵液pH 至4.0和10.0，處理2h后，調(diào)回至原發(fā)酵液的pH，對(duì)水稻紋枯病菌的抑制率為53.80%和52.58%，與原發(fā)酵液90.45%相比，下降明顯（圖5）。因此在發(fā)酵液活性物質(zhì)分離純化和使用過(guò)程中應(yīng)盡量保持pH 6～7的條件。

2.6.3 熱穩(wěn)定性

放線菌菌株CZB40 發(fā)酵液熱穩(wěn)定性較好。與原發(fā)酵液相比，在50 ℃以下處理1h后，抑制率沒(méi)有變化。隨著溫度的升高，對(duì)水稻紋枯病菌的抑制率開始出現(xiàn)下降，在100 ℃處理1h后，抑制率為68.78%，與原發(fā)酵液90.45%相比，僅下降了21.67%（圖6），說(shuō)明菌株CZB40發(fā)酵液能耐高溫。

圖5 不同pH 對(duì)CZB40發(fā)酵液活性的影響Fig.5 Effects of different pH values on the activity of fermentation extracts of CZB40

圖6 不同溫度對(duì)CZB40發(fā)酵液活性的影響Fig.6 Effects of different temperatures on the activity of fermentation extracts of CZB40

3 討論

目前研究者普遍認(rèn)為：菌核在水稻紋枯病的傳播中起重要作用，但目前報(bào)道的生防菌作用機(jī)制都是基于抑制病原菌菌絲生長(zhǎng)為靶標(biāo)的，抑制菌核形成的生防放線菌鮮有報(bào)道。鄭愛萍等［18］曾報(bào)道過(guò)致黃假單胞菌對(duì)水稻紋枯病菌菌核形成具有明顯抑制作用，并能使菌核的菌絲萌發(fā)率降低69.0%。張慧雯等［25］曾報(bào)道鏈霉菌702所產(chǎn)生的抗真菌活性物質(zhì)，對(duì)水稻紋枯病菌的EC50為1.128 05mg／L，且對(duì)菌核萌發(fā)有較強(qiáng)的抑制作用。因此，篩選抑制紋枯病菌菌核形成及萌發(fā)的生防菌在生產(chǎn)上更有應(yīng)用價(jià)值。本研究篩選到的生防放線菌菌株CZB40對(duì)紋枯病菌菌絲生長(zhǎng)抑制率高達(dá)90.45%，并且能使菌核的菌絲萌發(fā)指數(shù)降低56.30%，顯著抑制菌核的形成。

鏈霉菌產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)多為次級(jí)代謝產(chǎn)物，其生產(chǎn)效率不僅與菌種自身的性能相關(guān)，而且還要有最優(yōu)的發(fā)酵條件。本研究對(duì)放線菌菌株CZB40需要的碳源、氮源進(jìn)行了篩選，在此基礎(chǔ)上對(duì)其發(fā)酵條件，如溫度、pH、NaCl、MgSO4、K2HPO4等，進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化。另外對(duì)菌株CZB40發(fā)酵液性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，這些研究結(jié)果為該菌株抗菌化合物的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和拮抗機(jī)理的研究奠定了基礎(chǔ)。

極暗黃鏈霉菌（S.fulvissimus）是一種能產(chǎn)生重要活性物質(zhì)的放線菌，已經(jīng)有大量研究人員對(duì)其代謝產(chǎn)物進(jìn)行了報(bào)道。Malik 等［26］發(fā)現(xiàn)S.fulvissimus分泌抗菌蛋白，該蛋白表現(xiàn)出對(duì)金黃葡萄球菌（Staphylococcusaureus）MRSA 菌株有顯著抑菌作用。它可能成為用于控制耐藥性革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌新藥物的重要來(lái)源。Ohbuchi等［27］報(bào)道S.fulvissimus產(chǎn)生溶解酶制劑，表現(xiàn)出N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和溶菌酶活性，可以迅速裂解細(xì)菌細(xì)胞。

本研究是國(guó)內(nèi)首次報(bào)道使用極暗黃鏈霉菌（S.fulvissimus）拮抗水稻紋枯病菌。獲得的菌株CZB40具有較高的殺菌活性和穩(wěn)定性，可能是一種高效的新型生物農(nóng)藥的出發(fā)菌株，具有良好的開發(fā)前景，進(jìn)一步的研究可從宏觀方面對(duì)菌株CZB40發(fā)酵液中抗菌活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定，并通過(guò)小區(qū)試驗(yàn)、田間試驗(yàn)檢驗(yàn)其生防效果，進(jìn)一步開發(fā)為生物農(nóng)藥；從微觀方面可應(yīng)用分子生物學(xué)手段研究其拮抗物質(zhì)生物合成的功能基因及合成機(jī)理，并通過(guò)對(duì)野生菌株進(jìn)行改良，使之符合生防要求。目前，本課題組已經(jīng)開始分離純化菌株CZB40發(fā)酵液中抗菌活性物質(zhì)的主要成分。

［1］孟慶忠，劉志恒，王鶴影，等.水稻紋枯病研究進(jìn)展［J］.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，32（5）：376-381.

［2］孫海燕，丁曉菲，杜文珍，等.江蘇、河南、安徽和山東四省小麥紋枯病菌對(duì)井岡霉素的敏感性監(jiān)測(cè)［J］.農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13（6）：653-656.

［3］史鳳玉，朱英波，楊文蘭.長(zhǎng)枝木霉T8對(duì)水稻紋枯病菌拮抗的作用研究［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2005，21（2）：264-265.

［4］王艷麗，沈瑛，徐同.哈茨木霉防治水稻紋枯病研究［J］.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2000，27（2）：97-101.

［5］柳良好，徐同.哈茨木霉幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)及其對(duì)水稻紋枯病菌的拮抗作用［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2003，33（4）：359-363.

［6］Kazempour M N.Biological control ofRhizoctoniasolani，the causal agent of rice sheath blight by antagonistics bacteria in greenhouse and field conditions［J］.Plant Pathology Journal，2004，3（2）：88-96.

［7］張德濤，彭正凱，曹琦琦，等.3株拮抗菌在水稻植株上的定殖能力及對(duì)紋枯病的防效［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，40（2）：97-102.

［8］張亞，廖曉蘭，曾曉楠，等.鴨糞中1株水稻紋枯病菌拮抗細(xì)菌的鑒定［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2010，40（5）：517-521.

［9］Choi G J，Kim J C，Park E J，et al.Biological control activity of two isolates ofPseudomonasfluorescensagainst rice sheath blight［J］.Plant Pathology Journal，2006，22（3）：289-294.

［10］Wan M G，Li G Q，Zhang J B，et al.Effect of volatile substances ofStreptomycesplatensisF-1on control of plant fungal diseases［J］.Biological Control，2008，46（3）：552-559.

［11］Rabindran R，Vidhyasekaran P.Development of a formulation ofPseudomonasfluorescensPfALR2for management of rice sheath blight［J］.Crop Protection，1996，15（8）：715-721.

［12］王蘭英，謝穎，廖鳳仙，等.水稻紋枯病生防內(nèi)生菌糖蜜草固氮螺菌的分離與鑒定［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2012，42（4）：425-430.

［13］朱曉飛，張曉霞，牛永春，等.一株抗水稻紋枯病菌的解淀粉芽胞桿菌分離與鑒定［J］.微生物學(xué)報(bào)，2011，51（8）：1128-1133.

［14］崔宇輝，王媛媛，汪鵬榮，等.一株拮抗紋枯病菌放線菌的篩選及鑒定［J］.浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，35（4）：441-445.

［15］曹琦琦，周登博，鄭麗，等.水稻紋枯病菌拮抗菌的篩選、鑒定及培養(yǎng)條件探索［J］.中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2013，29（2）：270-276.

［16］胥秀英，鄭一敏，溫壽禎，等.土壤放線菌分離方法的初步研究［J］.生物學(xué)雜志，2000，17（2）：16-17.

［17］朱宏建，歐陽(yáng)小燕，周倩，等.一株辣椒尖孢炭疽病菌拮抗菌株的分離鑒定與發(fā)酵條件優(yōu)化［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2012，42（4）：418-424.

［18］鄭愛萍，李平，王世全，等.水稻紋枯病菌強(qiáng)拮抗菌B34的分離與鑒定［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2003，33（1）：81-85.

［19］李華榮，肖建國(guó)，顏思齊.蠟質(zhì)芽孢桿菌R2防治水稻紋枯病研究［J］.植物病理學(xué)報(bào)，1993，23（2）：101-104.

［20］中國(guó)科學(xué)院微生物研究所放線菌分類組.鏈霉菌鑒定手冊(cè)［M］.北京：科學(xué)出版社，1975.

［21］阮繼生，劉志恒，梁立儒，等.放線菌研究及應(yīng)用［M］.北京：科學(xué)出版社，1990.

［22］Kauffmann I M，Schmitt J，Schmid R D.DNA isolation from soil samples for cloning in different hosts［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2004，64（5）：665-670.

［23］Nikodinovic J，Barrow K D，Chuck J A.High yield preparation of genomic DNA fromStreptomyces［J］.BioTechniques，2003，35（5）：932-936.

［24］Tamura K，Dudley J，Nei M，et al.MEGA4：molecular evolutionary genetics analysis（MEGA）software version 4.0［J］.Molecular Biology and Evolution，2007，24（8）：1596-1599.

［25］張慧雯，薛秀園，張智平，等.鏈霉菌702所產(chǎn)抗真菌物質(zhì)對(duì)水稻紋枯病菌的抑菌機(jī)制研究［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，29（1）：38-42.

［26］Malik H，Sur B，Singhal N，et al.Antimicrobial protein fromStreptomycesfulvissimusinhibitory to methicillin resistantStaphylococcusaureus［J］.Indian Journal of Experimental Biology，2008，46（6）：254-257.

［27］Ohbuchi K，Hasegawa K，Hamachi M.et al.Isolation of a new lytic enzyme for hiochi bacteria and other lactic acid bacteria［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2001，91（5）：487-492.