廖靜靜，張立猛，張瀟丹，鄭 祥，3，焦永鴿，何霞紅，朱書生，楊 敏＊

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201；2.云南省煙草公司玉溪市公司，玉溪 653100；3.云南省昭通市林業(yè)有害生物監(jiān)測檢驗(yàn)中心，昭通 657000）

辣椒疫霉菌（PhytophthoracapsiciLeonian）侵染辣椒引起的辣椒疫病是生產(chǎn)上一種難以防治的土傳卵菌病害［1］。實(shí)踐表明，利用作物輪作或間作是控制土傳病害的重要方式之一［2-3］，尤以利用蔥屬作物進(jìn)行輪作或間作對土傳病害的控制效果最為明顯［4-6］。利用作物輪作或間作能控制土傳病害可能與作物釋放的化感物質(zhì)對土傳病菌的抑制作用有關(guān)。

研究表明，植物產(chǎn)生的化感物質(zhì)可以通過地上部揮發(fā)、雨霧淋溶、根分泌、殘?bào)w降解、種子和花粉等途徑釋放到環(huán)境中起作用［7］。其中根分泌是植物釋放化感物質(zhì)到根際土壤的主要途徑，這些分泌物直接與土壤中微生物互作，為土壤微生物提供碳源、氮源和能量的同時(shí)也對某些病原真菌、細(xì)菌和線蟲等具有抑制活性，從而在一定程度上達(dá)到控制土傳病害的效果［8-13］。根系分泌物分為滲出物、分泌物、植物黏液、膠質(zhì)和裂解物，其中也包含釋放的健康組織有機(jī)物和衰老表面細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)含物的分解產(chǎn)物等［14］。目前人們對蔥屬作物組織提取液及根系分泌物中的抑菌活性成分研究較多［15-17］，但對根冠細(xì)胞脫落物及其對病原菌的抑制作用研究較少。

植物根冠細(xì)胞脫落物包括根緣細(xì)胞（border cells，BCs）和類似根緣細(xì)胞（border-like cells，BLCs）［18］。目前研究表明，BCs在脫離植物根冠之后，仍然具有多種生物學(xué)功能，例如能減少植物根系生長過程中與土壤的摩擦作用［19］；BCs分泌物能螯合土壤中的鋁離子，使植物免受鋁危害等［20-22］；BCs還能分泌產(chǎn)生一些蛋白、酶或抑菌活性物質(zhì)等，幫助植物抵抗病原微生物的侵染［23-24］；豌豆的BCs會(huì)分泌產(chǎn)生大量的豌豆素，保護(hù)根尖區(qū)域免受根腐絲囊霉（AphanomyceseuteichesDrechsler）的侵染［25］。目前，對蔥屬作物根冠細(xì)胞脫落物的種類及其是否對病原菌具有抑制活性還鮮有報(bào)道。

本文以大蒜為研究對象，分析大蒜根冠細(xì)胞脫落物的類型及其產(chǎn)生條件，并深入研究細(xì)胞脫落物水培液對辣椒疫霉菌的抑菌活性，以期為利用大蒜和辣椒輪作或間作控制辣椒疫病提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和植物材料

供試?yán)苯芬呙咕闏-1：由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)種子病理與藥理實(shí)驗(yàn)室提供。

供試植物材料：白蒜蒜瓣，購于農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 大蒜離體根的培養(yǎng)

試驗(yàn)參照Brigham 等［23］和Hawes等［26］的 方法，略有改動(dòng)。將蒜瓣去皮，2.5%次氯酸鈉溶液表面消毒20min，無菌水沖洗3次。在直徑15cm 的培養(yǎng)皿中倒入100mL 2%水瓊脂，冷凝后鋪一層無菌濾紙，將表面消毒后的蒜瓣依次置于濾紙片上，每皿10～12個(gè)蒜瓣。20℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)7d獲得大蒜離體根。

1.3 大蒜BLCs細(xì)胞形態(tài)及在水中的動(dòng)態(tài)分散過程

利用0.5mm 直徑毛細(xì)管制成U 形槽（圖1），然后置于載玻片上，將大蒜離體根放置在U 形槽中，加蓋蓋玻片，從加液口向U 形槽中加滿無菌水，利用蔡司倒置熒光顯微鏡分別在30、60、120、180、240、300s拍照，得到大蒜BLCs在水中隨時(shí)間分散的動(dòng)態(tài)情況。

圖1 觀察根尖BLCs在水中分散過程的裝置Fig.1 The device for observing root border-like cell dispersion in water

細(xì)胞形態(tài)的觀察：在U 形槽中加入無菌水稀釋30 倍的Calcofluor 熒光染料染色細(xì)胞壁5～10min，在蔡司倒置熒光顯微鏡下利用紫外光激發(fā)后，觀察細(xì)胞列（sheets of attached cells）。

1.4 大蒜BLCs最適產(chǎn)生條件的確定

為明確不同溫濕度及根長對大蒜BLCs產(chǎn)生的影響，試驗(yàn)比較了6 個(gè)溫度（10、15、20、25、30 和35 ℃）和3個(gè)水瓊脂濃度（1.0%、1.5%和2.0%）條件下大蒜BLCs產(chǎn)生的差異。采用1.2小節(jié)的水瓊脂法培養(yǎng)大蒜根系，培養(yǎng)7d后，取不同長度大蒜根（2、5、10、15、20、25 和30 mm）放置在U 形槽裝置中，加無菌水，顯微鏡下觀察根冠BLCs分散5 min后的面積，拍照記錄，每處理10次重復(fù)。利用2mm×2mm 透明方格紙統(tǒng)計(jì)BLCs分散的面積，根據(jù)面積大小初步估計(jì)不同溫度、水瓊脂濃度和根長下BLCs產(chǎn)生及分散的情況。

1.5 大蒜BLCs水培液的制備

采用1.2小節(jié)的試驗(yàn)方法獲得大蒜離體根。將根尖1cm 左右浸入無菌水中（最終濃度34根／mL），用移液槍將BLCs從根冠洗脫，再將細(xì)胞懸浮液10 000r／min離心1 min，棄上清液獲得大蒜BLCs。大蒜BLCs用無菌水沖洗3次，最后加入200μL無菌水制成細(xì)胞懸浮液。將該懸浮液25 ℃培養(yǎng)0.5h和1h后取出，離心獲得的上清液即為BLCs水培液。

1.6 大蒜BLCs水培液對辣椒疫霉抑菌活性的測定

1.6.1 BLCs水培液對孢子囊釋放的影響

將上述培養(yǎng)不同時(shí)間后獲得的BLCs水培液與孢子囊懸浮液（104個(gè)孢子囊／mL）各20μL滴加到凹玻片上混勻，20℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)20min后在顯微鏡下觀察空孢子囊的數(shù)量，以無菌水處理作為對照。每處理設(shè)置3次重復(fù)，共計(jì)數(shù)100個(gè)孢子囊，統(tǒng)計(jì)空囊率?？漳衣剩?）＝（已釋放孢子囊數(shù)目／100）×100。

1.6.2 BLCs水培液對游動(dòng)孢子游動(dòng)的影響

將BLCs水培液與游動(dòng)孢子懸浮液（濃度為106個(gè)孢子／mL）各20μL滴加到凹玻片上混勻，在顯微鏡下觀察共培養(yǎng)5、15、30、40min后游動(dòng)孢子游動(dòng)和休止的情況，以無菌水為對照，確定BLCs水培液對游動(dòng)孢子游動(dòng)的影響。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007和SPSS 17.0分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜BLCs細(xì)胞類型

大蒜根冠細(xì)胞脫落物不能完全分散成單個(gè)細(xì)胞，除根冠頂端的橢圓和長橢圓形細(xì)胞彼此分散外（圖2a、d），根冠兩側(cè)的長形細(xì)胞都彼此粘連，形成細(xì)胞列（sheets of attached cells）［27］（圖2a、b和c）。這些細(xì)胞彼此粘連與擬南芥及十字花科植物的類似根緣細(xì)胞（BLCs）的特征相近［27］，因此，確定大蒜根冠細(xì)胞脫落物為類似根緣細(xì)胞（BLCs），主要由根冠頂端的橢圓和長橢圓形細(xì)胞和根冠兩側(cè)的長形細(xì)胞組成。

圖2 大蒜根尖BLCs細(xì)胞類型Fig.2 Cell types of garlic root border-like cells

2.2 大蒜BLCs在水中的動(dòng)態(tài)分散過程

試驗(yàn)結(jié)果表明（圖3），大蒜根尖浸入水中后，BLCs在1min內(nèi)開始迅速分散，5min時(shí)細(xì)胞已經(jīng)擴(kuò)展較完全。不同層面的細(xì)胞逐漸鋪開，在根冠周圍形成細(xì)胞列或分散的單個(gè)細(xì)胞。

圖3 大蒜BLCs在水中動(dòng)態(tài)分散過程Fig.3 The dynamic dispersion process of garlic border-like cells in water

2.3 大蒜BLCs產(chǎn)生最適條件的確定

2.3.1 溫度和水瓊脂濃度對大蒜根系生長的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明（表1），溫度是影響大蒜生根率的主要因素。15 ℃和20 ℃時(shí)大蒜生根率差異不顯著，20 ℃最適于大蒜根系的生長。隨著溫度的升高和降低，大蒜生根率都逐漸降低，高溫比低溫更不適宜大蒜根系的生長。在供試的3個(gè)水瓊脂濃度條件下，水瓊脂濃度越高，越不適宜大蒜根系的生長。

表1 不同溫度和水瓊脂濃度下大蒜生根率1）Table 1 The garlic rooting rate at different temperatures and water agar concentrations

同一水瓊脂濃度下，不同溫度對每一蒜瓣的生根數(shù)量影響顯著（表2），20 ℃時(shí)每一蒜瓣的生根數(shù)最多，35 ℃時(shí)生根數(shù)最少。溫度偏高或偏低時(shí)，蒜瓣生根數(shù)逐漸減少，高溫對每一蒜瓣生根數(shù)的影響較低溫更顯著。同一溫度條件下，不同水瓊脂濃度對每一蒜瓣的生根數(shù)影響不顯著。

表2 不同溫度和水瓊脂濃度條件下每一蒜瓣的生根數(shù)1）Table 2 The number of roots on each garlic bulb at different temperatures and water agar concentrations

2.3.2 溫度、水瓊脂濃度和根長對BLCs產(chǎn)生的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，不同溫度、水瓊脂濃度和根長組合對大蒜BLCs的分散面積存在不同的影響，根長和溫度或濕度的二因素組合，以及根長、溫度和濕度的三因素組合對BLCs的產(chǎn)生表現(xiàn)顯著影響，而溫度和濕度的兩因素組合對BLCs的產(chǎn)生無明顯影響（表3，4）。由此推測根長是影響大蒜BLCs產(chǎn)生的主導(dǎo)因素。

表3 不同溫度和水瓊脂濃度及根長下BLCs分散面積1）Table 3 The dispersion areas of garlic root border-like cells in water at different temperatures，water agar concentrations and root lengths

表4 不同溫度、水瓊脂濃度和根長組合對大蒜BLCs產(chǎn)生影響的多因素方差分析1）Table 4 Multivariate analysis of the influences of different combinations with temperature，water agar concentration and root length on the production of garlic BLCs

續(xù)表4 Table 4（Continued）

多重比較結(jié)果可以看出，在20 ℃、2.0%水瓊脂濃度和根長25～30 mm 條件下，更利于大蒜BLCs的產(chǎn)生。溫度過高或過低，水瓊脂濃度較低且根長較短的條件下，均不利于大蒜BLCs的產(chǎn)生。

2.4 大蒜BLCs對辣椒疫霉的抑制活性分析

試驗(yàn)結(jié)果表明（表5，6），大蒜BLCs水培液對辣椒疫霉游動(dòng)孢子游動(dòng)和孢子囊釋放的抑制活性隨其在水中培養(yǎng)時(shí)間的增加而增強(qiáng)。培養(yǎng)1h后獲得的水培液對孢子囊釋放的抑制活性為27.83%，處理游動(dòng)孢子40 min 后對其游動(dòng)的抑制活性達(dá)到了70%以上。

表5 大蒜BLCs水培液對辣椒疫霉游動(dòng)孢子游動(dòng)的影響1）Table 5 The effect of garlic border-like cells hydroponic solution on zoospores swimming of Phytophthora capsici

表6 大蒜BLCs水培液對辣椒疫霉孢子囊釋放的影響1）Table 6 The effects of hydroponic solution of garlic border-like cells on the release of zoospores from sporangia

3 討論

3.1 大蒜根冠細(xì)胞脫落物為BLCs

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，高等植物根冠細(xì)胞脫落物類型主要有根緣細(xì)胞（BCs）和類似根緣細(xì)胞（BLCs）兩種。Hawes認(rèn)為根緣細(xì)胞是從高等植物根尖分離出來，遇水形成細(xì)胞懸浮液的一類細(xì)胞［28］。但Vicré等的研究表明，擬南芥產(chǎn)生的根緣細(xì)胞彼此粘連呈細(xì)胞列，遇水后不能分散成單獨(dú)的細(xì)胞；其他的十字花科植物，如油菜（Brassicanapus）、甘藍(lán)（Brassicaoleracea）和白芥（Sinapisalba）的根產(chǎn)生的細(xì)胞也都與擬南芥產(chǎn)生的細(xì)胞相似，因此將這類細(xì)胞命名為類似根緣細(xì)胞（BLCs）［29］。Driouich等總結(jié)了不同植物根冠細(xì)胞脫落物的類型，其中蔥屬作物小蔥（Alliumschoenoprasum）產(chǎn)生BLCs，細(xì)胞形態(tài)為圓形，根冠兩側(cè)細(xì)胞為長形［30］。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，大蒜根冠細(xì)胞脫落物遇水不能完全分散成單個(gè)細(xì)胞，且細(xì)胞形態(tài)主要為橢圓、長橢圓形和長形細(xì)胞。橢圓和長橢圓形細(xì)胞主要從根頂端分散出來，為單個(gè)的細(xì)胞，長形細(xì)胞主要從根冠兩側(cè)分散出來，一般呈細(xì)胞列排列。因此，大蒜根冠細(xì)胞脫落物為類似根緣細(xì)胞。

3.2 BCs和BLCs的產(chǎn)生受多種因素影響

研究表明，植物根尖BCs和BLCs的產(chǎn)生受多種因素的影響，包括植物種類、土壤類型、根系與土壤的物理摩擦、溫度、根長、二氧化碳濃度、金屬鋁和硼等元素、土壤中微生物和自由水等［31］。文獻(xiàn)報(bào)道，植物根系的生長和BCs或BLCs的產(chǎn)生對溫度都比較敏感。Hawes和Pan的試驗(yàn)證明，溫度過高或過低都能顯著影響根系的生長和BCs的產(chǎn)生，在一定溫度范圍內(nèi)，BCs能隨著溫度的升高而數(shù)目增多；根長也是影響B(tài)Cs產(chǎn)生的重要因素，當(dāng)根長達(dá)到一定長度后，BCs數(shù)目達(dá)到最大值，根長再增長，BCs數(shù)目不變。大豆和大麥根尖BCs的數(shù)目在根長25mm 時(shí)達(dá)到最大值［22，26］。而Vicré對BLCs的 研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥隨著幼苗生長5、7 和13d，根尖BLCs形成的細(xì)胞層數(shù)不同，但并沒有具體的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)［29］。本試驗(yàn)研究表明，溫度是影響大蒜根系生長的主要因素之一，高溫和低溫都不適宜大蒜根系的生長，20 ℃為其生長的最適溫度。根長是影響大蒜BLCs產(chǎn)生的最重要的因素，20 ℃、2.0%水瓊脂濃度條件下，BLCs隨根長增長而增多。

3.3 大蒜BLCs水培液對辣椒疫霉菌具有一定的抑菌活性

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，植物BCs具有很強(qiáng)的分泌活性，能分泌蛋白、酶、抗菌物質(zhì)，幫助植物抵抗病原菌侵染，免受鋁毒危害等。Wen的試驗(yàn)結(jié)果表明大豆BCs在水中培養(yǎng)1h后能產(chǎn)生一種蛋白，幫助豌豆根尖抵抗莖基腐病菌（N.haematococca）的侵染［24］。因此，植物BCs很強(qiáng)的分泌物活性能調(diào)節(jié)或抑制土壤中病原微生物對根系的侵染，保護(hù)植物的健康生長。而有關(guān)BLCs細(xì)胞能否分泌活性物質(zhì)還鮮有報(bào)道。Vircé證明擬南芥BLCs細(xì)胞中具有大量高爾基體，因此也具有很強(qiáng)的分泌活性，能分泌大量的果膠、阿拉伯半乳聚糖蛋白到細(xì)胞壁中，阿拉伯半乳聚糖能幫助BLCs與根瘤菌YAS34之間的識別并相互結(jié)合［29］。在本試驗(yàn)中，大蒜BLCs水培液對辣椒疫霉菌游動(dòng)孢子游動(dòng)和孢子囊釋放具有較強(qiáng)的抑制活性，但BLCs水培液中的抑菌活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和特性仍需要進(jìn)一步探索。

綜上所述，大蒜根系在生長過程中能產(chǎn)生類似根緣細(xì)胞，這些細(xì)胞也能分泌抑菌物質(zhì)抑制辣椒疫霉菌的生長，表明類似根緣細(xì)胞也是大蒜釋放抑菌物質(zhì)的途徑之一。該研究結(jié)果對利用大蒜輪作或間作控制土傳病害具有指導(dǎo)意義。

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