曹承樓 孫克偉 胡 莉 陳 斌

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝病科 (安徽 合肥，230031) 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝病科

慢加急性肝衰竭(ACLF)是在慢性肝病基礎(chǔ)上出現(xiàn)的急性肝功能失代償，表現(xiàn)為慢性肝病病理?yè)p害的基礎(chǔ)上，發(fā)生新的程度不等的肝細(xì)胞壞死性病變，是嚴(yán)重威脅慢性肝病患者，尤其是慢性病毒性肝炎患者的疾病。ACLF 屬中醫(yī)黃疸病范疇，茵陳蒿湯作為治療陽(yáng)黃病的經(jīng)典方劑，常作為基礎(chǔ)方藥用于ACLF 的治療中。但其治療的現(xiàn)代藥理作用機(jī)制遠(yuǎn)未闡明。我們擬從DC 的凋亡及Axl 信號(hào)對(duì)凋亡的調(diào)控作用探討其作用機(jī)理，以揭示其治療ACLF 的免疫病理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性Wistar 大鼠70 只，體重150～200g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，質(zhì)量合格證No.43006700000440。動(dòng)物飼育于中南大學(xué)附屬湘雅三醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施許可證號(hào)SYXK(湘)2010-001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用證明號(hào)No.00044537。實(shí)驗(yàn)前1 周領(lǐng)取動(dòng)物，每籠2～3 只分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食與飲水。

1.2 藥物及主要試劑與設(shè)備 茵陳蒿湯液配方比例為茵陳蒿18g、大黃6g、梔子12g，購(gòu)于湖南中醫(yī)醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房(茵陳蒿產(chǎn)地:河北;大黃產(chǎn)地:四川;梔子產(chǎn)地:湖南)，水煎煮濃縮成生藥含量為0.9g/ml 的藥液。牛血清白蛋白、脂多糖(LPS)(Biosharp 公司產(chǎn)品);D-氨基半乳糖(D-Gal)(Sigma 公司產(chǎn)品);肝功能檢測(cè)試劑盒(日立高新技術(shù)公司產(chǎn)品);Tunel細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物公司產(chǎn)品);免疫組化檢測(cè)試劑盒、辣根酶標(biāo)記抗地高辛抗體(北京中杉金橋公司產(chǎn)品);CD123 抗體(Santa Cruz 公司產(chǎn)品);CD11c 抗體(Abcam 公司產(chǎn)品);自動(dòng)生化分析儀(日立LABOSPECT003 公司產(chǎn)品)。

1.3 動(dòng)物分組與處理 70 只大鼠分6 只正常組，其余64 只先制作免疫性肝纖維化模型，具體方法為每次取0.5ml 牛血清白蛋白乳化液(含牛血清白蛋白4mg)皮下多點(diǎn)注射致敏，共4 次(間隔14、10、10d)。然后采用尾靜脈注射牛血清白蛋白攻擊，每周兩次，牛血清白蛋白含量自2mg/次漸加0.5mg/次至4mg/次，維持此劑量，共6 周。到第5 周時(shí)共成模44 只，取30 只分為5 組:肝纖維化組T0、模型組T1、模型組T2、中藥組T1、中藥組T2。在第6 周時(shí)開始給予中藥組T1、T2每天灌胃茵陳蒿湯液0.4ml/100g，模型組T1、T2大鼠灌胃等量生理鹽水。第6 周末，除正常組、肝纖維化組T0外，其余4 組均予以腹腔注射D-Gal+LPS 液(合D-Gal 400mg/kg，LPS 100 μg/kg)急性攻擊建立慢加急性肝衰竭模型。中藥組T1、T2大鼠在急性攻擊后立即灌胃茵陳蒿湯液0.4ml/100g，q4h，模型組T1、2大鼠則灌胃等量生理鹽水。于急性攻擊前(正常組、肝纖維化組T0)及攻擊后1h(模型組T1、中藥組T1)、12h(模型組T2、中藥組T2)每組各取6 只大鼠處死取血，另取肝組織置4%多聚甲醛溶液內(nèi)固定。

1.4 觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 各組大鼠肝功能檢測(cè) 采用自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝功能，包括ALT、AST、TBil、DBil、IBil、TP、Alb、Glo、GGT、ALP。

1.4.2 各組大鼠肝臟病理學(xué)變化 肝臟大體標(biāo)本經(jīng)觀察照相后，取肝組織標(biāo)本石蠟包埋后切片，常規(guī)HE 染色，中性樹膠，蓋玻片封片。

1.4.3 各組大鼠細(xì)胞凋亡指數(shù) TUNEL 凋亡染色按試劑盒說(shuō)明書操作，具體為切片脫臘至水后，促滲，封閉，通透，TdT 酶反應(yīng)液37℃避光反應(yīng)60min，鏈霉素-HRP 液37℃避光反應(yīng)30min，DAB 液顯色。然后進(jìn)行免疫組化染色，一抗液為CD123抗體或CD11c 抗體，加入二抗液孵育后GBI-久紅液顯色，蘇木素復(fù)染，封片。同時(shí)制作陽(yáng)性片與陰性片對(duì)照。每張切片分別取10 個(gè)視野，計(jì)數(shù)CD123 或CD11c 標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)及其中的凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)。

1.4.4 各組大鼠肝內(nèi)樹突狀細(xì)胞Axl-mRNA 表達(dá)水平 大鼠Axl 具有兩種略有差異的全序列NM_031794.1 和 NM_001013147.1，避開兩條序列的差異部分，采用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)探針序列:5'-CAG GGC TGA GAT TCT GAG CTG ACT GAC GAC TTT CCA-3'，地高辛標(biāo)記3'端，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。先進(jìn)行原位雜交染色，具體為切片脫臘至水，促滲，封閉，通透，后固定，預(yù)雜交液40°3h，雜交液40°過(guò)夜，辣根酶標(biāo)記抗地高辛抗體37°60min，Streptavidin-HRP液37℃30min，DAB 液顯色。然后同上進(jìn)行免疫組化染色。同時(shí)制作陽(yáng)性片與陰性片對(duì)照。原位雜交切片分別取10 個(gè)視野拍照，用Adobe photoshop7.0 軟件將照片中的CD123 或CD11c標(biāo)記的細(xì)胞截取出來(lái)，然后采用Image Pro Plus 6.0 軟件檢測(cè)這類細(xì)胞DAB 染色的褐色的光密度(OD)，取平均光密度值(MOD)統(tǒng)計(jì)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 軟件分析完成，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)比較，選LSD 法比較組間差異，兩組計(jì)量資料之間相關(guān)性分析采用線性相關(guān)分析，取P ＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝功能檢測(cè) 結(jié)果見表1、表2、表3。

表1 各組大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT 水平比較(±s)

表1 各組大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT 水平比較(±s)

與正常組比較，* P ＜0.05;與肝纖維化組T0比較，▲P ＜0.05;與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)模型組比較，☆P ＜0.05;與相應(yīng)T1 組比較，#P ＜0.05

表2 各組大鼠血清蛋白水平比較(±s)

表2 各組大鼠血清蛋白水平比較(±s)

各組大鼠血清TP、Alb、Glo 進(jìn)行比較，各組間差異無(wú)顯著性意義(TP:F=0.82，P=0.54;Alb:F=0.74，P=0.60;Glo:F=0.73，P=0.61)。這可能與模型急性攻擊后采血時(shí)間較短，而蛋白合成功能障礙尚未顯示有關(guān)性。

表3 各組大鼠血清膽紅素水平比較(±s)

表3 各組大鼠血清膽紅素水平比較(±s)

與正常組比較，* P ＜0.05;與肝纖維化組比較，▲P ＜0.05;與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)模型組比較，☆P ＜0.05;與相應(yīng)T1組比較，#P ＜0.05

2.2 各組大鼠病理學(xué)檢測(cè)

2.2.1 各組大鼠肝臟大體情況及HE 染色 肝纖維化大鼠肝臟色暗紅，表面有脂肪沉積，肝臟各葉黏連明顯，肝臟邊緣圓鈍，與正常組大鼠肝臟區(qū)別明顯，肝臟取材時(shí)有顆粒感，韌度高于正常組大鼠肝臟。經(jīng)D-Gal +LPS 急性攻擊后，肝臟腫脹增大，切開后可見充血明顯。HE 染色顯示:肝纖維化組大鼠肝臟有脂肪變，假小葉形成;模型組大鼠則可見肝竇內(nèi)淤血，大片壞死，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，其中以12h 時(shí)間點(diǎn)的模型組T2明顯;中藥組炎性反應(yīng)較模型組減輕。(見插頁(yè)圖1)

2.2.2 各組大鼠細(xì)胞凋亡指數(shù) CD11c 和CD123 標(biāo)記的細(xì)胞凋亡檢測(cè)表明，兩種樹突狀細(xì)胞在肝內(nèi)表達(dá)均較少，每視野僅見1～31 個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞，呈分散分布，相對(duì)集中于血管周圍，CD123陽(yáng)性細(xì)胞在肝內(nèi)數(shù)量多于CD11c 陽(yáng)性細(xì)胞。各組間兩種細(xì)胞凋亡指數(shù)的變化近似，并有顯著性意義(CD11c:F=40.40，P ＜0.01;CD123:F=43.85，P ＜0.01)。在肝纖維化組，凋亡指數(shù)已有增高，而在急性攻擊后，細(xì)胞凋亡明顯增加，且隨時(shí)間遷移凋亡細(xì)胞增加到近20%。中藥茵陳蒿湯在急性攻擊后1h、12h均顯示有抑制凋亡的作用。見表4。

表4 各組大鼠肝內(nèi)樹突狀細(xì)胞凋亡指數(shù)比較(±s)

表4 各組大鼠肝內(nèi)樹突狀細(xì)胞凋亡指數(shù)比較(±s)

與正常組比較，* P ＜0.05;與肝纖維化組T0比較，▲P ＜0.05;與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)模型組比較，☆P ＜0.05;與相應(yīng)T1組比較，#P ＜0.05

2.2.3 各組大鼠肝內(nèi)DC Axl-mRNA 表達(dá)水平 CD123+標(biāo)記細(xì)胞光密度的變化幅度高于CD11c+標(biāo)記細(xì)胞，但各組間兩種細(xì)胞的變化趨勢(shì)近似，在正常組細(xì)胞的Axl 表達(dá)水平較高，而隨著肝纖維化、肝衰竭的發(fā)展，Axl 表達(dá)水平下降明顯(CD11c:F=45.53，P ＜0.01;CD123:F=43.43，P ＜0.01)。顯示中藥茵陳蒿湯具有上調(diào)Axl 表達(dá)的作用。見表5。

表5 各組大鼠肝內(nèi)樹突狀細(xì)胞Axl-mRNA 表達(dá)水平比較(±s，光密度)

表5 各組大鼠肝內(nèi)樹突狀細(xì)胞Axl-mRNA 表達(dá)水平比較(±s，光密度)

與正常組比較，* P ＜0.05;與肝纖維化組T0比較，▲P ＜0.05;與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)模型組比較，☆P ＜0.05;與相應(yīng)T1組比較，#P ＜0.05

將各組CD123+細(xì)胞/CD11c+細(xì)胞凋亡指數(shù)與相應(yīng)切片上Axl-mRNA 原位雜交的平均光密度進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)呈線性相關(guān)。CD11c+細(xì)胞各組比較，R=0.98，R2=0.95，F(xiàn)=76.78，P ＜0.01。CD123+細(xì)胞各組比較，R=0.86，R2=0.73，F(xiàn)=10.86，P=0.03。見圖2、圖3。

圖2 CD11c +細(xì)胞凋亡指數(shù)與Axl-mRNA 表達(dá)相關(guān)性

圖3 CD123 +細(xì)胞凋亡指數(shù)與Axl-mRNA 表達(dá)相關(guān)性

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為慢加急性肝衰竭往往以黃疸為主要臨床表現(xiàn)，因此列入黃疸病范疇。茵陳蒿湯作為治療陽(yáng)黃病的經(jīng)典方劑，常作為基礎(chǔ)方用于ACLF 的治療。茵陳蒿湯，首載于《傷寒論》和《金匱要略》中治療陽(yáng)明病瘀熱在里的發(fā)黃和谷疸。方中茵陳芳香醒脾、清熱利濕、疏利肝膽，與黃疸病病位主要在肝膽脾胃契合，歷代醫(yī)家均將其作為退黃第一要藥;梔子清泄三焦，祛除濕熱，利濕從小便而出以退黃，茵陳與梔子相伍則正體現(xiàn)清利濕熱從小便而出的大法;大黃推陳出新，清除瘀熱，通利大便，導(dǎo)熱下行為佐，大黃與梔子相伍還有涼血瀉熱的功用，對(duì)于ACLF病機(jī)中的瘀毒為患有化瘀涼血解毒之效。三藥相配，使?jié)駸嶂皬亩闩判埂袂鍩岢?，則黃疸可退?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其具有保肝、利膽、抑制肝纖維化、抑制肝細(xì)胞凋亡、抗炎、鎮(zhèn)痛、消除氧自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化等作用［1］。茵陳蒿湯治療ACLF 大鼠可明顯改善肝功能中的轉(zhuǎn)氨酶和膽紅素，在急性攻擊后12h 作用顯著，顯示了較好地保護(hù)肝細(xì)胞膜和利膽的作用。

近年來(lái)，作為免疫應(yīng)答啟動(dòng)器的DC 在ACLF 中的作用受到關(guān)注。肝內(nèi)DC 的數(shù)量，在肝衰竭時(shí)明顯高于未發(fā)生肝衰竭時(shí)［2］。因此在發(fā)生ACLF 時(shí)，血循環(huán)中的DC 富集到肝臟，并被激活。DC 被激活后，促使機(jī)體的免疫反應(yīng)及免疫修復(fù)。同時(shí)因?yàn)槊庖叻答仚C(jī)制的作用［3］，DC 等通過(guò)凋亡等形式調(diào)控著免疫強(qiáng)度。在本研究中，DC 的凋亡染色顯示在ACLF 大鼠肝內(nèi)，DC 細(xì)胞凋亡隨著病情的進(jìn)展逐漸增加，顯示作為免疫啟動(dòng)細(xì)胞的DC 在肝內(nèi)的凋亡增加可能是肝內(nèi)炎癥反應(yīng)持續(xù)存在并逐步加重的重要因素。

在DC 凋亡的調(diào)控中，一種新的信號(hào)通道——Gas6/Axl 信號(hào)通道受到關(guān)注。生長(zhǎng)停滯特異性基因6(growth arrest specific gene 6，Gas6)是一類新的生長(zhǎng)因子，它的受體屬于受體酪氨酸激酶家族，包括Sky(Tyro3)、Axl、Mer，也統(tǒng)稱TAMreceptor。Gas6 具有抗細(xì)胞凋亡的作用，主要是通過(guò)Gas6-Axl-PI3K-Akt 起抗凋亡作用［4］。本研究表明在肝臟免疫組化和原位雜交圖像分析中，DC 的凋亡與Axl 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，這表明了Axl 信號(hào)抑制DC 凋亡的作用是DC 凋亡的主要調(diào)控因素。中藥治療具有多靶點(diǎn)、多途徑的作用，其中免疫調(diào)控是其作用的重要方面。目前已有關(guān)于一些草藥成分調(diào)控DC 凋亡從而影響機(jī)體的免疫狀態(tài)的報(bào)道［5］，在本研究中茵陳蒿湯對(duì)DC 凋亡的下調(diào)作用與上調(diào)Axl 表達(dá)呈密切的相關(guān)性，提示該通道可能是茵陳蒿湯調(diào)控DC 凋亡，從而控制肝內(nèi)免疫反應(yīng)程度的主要機(jī)制，但其具體的作用靶點(diǎn)及上下游分子有待進(jìn)一步明確。

［1］孟姝.茵陳蒿湯的藥理作用研究［J］.臨床合理用藥，2011，4(5B):152 -153.

［2］Zhang Z，Zou ZS，F(xiàn)u JL，et al.Severe dendritic cell perturbation is actively involved in the pathogenesis of acute-on-chronic hepatitis B liver failure［J］.J Hepatol，2008，49(3):396 -406.

［3］Mattei F，Bracci L，Tough DF，et al.Type ⅠIFN regulate DC turnover in vivo［J］.Eur J Immunol，2009，39 (7):1807 -1818.

［4］符江琳，劉承云，徐曉，等.Gas6 經(jīng)P13K/Akt 通路對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)H9c2 細(xì)胞凋亡的影響［J］.中國(guó)病理生理雜志，2011，27(8):1508 -1512.

［5］Hu Z，Jiao Q，Ding J，et al.Berberine induces dendritic cell apoptosis and has therapeutic potential for rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Rheum，2011，63 (4):949 -959.