程軼群，許飛躍，周守標(biāo)　(安徽師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，安徽蕪湖 241003)

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歙縣絞股藍(lán)總皂苷大孔樹脂純化研究

程軼群，許飛躍，周守標(biāo)(安徽師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，安徽蕪湖 241003)

摘要[目的]采用大孔樹脂法研究歙縣絞股藍(lán)總皂苷的純化工藝。[方法]以比吸附量和解吸率為指標(biāo)，比較HP-20、D101、AB-8、DM130和HPD100 5種大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附與解吸特性。[結(jié)果]AB-8大孔樹脂最佳，比吸附量為5.01 mg/g，解吸率為91.1%。動態(tài)吸附解吸試驗表明，使用70%乙醇、流速為1 BV/h時對絞股藍(lán)皂苷洗脫效果最佳，此條件下絞股藍(lán)皂苷的回收率為92.33%，純度由24.7%提高至78.6%。[結(jié)論]AB-8樹脂適合歙縣絞股藍(lán)皂苷的分離純化，吸附率、解吸率較高，且具有較好的再生性能。

關(guān)鍵詞歙縣絞股藍(lán)；皂苷；大孔樹脂；純化工藝

Macroporus Resin Purification of Saponins inGynostemmapentaphyllumShexianense

CHENG Yi-qun, XU Fei-yue, ZHOU Shou-biao(College of Environmental Science and Engineering, Anhui Normal University, Wuhu, Anhui 241003)

Abstract[Objective] In order to determine the optimal method of purification saponins inGynostemmapentaphyllumShexianense by macroporus resin. [Method] The performance of static adsorption and desorption for saponins among five macroporus resins (HP-20, D101, AB-8, DM130 and HPD100) were evaluated. [Result] AB-8 resin showed best, its equilibrium adsorption was 5.01 mg/g and the rate of desorption was 91.1%. The dynamic desorption experiments of AB-8 showed that most gypenosides were desorpted in 70% ethanol, while the flow rate was 1 BV/h. Under the optimal condition the returns ratio was 92.33% and the purity of gypenosides was 78.6%. [Conclusion] AB-8 macroporus resin is suitable for purification of saponins inGynostemmapentaphyllumShexianense for its higher adsorption and desorption rate and its excellent regenerability.

Key wordsGynostemmapentaphyllumShexianense; Saponins; Macroporous resin; Purification technique

絞股藍(lán)(Gynostemmapentaphyllum)有“南方人參”的美譽，作為一種名貴中草藥，其主要功能成分為絞股藍(lán)皂苷，具有抗癌、抗疲勞、提高機體免疫力、調(diào)節(jié)心腦血管、改善神經(jīng)系統(tǒng)等作用[1-2]，除傳統(tǒng)藥用外近年來也應(yīng)用于部分功能性食品。目前對于絞股藍(lán)皂苷的提取純化方法研究較多，主要有大孔樹脂法[3]、硅膠柱色譜分離法[4]、膜分離法[5]、高速逆流色譜法[6]等，其中大孔樹脂法具有較強的選擇性和操作簡便的特點，應(yīng)用較多。絞股藍(lán)在我國分布范圍較廣，且不同絞股藍(lán)種群間皂苷成分、功效差異顯著[7-8]。目前對安徽特有的歙縣絞股藍(lán)[9]中皂苷成分的分離純化研究還未見報道。因此該研究考察不同大孔樹脂對歙縣絞股藍(lán)皂苷的吸附解吸特性，優(yōu)化得出歙縣絞股藍(lán)皂苷的純化工藝，為歙縣絞股藍(lán)進一步開發(fā)利用提供理論指導(dǎo)。

1材料及方法

1.1試劑絞股藍(lán)，收自安徽省黃山市歙縣地區(qū)，經(jīng)安徽師范大學(xué)周守標(biāo)教授鑒定為歙縣絞股藍(lán)(GynostemmapentaphyllumShexianense)；HPD100、HP-20、DM130、AB-8、D101大孔樹脂，購自安徽三星樹脂有限公司；人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品，購自中國藥品生物制品鑒定所。香草醛、冰醋酸、乙醇、高氯酸等試劑均為分析純，購自上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器722G可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；HL-2B恒流泵(上海青浦滬西儀器廠)；HH-2型電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；DZF-6051型低溫冷凍干燥機(上海一恒科技有限公司)。

1.3試驗方法

1.3.1絞股藍(lán)皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。參照Xie等[10]方法，精確稱取人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，純甲醇定容于100 ml容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度0.02 mg/ml的絞股藍(lán)皂苷對照品溶液。分別精密吸取皂苷標(biāo)準(zhǔn)液200、400、600、800和1 000 μl于試管中，先后加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液200 μl和70%高氯酸800 μl，并混合均勻，再置于60 ℃恒溫水浴鍋中加熱顯色15 min，后冰水浴冷卻終止反應(yīng)，待樣品到室溫后在550 nm測定吸光值，隨行對照不加人參皂苷Rb1。以絞股藍(lán)皂苷含量(mg)為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)，得到絞股藍(lán)皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線y=2.927 5x-0.011 9(R2=0.999 2)。標(biāo)準(zhǔn)曲線在皂苷含量為0.04 ~ 0.20 mg范圍內(nèi)線性良好，可以作為定量的基準(zhǔn)。

1.3.2絞股藍(lán)提取液的制備。將干燥的歙縣絞股藍(lán)粉碎并過100目篩，精確稱取50 g絞股藍(lán)粉于500 ml燒杯中，加70%乙醇150 ml，在60 ℃下超聲提取30 min，連續(xù)提取3次。合并提取液，抽濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇至無醇味。將濃縮液用蒸餾水定容至200 ml，用“1.3.1”方法測定皂苷濃度，待用。

1.3.3大孔樹脂靜態(tài)等溫吸附及平衡吸附測定。準(zhǔn)確稱取5種預(yù)處理過的大孔樹脂3.0 g(濕重)，分別加入100 ml燒杯中(每個樣品做3次平行)，并精確加入絞股藍(lán)提取液25 ml。置于25 ℃水浴振蕩(120 r/min)，分別在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、24 h后測定上清液中絞股藍(lán)皂苷濃度，考察各種大孔樹脂的靜態(tài)吸附量和飽和吸附量。按公式S0=(C0-Cr)V/m計算每種樹脂不同時間下的比吸附量[11]，并繪制曲線。式中，S0為比吸附量，表示每克大孔吸附樹脂所吸附的皂苷的質(zhì)量；C0為大孔樹脂吸附前皂苷溶液濃度(mg/ml)；Cr為大孔樹脂吸附后上清液皂苷濃度(mg/ml)；V為溶液體積(ml)；m為加入的大孔吸附樹脂質(zhì)量(g)。

1.3.4大孔樹脂靜態(tài)解吸附及平衡解吸附測定。 使用飽和吸附的大孔樹脂，濾去上清液，再加入25 ml的70%乙醇，于25 ℃水浴振蕩(120 r/min)下解吸附。分別在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、24 h后測定上清液中皂苷濃度。靜態(tài)解吸率按公式D=Cc/(C0-Cr)×100%計算[11]，并繪制曲線。式中，D為解吸率，表示一定質(zhì)量的大孔吸附樹脂靜態(tài)洗脫下的皂苷質(zhì)量與其飽和吸附量的比值；Cc為洗脫液中皂苷濃度(mg/ml)；C0、Cr如前式。

1.3.5大孔樹脂動態(tài)吸附解吸試驗。

1.3.5.1絞股藍(lán)皂苷提取液上樣與清洗。將預(yù)處理過的AB-8大孔樹脂濕法裝入層析柱中(Φ2.0 cm×65 cm)。用蠕動泵以1 BV/h的流速上樣200 ml絞股藍(lán)皂苷提取液。為使AB-8樹脂充分吸附提取液中的皂苷，在上樣完成后靜置2 h，后使用2 BV的去離子水，以1 BV/h的流速沖洗層析柱，去除水溶性強的雜質(zhì)。

1.3.5.2不同乙醇濃度對動態(tài)解吸的影響。分別配制一定量30%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液和無水乙醇，使用1 BV/h的流速沖洗5 BV。洗脫液以1 BV為單位分開收集，考察洗脫液濃度及用量對于皂苷洗脫率的影響。

1.3.5.3不同洗脫液流速對動態(tài)解吸的影響。以一定濃度的乙醇溶液，分別在0.5、1.0、2.0和3.0 BV/h的流速下沖洗5 BV的洗脫液。洗脫液同樣以1 BV為單位分開收集，考察不同洗脫液流速對絞股藍(lán)皂苷的洗脫效果。

1.3.6大孔樹脂再生性能。待絞股藍(lán)皂苷洗脫完成后，使用4%鹽酸溶液沖洗層析柱，后用去離子水洗至中性，再使用4%氫氧化鈉溶液沖洗，并用去離子水洗至中性。按優(yōu)化后的工藝條件再次吸附和解吸絞股藍(lán)皂苷，考查再生前后大孔樹脂吸附解吸性能的衰減情況。

2結(jié)果與分析

2.1大孔樹脂靜態(tài)等溫吸附從5種大孔樹脂在25 ℃下對絞股藍(lán)皂苷的等溫吸附曲線(圖1)可以看出，5種樹脂的比吸附量隨吸附的進行均有明顯增長，但吸附速率差異明顯。前1 h的吸附過程中，D101樹脂的比吸附率明顯高于其他4種樹脂，說明D101樹脂前期吸附速率較快，而其他4種大孔樹脂除了HP-20的比吸附量稍低以外，基本相近。但隨著時間的推移，AB-8樹脂表現(xiàn)出較強的吸附能力，吸附時間2 h后比吸附量已超過D101樹脂，并在3 h的靜態(tài)吸附過程中達(dá)4.46 mg/g，遠(yuǎn)高于其他4種大孔樹脂。相比之下，D101樹脂雖然前期吸附速率較快，但后期吸附速率明顯降低，且3 h后比吸附量有限，與另4種樹脂差異并不明顯。DM130和HPD100 2種樹脂吸附率總體差異不大，而HP-20樹脂則表現(xiàn)非常穩(wěn)定，比吸附率增長速度過慢。

2.2大孔樹脂靜態(tài)解吸附由5種大孔樹脂靜態(tài)解吸曲線(圖2)可見，5種樹脂在0.5 h內(nèi)的解吸率差異并不明顯，但從1 h開始，AB-8樹脂的絞股藍(lán)解吸率明顯高于另外4種樹脂，通過3 h的靜態(tài)解吸最終解吸率為83.5%；其他4種樹脂在整個解吸過程中差異不大，在3 h靜態(tài)解吸后，D101樹脂的解吸率僅次于AB-8，為81.1%。在靜態(tài)等溫吸附中表現(xiàn)異常穩(wěn)定的HP-20樹脂，在解吸試驗中的表現(xiàn)也同樣穩(wěn)定，前2 h內(nèi)解吸率最低，但整個曲線穩(wěn)步上升，在2.5 h后達(dá)到其他4種樹脂的平均水平。

2.3大孔樹脂等溫飽和吸附及平衡解吸附選擇5種大孔吸附樹脂吸附24 h后達(dá)到飽和狀態(tài)及飽和解吸附24 h后再靜態(tài)解吸附24 h達(dá)到平衡的樣品上清液進行取樣，測定各樣品中絞股藍(lán)皂苷含量。從表1可以看出，AB-8樹脂的飽和比吸附量最大，為5.01 mg/g，其次為吸附速率較慢的HP-20，而另外3種大孔樹脂差異不大；在平衡解吸率方面，AB-8同樣領(lǐng)先其他幾種樹脂，達(dá)91.1%，HP-20樹脂緊隨其后，解吸率同樣超過90%，之后是D101樹脂?？梢夾B-8、HP-20、D101 3種樹脂對于絞股藍(lán)皂苷的飽和吸附和平衡解吸能力較好，而DM130和HPD100樹脂的飽和吸附量和平衡解吸率均較為平庸。

表1　不同大孔吸附樹脂飽和吸附及平衡解吸附性能比較

綜合考慮5種大孔樹脂的靜態(tài)等溫吸附率、飽和吸附率、靜態(tài)解吸率和平衡解吸率4個試驗的結(jié)果可見，AB-8樹脂不僅吸附速率、解吸速率較大，飽和吸附量和平衡解吸附率也同樣出色。這是由于不同樹脂的比表面積、平均孔徑、極性均不同。只有當(dāng)樹脂具有較大的比表面積的同時，配合適中的平均孔徑及一定的極性才可以獲得更好的吸附與解吸性能[12]。而AB-8樹脂為弱極性樹脂，平均孔徑13~14 nm，比表面積為480~520 m2/g[13]，較為適合皂苷類成分的分離純化，故選擇AB-8樹脂進一步試驗。

2.4乙醇梯度動態(tài)解吸附按“1.3.5.2”方法考察不同洗脫液乙醇濃度對絞股藍(lán)皂苷洗脫率的影響，從圖3可以看出，使用純水沖洗樹脂幾乎對絞股藍(lán)皂苷沒有洗脫作用。從乙醇濃度為30%開始，不同濃度乙醇梯度洗脫條件下均有一定量的絞股藍(lán)皂苷被逐步洗脫下來；且隨著乙醇濃度的逐步提高，越來越多的皂苷被解吸，尤其是70%乙醇，1 BV的洗脫液即可將47.5%的皂苷洗脫下來，2~5 BV的洗脫液中的皂苷含量逐步降低；使用5 BV的70%乙醇洗脫液后，絞股藍(lán)皂苷的總洗脫率達(dá)56.8%。進一步提高乙醇濃度則效果不明顯，說明70%乙醇為最適宜洗脫液濃度。

2.5洗脫液流速對動態(tài)解吸附的影響鑒于70%乙醇對富集在AB-8大孔樹脂上的絞股藍(lán)皂苷具有較好的洗脫效果，故試驗直接考察不同流速下70%乙醇的洗脫性能。從表2可以看出，在不同流速下經(jīng)過5倍柱體積洗脫液解吸后，絞股藍(lán)皂苷的總解吸率較為接近，均高于90%，說明70%乙醇動態(tài)洗脫效果較好；相比之下，流速最低的0.5 BV/h下總皂苷解吸率最高，為92.80%，且隨著流速的增大，總皂苷的解吸率有小幅下降。雖然不同流速下皂苷的總解吸率差異并不明顯，但仔細(xì)分析解吸過程中每個柱體積的洗脫液中皂苷解吸率則可以發(fā)現(xiàn)，低流速下最初1 BV洗脫液的解吸能力較強，有更多的皂苷被洗脫下來，但之后相同體積洗脫液中的皂苷解吸率則小于高流速，說明隨著洗脫液流速的增大，皂苷解吸的拖尾現(xiàn)象較為明顯，尤其是第2、3 BV中的皂苷解吸率較為明顯。這或許是由于隨著流速的增大，雖然吸附有絞股藍(lán)皂苷的樹脂床層與不斷流動的洗脫液間濃度差異更顯著，皂苷的解吸動力更大，但由于單位體積洗脫液在樹脂床層中停留時間較短，造成解吸時間有限，進而影響了解吸率?？梢?，較低的流速能顯著減少洗脫液的使用量，但流速過低造成操作時間過長，因此選擇適宜的洗脫液流速可以很好地平衡解吸率與解吸時間的關(guān)系，這與Fu等[14]的研究結(jié)果一致。

表2　不同流速對解吸率的影響　%

綜合考慮絞股藍(lán)皂苷總解吸率、單位體積洗脫液解吸率及解吸操作所需時間，流速為1 BV/h時最佳，總解吸率較高的同時解吸所需時間較短。收集該條件下的洗脫液，經(jīng)濃縮、冷凍干燥后測定絞股藍(lán)皂苷含量，結(jié)果表明，絞股藍(lán)皂苷純度由提取液中的24.7%提高至78.6%，純化效果顯著。

2.6大孔樹脂再生次數(shù)對動態(tài)吸附解吸的影響由圖5可知，AB-8樹脂經(jīng)過5次再生后，無論是比吸附量還是解吸率均略有下降，但性能損失并不明顯，表明AB-8樹脂有很好的再生性能。

3結(jié)論

該試驗考察5種大孔樹脂對歙縣絞股藍(lán)皂苷的分離純化效果，通過與D101、HP-20、DM130、HPD100 4種大孔樹脂靜態(tài)吸附解吸特性比較可以看出，AB-8樹脂較為適宜歙縣絞股藍(lán)中皂苷的純化，其飽和吸附量為5.01 mg/g，平衡解吸附中解吸率為91.1%，且吸附、解吸速率均較快。動態(tài)層析試驗表明，最佳洗脫條件為70%乙醇、流速為1 BV/h，該條件下解吸率為92.33%，該條件下絞股藍(lán)皂苷純度由提取液中的24.7%提高至78.6%，純化效果顯著。

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收稿日期2015-10-23

作者簡介程軼群(1987-)，男，安徽蕪湖人，講師，碩士，從事天然產(chǎn)物開發(fā)與利用研究。

基金項目安徽師范大學(xué)校級項目培育計劃(2014xmpy14)；安徽師范大學(xué)青年教師科研專項(2013qnzx58)。

中圖分類號S 567

文獻標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2015)33-177-03