方增冰， 戴新宇， 鄒 秀， 郭曉鴿， 徐善良， 王丹麗, 趙云龍

(1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院， 寧波 315211； 2. 華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200062)

蚤狀溞(Daphniapulex) Chk1基因的克隆與表達分析

方增冰1， 戴新宇1， 鄒 秀1， 郭曉鴿1， 徐善良1， 王丹麗1, 趙云龍2

(1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院， 寧波 315211； 2. 華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200062)

用RACE技術(shù)從蚤狀溞(Daphniapulex)中克隆到Chk1基因cDNA全長為1767 bp，開放閱讀框為1497 bp，編碼了498個氨基酸，其結(jié)構(gòu)中存在3個保守的Ser-Gln (SQ)和Thr-Gln (TQ) 序列。同源性比對結(jié)果顯示，蚤狀溞Chk1基因與麗色扇頭蜱、切葉蜂、轉(zhuǎn)基因捕食螨、豌豆長管蚜和黑腹果蠅等的同源性均為51%～55%。進化分析發(fā)現(xiàn)，蚤狀溞Chk1基因與豌豆長管蚜、切葉蜂、黑腹果蠅、麗色扇頭蜱和轉(zhuǎn)基因捕食螨等節(jié)肢動物親緣關(guān)系最近。Real Time PCR實驗結(jié)果表明，Chk1 mRNA在兩性溞的表達量顯著高于孤雌溞(P<0.05)，且在休眠卵中表達量最低。推測Chk1基因可能在蚤狀溞的生殖轉(zhuǎn)化調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

蚤狀溞；Chk1；Real time-PCR；生殖轉(zhuǎn)化

蚤狀溞(Daphniapulex)為枝角亞目(Cladocera)一種常見的小型枝角類，該溞分布廣、易繁殖、適應(yīng)性強，易于觀察，個體發(fā)育迅速，發(fā)育階段明顯，是實驗動物學(xué)研究和教學(xué)的好材料。枝角類具兩種生殖模式：春、夏季節(jié)，當(dāng)外界水溫合適、食物充足時，蚤狀溞行孤雌生殖，雌性產(chǎn)不受精卵，發(fā)育成雌體。當(dāng)氣溫降低，光照變短，生活環(huán)境變得惡劣時，雌溞產(chǎn)生卵鞍，行有性生殖。蚤狀溞兩種生殖方式的交替，通過有性生殖產(chǎn)生的卵鞍來適應(yīng)、抵御不良環(huán)境，對于種的延續(xù)有重大的生物學(xué)意義。

Chk1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶(checkpoint kinase 1)，其在生物進化中具有較強的保守性，調(diào)控S期、G2/M檢測點細胞周期的進程[1]。細胞周期檢測點激酶1(Chk1)最早由Walwrot[2]在裂殖酵母中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DNA受損時，ATM/ATR基因立即激活，并磷酸化Chk1的第317位絲氨酸(S317)和第345位絲氨酸(S345)而使激酶激活，激活后的Chk1又可進一步作用于它的下游蛋白Cdc25A/B/C，從而引起S期或G2期阻滯，為修復(fù)損傷的DNA爭取時間[3-4]。目前對Chk1的研究主要集中在細胞周期調(diào)控方面，檢測DNA是否損傷[5-6]及抗腫瘤方面[7-9]。尚未見Chk1調(diào)控動物生殖轉(zhuǎn)化方面的報道。但近年來，本課題組通過構(gòu)建枝角類孤雌溞和兩性溞cDNA文庫及對EST序列進行基因的特異表達分析，篩選得到了在表達上差異極為顯著的與生殖轉(zhuǎn)化相關(guān)的功能基因，發(fā)現(xiàn)其中Chk1單一序列在表達上有顯著性差異，即在兩性溞中Chk1基因表達量高于孤雌溞，其有可能參與調(diào)控卵母細胞不同的成熟方式，推測有可能參與了枝角類的生殖轉(zhuǎn)化調(diào)控[10]。本研究以蚤狀溞為研究對象，通過PCR進行cDNA末端快速克隆的技術(shù)(rapid-amplification of cDNA ends， 簡稱RACE PCR) 和同源序列法，克隆了蚤狀溞Chk1的cDNA全長，采用實時熒光定量PCR分析Chk1 mRNA在蚤狀溞各生殖狀態(tài)下的表達水平，通過以上方法來探索枝角類生殖轉(zhuǎn)化的規(guī)律和分子機理。

1 材料與方法

1.1 實驗溞來源及馴化

本實驗用蚤狀溞為單克隆培養(yǎng)獲得, 溞體大小(3.1±0.6)mm。 選擇健康活潑的成溞培養(yǎng)在盛有 3g兔子糞+4 g 干稻草+20 g 土壤+1900 mL自來水的“Banta 糞土培養(yǎng)液” 玻璃缸內(nèi), 每天投喂2次小球藻。水溫控制在24～26℃；pH值7～8；約培養(yǎng)2周后, 溞密度即可達到3000 只/L 以上, 高密度種群條件下，缸內(nèi)溞逐漸轉(zhuǎn)為有性生殖, 數(shù)天后出現(xiàn)兩性溞。蚤狀溞不同生殖狀態(tài)下的形態(tài)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

1.2 引物設(shè)計

從GenBank獲得了轉(zhuǎn)基因捕食螨(Metaseiulusoccidentalis) Chk1基因(XM_003745270.1)，歐洲熊蜂(Bombusterrestris) Chk1基因(XM_003401009.1)，切葉蜂(Megachilerotundata)Chk1基因(XM_003705944.1)和豌豆長管蚜(Acyrthosiphonpisum)Chk1基因(XM_001944700.2)。根據(jù)此序列， 運用Vector NTI 11.0軟件，設(shè)計1對簡并引物Chk1-F/R，此對引物擴增Chk1基因cDNA部分片段；由該片段再設(shè)計5′ RACE和3′ RACE的特異性引物Chk1-5′R 和Chk1-3′F，擴增出蚤狀溞DpChk1cDNA全長序列；實時熒光定量PCR引物為DpChk1-F和DpChk1-R。根據(jù)蚤狀溞18S(AF014011.1)cDNA序列設(shè)計18S-F和18S-R內(nèi)參基因序列，用1對特異性引物DpChk1-F和DpChk1-R 和1對內(nèi)參基因引物18S-F和18S-R來檢測在不同生殖狀態(tài)下蚤狀溞Chk1 mRNA的表達(引物見表1)。

表1 試驗中用到的引物名稱及序列

M—A or C； K—G or T； R—A or G。

1.3 總RNA 的提取及cDNA第一鏈的合成

孤雌溞、兩性溞和休眠卵的總RNA采用RNA提取試劑盒(RNA Extraction Kit，Axygen)提取，反轉(zhuǎn)錄cDNA則用試劑盒 (PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time Kit)進行反轉(zhuǎn)錄(37℃反轉(zhuǎn)錄15min，85℃5s滅活反轉(zhuǎn)錄酶)，合成的cDNA產(chǎn)物保存在-20℃或直接用于PCR。

1.4 Chk1基因cDNA片段的克隆

用上述獲得的兩性溞cDNA為模板，通過簡并引物Chk1-F/R進行PCR擴增，反應(yīng)體系為50 μL，擴增條件優(yōu)化：94℃預(yù)變性3 min；94℃下變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，連續(xù)30～35個循環(huán)；72℃延伸10 min后4℃保存。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，送上海桑尼生物公司進行測序。

1.5 RACE擴增Chk1基因的全長序列

在NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中對測序結(jié)果進行BlastX比對，分析實驗所得的Chk1序列與其它物種Chk1的同源性，若有部分同源，則根據(jù)測得序列再設(shè)計正向(Chk1-5′R)、反向(Chk1-3′F)引物用于RACE擴增。進一步采用SMARTTM RACE cDNA試劑盒(Clontech)對5′和3′ 端進行RACE，從而獲得cDNA全長。

1.6 生物信息學(xué)分析

蛋白理化特性用Protparam軟件(http://au.expasy.org/tools/protparam.htm1)進行預(yù)測，核酸和蛋白序列相似性比較用BlastX工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)；氨基酸序列通過NCBI的ORF Finder進行開放閱讀框分析預(yù)測；用ExPASy-PROSITE(8Hhttp://prosite.expasy.org/)預(yù)測氨基酸功能域；信號肽分析用SignalP程序；Smart軟件預(yù)測功能域；多序列比對分析采用Clustal W軟件進行。用MEGA5.1 軟件構(gòu)建進化樹。用自展法進行1000 次重復(fù)檢驗。

1.7 實時熒光定量PCR分析

為獲得最佳模板濃度，將各類模板稀釋成10、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7μM 8個濃度梯度，用引物分別進行擴增。并對引物退火溫度也進行優(yōu)化：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，57℃退火30 s，72℃30 s，40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確定Real-time PCR的擴增曲線和溶解曲線，數(shù)據(jù)采集和處理在ABI StepOnePlusTMInstrument上進行。每種生殖狀態(tài)的樣品設(shè)3個重復(fù)。

用平均值(Mean, M)±標(biāo)準(zhǔn)差(Stdeva, SD)表示以上處理得到的數(shù)據(jù)，測得數(shù)據(jù)經(jīng)過以下處理：使用SPSS 14.0軟件來進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，顯著性檢驗采用單因素方差分析法進行，并用鄧肯檢驗法進行多重比較。本實驗PCR產(chǎn)物特異性根據(jù)Livak[11]的方法進行引物的效率檢測。qRT-PCR結(jié)果采用2-△△Ct法分析處理，內(nèi)標(biāo)18S Ct 值與目的基因(DpChk1)Ct 值的差值定義為ΔCt 。

圖1 蚤狀溞不同生殖形態(tài)圖

依次為孤雌溞(未帶卵)(40×)；孤雌溞(帶夏卵)(100×)；孤雌溞(背面觀)(40×)；兩性溞(帶冬卵)(40×)；休眠卵(100×)。

2 結(jié)果

2.1 蚤狀溞細胞周期檢測點激酶1 DpChk1全長cDNA的克隆

以蚤狀溞兩性溞的cDNA為模板，用簡并引物Chk1-F/R進行PCR擴增，得到約700 bp的片段，經(jīng)BlastX分析與已登錄的歐洲熊蜂Bombusterrestris(XP_003401057.1)、轉(zhuǎn)基因捕食螨Metaseiulusoccidentalis(XP_003745318.1)、長牡蠣Crassostreagigas(EKC39820.1)、囊舌蟲Saccoglossuskowalevskii(XP_002741282.1)和紫海膽Strongylocentrotuspurpuratus(NP_001091925.1)Chk1基因具有較高的同源性。以這段700 bp序列繼續(xù)設(shè)計5′和3′ RACE引物，分別進行5′和3′RACE，通過測序得到序列并比對拼接獲得一條1767 bp的全長序列(GenBank登錄號：KC713933)。為進一步驗證序列的可靠性，重新設(shè)計Chk1-S/V克隆Chk1全長序列，結(jié)果與上述全長序列一致，證明蚤狀溞Chk1cDNA克隆有效。

2.2 蚤狀溞細胞周期檢測點激酶1 DpChk1序列特征分析

蚤狀溞 Chk1全長核苷酸序列和推導(dǎo)出的氨基酸序列如圖2，全長為1767 bp的蚤狀溞Chk1 cDNA序列包含了一個186 bp的5′-UTR區(qū)域和84 bp的3′-UTR(非編碼區(qū))區(qū)域，兩端各含有一個終止密碼子(TAA)和 polyA尾。1497 bp的開放閱讀框(ORF)編碼了498個氨基酸，包含有多個磷酸化位點(phosphorylation site)。蚤狀溞Chk1的理論等電點(pI)為8.40，計算分子質(zhì)量56.16 ku。

圖2 蚤狀溞Chk1的cDNA全長及推斷的氨基酸

陰影部分aga為起始密碼子； taa為終止密碼子。

2.3 蚤狀溞細胞周期檢測點激酶1 DpChk1結(jié)構(gòu)分析

圖3 蚤狀溞細胞周期檢測點激酶1與其它甲殼類同源序列的多序列比對Fig 3 Multiple alignment of D. Pulex Chk1 with the other crustacean Chk1灰色陰影顯示的是GxGxxG域;方框顯示3個SQ/TQ域。

蚤狀溞 DpChk1N端含有3個串聯(lián)的Chk1功能域，分別為PKc結(jié)構(gòu)域(殘基27～273位)、PKc-like superfamily結(jié)構(gòu)域(殘基27～273位)、S-TKc結(jié)構(gòu)域(殘基21～275位)。C端是調(diào)節(jié)域，含有調(diào)控必需的SQ/TQ域，該結(jié)構(gòu)域中含有3個保守的Ser-Gln (SQ)和Thr-Gln (TQ) 序列，其中的Ser或Thr能被ATR或ATM磷酸化，激活Chk1蛋白的N端功能域。3個保守的Ser-Gln (SQ)和Thr-Gln (TQ) 序列在蛋白中的位置分別為：321～322、357～358、369～370(圖3)。

2.4 蚤狀溞細胞周期檢測點激酶1DpChk1氨基酸序列同源性分析

利用ClustalW 對蚤狀溞 DpChk1和其它7種節(jié)肢動物Chk1的多序列比對見圖3。蚤狀溞DpChk1與轉(zhuǎn)基因捕食螨(Metaseiulusoccidentalis)、切葉蜂(Megachilerotundata)、頂切葉蟻(Acromyrmexechinatior)、黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)、歐洲熊蜂(Bombusterrestris)、麗色扇頭蜱(Rhipicephaluspulchellus)、豌豆長管蚜(Acyrthosiphonpisum)的同源性都較高，同源性均為51%～55%。

利用MEGA4.0軟件對19個不同物種的Chk1序列進行了分子系統(tǒng)學(xué)分析，在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹的基礎(chǔ)上研究了蚤狀溞和其它種類Chk1之間的進化關(guān)系(見圖4)。從系統(tǒng)進化樹上可以看到Chk1基因在上述動物中主要被分為3個亞群：蚤狀溞與豌豆長管蚜、黑腹果蠅、頂切葉蟻、切葉蜂、轉(zhuǎn)基因捕食螨、麗色扇頭蜱等節(jié)肢動物分為第1亞群；吉富羅非魚(Oreochromisniloticus)、黃牛(Bostaurus)、人(Homosapiens)、家馬(Equuscaballus)等脊椎動物聚為第2亞群；紫海膽Strongylocentrotuspurpuratus、囊舌蟲 (Saccoglossuskowalevskii)等棘皮半索動物為第3亞群。蚤狀溞與豌豆長管蚜、切葉蜂和黑腹果蠅等首先聚類，之后與轉(zhuǎn)基因捕食螨、麗色扇頭蜱等節(jié)肢動物聚為一支，再與棘皮半索動物聚在一起，最后與脊椎動物聚類。蚤狀溞Chk1與脊椎動物在分子進化上距離相對較遠。

圖4 根據(jù)N-J法繪制的Chk1基因進化樹

2.5 DpChk1 mRNA在蚤狀溞各生殖狀態(tài)下的表達差異

以篩選后最為理想的18S作為本實驗熒光定量的內(nèi)參基因。Chk1基因在孤雌溞、兩性溞、休眠卵中的表達差異如圖5所示。實驗結(jié)果顯示：DpChk1在兩性溞中表達最高，在休眠卵中的表達量最低。Chk1 mRNA在兩性溞的表達量顯著高于孤雌溞(P<0.05)，推測Chk1基因與蚤狀溞的生殖轉(zhuǎn)化可能有相關(guān)性。

圖5 Chk1 mRNA 在不同生殖狀態(tài)下的表達水平

3 討論

已有許多學(xué)者證實了枝角類雌體生殖細胞發(fā)生過程中，都是在夏卵和冬卵出現(xiàn)以后，出現(xiàn)兩次成熟分裂[12-14]。 蔣燮治等[15]研究發(fā)現(xiàn)，孤雌溞卵子的成熟只伴隨一次均等分裂，孤雌溞為二倍體；但是兩性溞的卵子成熟時和正常減數(shù)分裂一樣，染色體均等裂，每個卵子都為單倍體。但是Bacci[16]等認為孤雌溞不止經(jīng)歷一次分裂，且細胞未分裂，故產(chǎn)生的卵子為二倍體。因此，枝角類的生殖細胞的兩次成熟分裂，對其兩種生殖方式有很大影響。卵母細胞成熟的調(diào)控不是一個單因子的作用，它的調(diào)控過程很復(fù)雜，由多個因子共同參與[17]，需要特定的基因在特定的時期準(zhǔn)確地表達。

細胞周期檢測點激酶1(Chk1)的主要功能是調(diào)控細胞周期，當(dāng)DNA受損時，Chk1基因能使細胞周期阻滯在S期，為DNA修復(fù)損傷爭取時間[18]。近些年的研究發(fā)現(xiàn)Chk1基因還可能與枝角類的生殖轉(zhuǎn)化相關(guān)[14,17]。本實驗中蚤狀溞兩種生殖狀態(tài)下Chk1 mRNA的表達水平顯示:其兩性溞的表達量最高，是孤雌溞的1.6倍，在休眠卵中的表達量最低。Chk1基因的表達在兩性生殖和孤雌生殖中有顯著性差異(P<0.05)，推測其有可能是參與調(diào)控卵母細胞不同的成熟方式；另一方面由于受到環(huán)境因素脅迫，溞體DNA的損傷程度增大，導(dǎo)致了與修復(fù)損傷DNA有關(guān)的Chk1基因的表達量上升，從而提高或維持兩性溞的種群密度。同時我們也注意到，兩性溞在兩性生殖時所產(chǎn)生的休眠卵隨卵鞍排到體外發(fā)育至囊胚期即停止發(fā)育，在外界經(jīng)過滯育期，待環(huán)境適宜后才繼續(xù)發(fā)育[14]。Chk1基因在休眠卵中表達量明顯低于兩性溞和孤雌溞，是否這個細胞周期調(diào)節(jié)因子也作用于休眠卵，使其終止分裂，停止發(fā)育。目前我們對Chk1基因在生殖轉(zhuǎn)化中的作用，都是推測性的，還有待于今后通過原位雜交和RNA干擾等技術(shù)進一步研究確定。

本研究克隆得到了蚤狀溞Chk1基因的cDNA全長序列，其中包括一個編碼了498個氨基酸的全長為1497 bp的開放閱讀框(ORF)。與NCBI公布的蚤狀溞全基因組(2011年)中的假設(shè)蛋白序列(GenBank登錄號：EFX87696.1)相比有97%的相似度，后者ORF編碼了489個氨基酸。從ORF包含的氨基酸序列中我們可以看到有多個磷酸化位點和1個N-糖基化位點，其生理功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)就是通過蛋白質(zhì)的磷酸化、糖基化來完成。蚤狀溞DpChk1的ORF有多個位點有可能發(fā)生磷酸化修飾和糖基化修飾，這些存在的位點可能就是DpChk1被轉(zhuǎn)運到某個特定的細胞器后的加工位點，通過此翻譯后加工來實現(xiàn)其生理功能。至于這些可能與生殖細胞分裂相關(guān)的位點以及DpChk1確切的翻譯后加工機制還需要進一步的深入研究。蚤狀溞Chk1基因由1個265殘基的N-末端激酶功能域和1個233殘基的C-末端調(diào)節(jié)域組成。激酶功能域中含有一個“GxGxxG”域，是ATP結(jié)合部位[1]，調(diào)節(jié)域中含有6個Ser-Gln (SQ)和Thr-Gln (TQ) 序列，是蛋白激酶的激活部位(見圖3)。Zhao等[19]的研究指出人Chk1蛋白由一個257殘基的N-末端激酶功能域和1個211殘基的C-末端調(diào)節(jié)域構(gòu)成，調(diào)節(jié)域中有5個SQ/TQ位點，其中Ser-317和Ser-345被磷酸化后，才能激活激酶功能域。Shiromizu等[20]發(fā)現(xiàn)HeLa細胞中Chk1蛋白的激活依賴于其Ser-286和Ser-301的磷酸化。本實驗中，蚤狀溞Chk1蛋白調(diào)節(jié)域中有3個保守的SQ/TQ序列(321～322、357～358、369～370)，但是具體是哪幾個Ser(Thr)被磷酸化也有待進一步的研究。

[1]Liu Q, Guntuku S, Cui X S, et al. Chk1 is an essential kinase that is regulated by Atr and required for the G2/M DNA damage checkpoint[J]. Genes & Development, 2000, 14(12): 1448-1459.

[2]Walworth N, Davey S, Beach D. Fission yeast chkl protein kinase links the rad checkpoint pathway to cdc2[J]. Nature, 1993, 363: 368-371.

[3]Furnari B，Rhind N，Russell P. Cdc25 mitotic inducer targeted by chk1 DNA damage checkpoint kinase[J]. Science，1997，277(5331): 1495-1497.

[4]Xiao Z, Chen Z, Gunasekera A H, et al. Chk1 mediates S and G2 arrests through Cdc25A degradation in response to DNA-damaging agents[J]. Journal of Biological Chemistry, 2003, 278(24): 21767-21773.

[5]Peddibhotla S, Lam M H, Gonzalez-Rimbau M, et al. The DNA-damage effector checkpoint kinase 1 is essential for chromosome segregation and cytokinesis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2009, 106(13): 5159-5164.

[6]Ward I M, Minn K, Chen J. UV-induced ataxia-telangiectasia-mutated and Rad3-related (ATR) activation requires replication stress[J]. Journal of Biological Chemistry, 2004, 279(11): 9677-9680.

[7]Matsumoto K, Nagahara T, Okano J, et al. The growth inhibition of hepatocellular and cholangiocellular carcinoma cells by gemcitabine and the roles of extracellular signal-regulated and checkpoint kinases[J]. Oncology Reports, 2008, 20(4): 863-872.

[8]Tsimaratou K, Kletsas D, Kastrinakis N G, et al. Evaluation of claspin as a proliferation marker in human cancer and normal tissues[J]. The Journal of Pathology, 2007, 211(3): 331-339.

[9]Yuki T, Maniwa Y, Doi T, et al. DNA damage sensor protein hRad9, a novel molecular target for lung cancer treatment[J]. Oncology Reports, 2008, 20(5): 1047-1052.

[10]秦 芬, 李 強, 徐曉倩, 等. 隆線溞孤雌卵胚胎發(fā)育的形態(tài)學(xué)研究[J]. 華東師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版, 2010(2):67-76.

[11]Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CT methods[J]. Methods, 2001, 25: 402-408.

[12]Ojima Y. A cytological study on the development and maturation of the parthenogenetic and sexual eggs ofDaphniapulex(Crustacea-Cladocera)[J]. Kwansei Gakuen Univ Ann Stud, 1958, 6: 123-176.

[13]Zaffagnini F, Sabelli B. Karyologic observations on the maturation of the summer and winter eggs ofDaphniapulexandDaphniamiddendorffiana[J]. Chromosoma, 1972, 36(2): 193-203.

[14]秦 芬. 隆線溞孤雌卵胚胎發(fā)育及其兩性溞EST的初步研究[D]. 上海：華東師范大學(xué), 2009.

[15]蔣燮治，堵南山. 中國動物志. 節(jié)肢動物門. 甲殼綱. 淡水枝角類[M]. 北京：科學(xué)出版社，1979.

[16]Bacci G, Cognetti G, Vaccari A M. Endomeiosis and sex determination inDaphniapulex[J]. Experientia ,1961, 17(11): 505-506.

[17]趙云龍. 枝角類動物生殖生物學(xué)研究進展[J]. 生物學(xué)教學(xué), 2012(1): 2-4.

[18]王海燕, 張 敏, 鄒 萍. 細胞周期檢測點激酶1的研究進展[J]. 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志, 2005, 2(2): 147-149.

[19]Zhao H, Piwnica-Worms H. ATR-mediated checkpoint pathways regulate phosphorylation and activation of human Chk1[J]. Molecular and Cellular Biology, 2001, 21(13): 4129-4139.

[20]Shiromizu T, Goto H, Tomono Y, et al. Regulation of mitotic function of Chk1 through phosphorylation at novel sites by cyclin‐dependent kinase 1 (Cdk1)[J]. Genes to Cells, 2006, 11(5): 477-485.

Clonning and expression analysis of Chk1 gene inDaphniapulex

FANG Zeng-bing1, DAI Xin-yu1, ZOU Xiu1, GUO Xiao-ge1,XU Shan-liang1, WANG Dan-li1, ZHAO Yun-long2

(1. College of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211;2. College of Life Science, East China Normal University, Shanghai 200062, China)

The full-length cDNA of a Chk1 (DpChk1) was cloned from cladoceranDaphniapulexusing rapid amplification of complementary DNA ends (RACE) method. The DpChk1 cDNA is 1767 bp in length; and it has a 1497-bp open reading frame that encodes a 498-amino-acid polypeptide containing three conserved Ser-Gln (SQ), and Thr-Gln (TQ) sequence. In addition, DpChk1 shared homology of 51%-55% with gene inRhipicephaluspulchellus,Megachilerotundata,Metaseiulusoccidentalis,AcyrthosiphonpisumandDrosophilamelanogaster. Phylogenetic analysis revealed that DpChk1 protein has a close genetic relationship withPhylumarthropodasuch asAcyrthosiphonpisum,Megachilerotundata,Drosophilamelanogaster,Rhipicephaluspulchellus,Metaseiulusoccidentalisand so on. qPCR results (real-time quantitative PCR) showed that the DpChk1 expression was significantly higher (P<0.05) in ephippial female than in parthenogenetic female and was the lowest in the resting egg. Therefore, Chk1 was closely related to the reproduction conversion ofDaphniapulex.

Daphniapulex； Chk1； Real time-PCR； reproductive conversion

2014-09-28,

2014-11-07

國家自然科學(xué)基金項目(31172043); 浙江省自然科學(xué)基金項目(LY12C19003); 上海市科技創(chuàng)新行動計劃項目(12391900700); 寧波市創(chuàng)新團隊項目(2011B81003); 寧波大學(xué)胡嵐優(yōu)秀博士基金

方增冰，碩士研究生，研究方向為魚類資源及養(yǎng)殖，E-mail: ice19870906@163.com；

王丹麗, 教授，研究方向為從事水生動物學(xué)研究，E-mail: wangdanli@nbu.edu.cn; 趙云龍, 教授，研究方向為從事甲殼動物學(xué)研究，E-mail: ylzhao@bio.ecnu.edu.cn。

S917.4;Q78

A

2095-1736(2015)02-0012-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.02.012