陳 歡 任 越 賈萬(wàn)龍 宋 玉

河北省廊坊長(zhǎng)征醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(廊坊 065000)

丹參多酚酸對(duì)大鼠腦缺血再灌注后炎性因子的影響

陳 歡 任 越△賈萬(wàn)龍 宋 玉

河北省廊坊長(zhǎng)征醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(廊坊 065000)

目的：研究丹參多酚酸對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷恢復(fù)期炎性因子的影響，探索丹參多酚酸治療腦卒中的相關(guān)作用機(jī)制。方法：選用健康雄性Wistar大鼠45只，將大鼠隨機(jī)分為丹參多酚酸治療組(SAL組)、腦缺血再灌注模型組(IR組)、假手術(shù)組(SH組)，采用改良栓線法制作大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)缺血再灌注模型，SAL組于大鼠神經(jīng)功能評(píng)分(mNss)評(píng)分后尾靜脈注射(21mg/kg)，1d1次，連續(xù)給藥10d，SH組和IR組給予等量生理鹽水注射。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分別檢測(cè)腦組織及血清TNF-α、IL-1β、IL-6 含量并進(jìn)行比較。結(jié)果：與SH比較，IR組及SAL組大鼠血清及腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6 含量明顯升高；經(jīng)鼠尾靜脈注射干預(yù)10d后SAL組大鼠血清炎性因子含量較IR組下降，TNF-α(45.18±8.84 ，58.37±6.92)、IL-1β(723.27±138.41 ，882.54±146.25)、IL-6(51.28±10.43， 78.17±23.42)；經(jīng)鼠尾靜脈注射干預(yù)10d后SAL組大鼠腦組織炎性因子含量較IR組下降，TNF-α(42.26±14.65 ，50.33±17.15)、IL-1β(37.27±11.05，53.76±15.13)、IL-6(46.62±11.43，57.14±16.36)。結(jié)論：丹參多酚酸治療能夠減輕腦缺血再灌注損傷大鼠血清及腦組織炎癥因子反應(yīng)，減緩再灌注腦損傷。

腦卒中是臨床常見(jiàn)急危重癥，是當(dāng)前人類致死和致殘的主要疾病，其中約87%的腦卒中患者為腦梗死。在我國(guó)，腦卒中已超過(guò)心血管疾病成為居民的第一大死因[1]。早期診斷及治療，減少相關(guān)神經(jīng)功能損傷是治療關(guān)鍵。中藥丹參提取物丹參多酚酸是水溶性酚酸類化合物制成的粉針劑，臨床治療上廣泛用于治療輕中度腦梗死患者。已有研究證實(shí)，丹參多酚酸鹽具有改善內(nèi)皮功能、促進(jìn)血管生成、抑制低密度脂蛋白氧化修飾、抗炎、抑制金屬蛋白酶表達(dá)等作用[2]?！捌俨夹?yīng)”是腦梗死炎癥反應(yīng)的基礎(chǔ)，多為腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)等細(xì)胞炎性介質(zhì)失控釋放形成，炎癥因子被證實(shí)在調(diào)節(jié)腦缺血再灌注動(dòng)物模型的神經(jīng)損傷和修復(fù)中起著重要的作用[3]。關(guān)于丹參多酚酸對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷恢復(fù)期炎性因子的影響相關(guān)報(bào)道少見(jiàn)，本研究針對(duì)腦缺血再灌注損傷恢復(fù)期炎性因子水平的變化進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材 料 1.1 動(dòng) 物 Wistar大鼠(清潔級(jí)Ⅱ)，雄性，體重200±25g，45只，購(gòu)于河北省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(冀)2008-1-003。飼養(yǎng)條件：溫度23±2℃、濕度(55±10)%，12/12h 光照與黑暗模式循環(huán)，常規(guī)攝食，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 材料及儀器 注射用丹參多酚酸(SLI，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20110011，0.1g)；LGR10-4.2型離心機(jī)(北京市醫(yī)用離心機(jī)廠)；MCAO栓線(北京沙東生物技術(shù)有限公司 AAAA 級(jí))；Rat TNF-α ELISA Kit、Rat IL-1β ELISA Kit、Rat IL-6 ELISA Kit 試劑盒(美國(guó)RayBiotech, Inc)；antibody to IL-1β(美國(guó)RayBiotech,Inc)；antibody to TNF-α、antibody to IL-6(英國(guó)Abcam公司)。

2 方 法 2.1 分組及模型建立 大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)用45只Wistar大鼠隨機(jī)分為3組：丹參多酚酸治療組(SAL組)、腦缺血再灌注模型組(IR組)、假手術(shù)組(SH組)。腦缺血再灌注模型組(IR組)采用Longa等改良栓線法制作：準(zhǔn)備無(wú)菌手術(shù)器械，手術(shù)間常規(guī)紫外線殺菌，大鼠術(shù)前12h禁食，自由飲水，大鼠稱重后，戊巴比妥鈉50mg/kg經(jīng)腹腔注射麻醉，大鼠仰臥固定于鼠板，胸前區(qū)剃毛，充分暴露頸部，碘伏消毒，取頸部正中縱行切口，依次剪開(kāi)皮膚、筋膜，鈍性分離頸前肌群，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，神經(jīng)剝離器分離迷走神經(jīng)、右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，動(dòng)脈鉗暫時(shí)夾閉右側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，于殘端插入直徑0.26mm的栓線，經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈至大腦中動(dòng)脈(MCA)起始處，進(jìn)線深度約17～18mm。阻斷血流2h后緩慢拔出栓線恢復(fù)血流再通。術(shù)畢逐層縫合各層組織。腹腔一次性注射青霉素10萬(wàn)單位抗感染治療。術(shù)后備足飲水，大鼠單籠飼養(yǎng)至完全清醒。丹參多酚酸治療組(SAL組)術(shù)式同IR組。假手術(shù)組(SH組)大鼠不使用栓線阻斷大腦中動(dòng)脈血流，余手術(shù)過(guò)程同IR組大鼠。大鼠清醒后通過(guò)mNSS 評(píng)分法評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)功能，滿分18分，進(jìn)行運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、反射和平衡木4項(xiàng)測(cè)試。mNSS評(píng)分在7～12分者考慮造模成功，可納入IR及SAL組，評(píng)分<7分、>12分及合并癲癇發(fā)作或術(shù)中出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷不符合實(shí)驗(yàn)要求大鼠予以剔除，SAL組、IR組、SH組大鼠分別剔除4只、3只、1只。

2.2 給藥方法 于術(shù)后3h大鼠完全清醒mNss評(píng)分后，SAL組大鼠通過(guò)尾靜脈注射丹參多酚酸(21mg/kg)，1d1次，連續(xù)給藥10d。IR組及SH組大鼠通過(guò)鼠尾靜脈注射等量生理鹽水，1d1次。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)及方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后使用戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉，開(kāi)胸后左心室采血約4mL，常溫狀態(tài)留置30min，低溫離心機(jī)1000r/min離心20min，取上層血清裝于清潔EP管中，貯存于-80℃低溫冰箱中備檢。ELISA 法檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β、IL-6 含量，嚴(yán)格按RayBiotech, Inc公司試劑盒說(shuō)明書(shū)逐步操作。心室采血后迅速將8號(hào)針頭插入左心室，同時(shí)剪開(kāi)右心耳部觀察流出液體顏色，4℃預(yù)冷生理鹽水灌洗100mL到150mL見(jiàn)右心耳流出液體顏色清亮后，使用4%多聚甲醛250mL進(jìn)行灌注固定。大鼠周身僵硬后即迅速開(kāi)顱以取出腦組織，放置4%多聚甲醛液中固定12h以上，取大鼠腦冠狀位前囟-2.0～+2.0mm梗死中心區(qū)組織，切成厚度2mm組織切片，然后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟及石蠟包埋等步驟，制成大鼠腦組織蠟塊，保存在4℃冰箱中備檢。免疫組化檢測(cè)腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 有關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組均數(shù)間比較，采用One-way ANOVA 檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，使用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理分析。

3 結(jié) 果 3.1 治療后各組大鼠血清炎性因子指標(biāo)比較 見(jiàn)表1，與SH比較，IR組及SAL組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 含量明顯升高，提示制模成功；經(jīng)鼠尾靜脈注射干預(yù)10d后SAL組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 含量較IR組下降(P<0.05)。

表1 治療10d后各組大鼠血清炎性因子指標(biāo)比較

3.2 治療后各組大鼠腦組織炎性因子含量比較 見(jiàn)表2，與SH比較，IR組及SAL組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6 含量明顯升高，提示制模成功；經(jīng)鼠尾靜脈注射干預(yù)10d后SAL組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 含量較IR組下降(P<0.05)。

表2 治療10d后大鼠腦組織炎性因子濃度比較(個(gè)

4 討 論 腦缺血性損傷后大腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞被激活，外周血液系統(tǒng)中白細(xì)胞即開(kāi)始向中樞神經(jīng)系統(tǒng)聚集浸潤(rùn)，并開(kāi)始釋放大量的炎性因子、蛋白水解酶、氧自由基等損傷神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血腦屏障破壞、神經(jīng)細(xì)胞凋亡壞死，引發(fā)炎性的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這些因素共同作用下，促進(jìn)腦缺血性損傷進(jìn)一步加重，使病情進(jìn)展惡化[4]。大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型大鼠是研究腦缺血損傷最經(jīng)典的動(dòng)物模型。缺血腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6主要由神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞分泌，TNF-α、IL-1β、IL-6 等細(xì)胞炎性介質(zhì)是導(dǎo)致炎性因子“瀑布效應(yīng)”的關(guān)鍵。如何減輕炎性因子導(dǎo)致的“瀑布效應(yīng)”是挽救腦缺血性梗死細(xì)胞幷改善臨床癥狀的基礎(chǔ)。

丹參多酚酸鹽是從傳統(tǒng)中藥丹參中提取的，主要成分以丹參乙酸鎂為主的丹參多酚酸鹽混合物，其治療功能主要是活血化瘀，同時(shí)具有改善微循環(huán)、抗炎、抗栓、抗氧化、清除自由基、抑制內(nèi)皮素釋放、改善器官缺血再灌注損傷等作用，藥理機(jī)制為分子及細(xì)胞水平上多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)作用的特點(diǎn)[5]。陳昕琳[6]研究顯示丹參多酚酸B可能通過(guò)調(diào)節(jié)OX40/OX40L信號(hào)通路抑制動(dòng)脈粥樣硬化炎癥免疫反應(yīng)，達(dá)到抑制動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。Meta分析顯示注射用丹參多酚酸鹽對(duì)缺血性腦卒中患者有更好的治愈率，且能提高血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)功能，改善血液流變學(xué)參數(shù)[7]。

本研究顯示，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后測(cè)定腦缺血再灌注損傷大鼠血清及腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平均較假手術(shù)組升高，提示本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制作成功。經(jīng)注射用丹參多酚酸通過(guò)鼠尾靜脈注射治療腦缺血再灌注損傷模型大鼠10d后，與缺血再灌注組大鼠比較，SAL組大鼠血清及腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量明顯下降。既往研究顯示，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)丹參多酚酸鹽治療能明顯改善大鼠腦局部缺血后腦梗死面積，對(duì)缺血再灌注全腦損傷有明顯保護(hù)作用，并可明顯延長(zhǎng)低壓力缺氧小鼠的生存時(shí)間。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)丹參多酚酸治療減輕了炎癥因子反應(yīng)，起到了缺血再灌注腦損傷的保護(hù)作用，為臨床治療腦梗死患者用藥提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

綜上所述，丹參多酚酸治療能夠減輕腦缺血再灌注損傷大鼠血清及腦組織炎癥因子反應(yīng)，起到了缺血再灌注腦損傷的保護(hù)作用。對(duì)于不同時(shí)間點(diǎn)丹參多酚酸治療大鼠腦缺血再灌注損傷的治療效果及炎癥因子水平變化有待于進(jìn)一步研究。

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(收稿2015-07-29；修回2015-08-25)

腦缺血 @丹參多酚酸 大鼠，wistar

R743

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.12.059

△通訊作者：河北省保定市第五醫(yī)院麻醉科(保定 071000)