孫理軍 孫耀光 王曉棣 王 興 孫瑜嬬 張 琪 陜西中醫(yī)藥大學(xué)（咸陽(yáng)712046）

腎藏精舍志、主骨、生髓、通腦，歷代醫(yī)家無(wú)論從理論探討，還是臨床實(shí)踐方面，均認(rèn)為腎虛體質(zhì)的一個(gè)重要表現(xiàn)特征是學(xué)習(xí)記憶能力的減低［1］。大量研究證實(shí)記憶和意志等中樞神經(jīng)功能涉及海馬等與生命體精神心理調(diào)節(jié)密切相關(guān)的腦區(qū)。BDNF通路具有調(diào)節(jié)海馬突觸傳遞和突觸可塑性的作用，通過(guò)誘發(fā)并維持海馬、皮質(zhì)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)（Long－term Potentiation，LTP），參與中樞神經(jīng)功能，是判斷腎虛體質(zhì)的重要指標(biāo)。

1 材料與方法 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡清潔級(jí)SD雌、雄大鼠（體重200～240g），購(gòu)自西安交大醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（生產(chǎn)許可證SCXK（陜）2007－001）。標(biāo)準(zhǔn)飼料喂食，不限飲水，室溫。雌雄土貓各1只，3月齡，兇狠善叫，鮮活大鼠喂食，不限飲水，室溫。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要藥物、試劑及儀器 左歸丸（批號(hào)：100306）、右歸丸（批號(hào)：110309）、水合氯醛、RIPA蛋白裂解液試劑盒、PMSF、BCA蛋白定量試劑盒、SDS－PAGE凝膠試劑盒、脫脂牛奶、TBST、BDNF、TrkB、CaMK2、CREB一抗、二抗、ECL化學(xué)反應(yīng)發(fā)光試劑盒（均購(gòu)自勇毅試劑公司）；特制貓、鼠籠、電子精密天平、低溫高速離心機(jī)（北京時(shí)代北利公司）、恒溫箱、酶標(biāo)儀（562nm）、電泳儀（美國(guó)BioRad公司）、凝膠成像儀（上海復(fù)日科技）等。

1.3 動(dòng)物分組及模型建立［2］適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按雄性與雌性大鼠1∶2比例合籠交配。成功受孕后將孕母鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（n＝10）和腎虛組（n＝10）。腎虛組孕鼠置于特制鼠籠，于早8：00至晚7：00置于貓籠旁進(jìn)行恐嚇，同時(shí)在貓籠內(nèi)放置雄鼠令其捕食使孕鼠在旁處于恐慌狀態(tài)；對(duì)照組孕鼠不作處理，非恐嚇時(shí)間兩組均置于同處并確保其他非處理因素一致。恐嚇至兩組孕鼠產(chǎn)子，將仔鼠飼養(yǎng)4周進(jìn)行分組，空白組（n＝10）從對(duì)照孕鼠所產(chǎn)仔鼠中隨機(jī)選??；腎虛組孕鼠所產(chǎn)仔鼠隨機(jī)選取30只，分為模型組（n＝10）、左歸丸（n＝10）、右歸丸組（n＝10），繼續(xù)對(duì)此三組仔鼠進(jìn)行恐嚇并持續(xù)1個(gè)月。空白組仔鼠零刺激，非恐嚇時(shí)間四組仔鼠均置同處減小非處理因素。

1.4 給藥方法與劑量 按文獻(xiàn)折算［3］，大鼠用藥量約為人6.25倍。左歸丸每10丸含生藥量1g，成人每日服生藥18g，則大鼠每日服生藥為1.875g／kg，蒸餾水配成1.875g／mL混懸液備用。右歸丸每8丸含生藥3g，成人每日服生藥9g，則大鼠每日服生藥為0.9375g／kg，蒸餾水配成0.09375g／mL混懸液備用。對(duì)仔鼠恐嚇同時(shí)開(kāi)始灌胃，藥物組給予上述制備好的混懸液，空白組和模型組給予等量生理鹽水10mL／kg，1d1次，每周用藥5d停2d，連續(xù)2月。

1.5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 各組仔鼠5周齡時(shí)進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)第1天為適應(yīng)訓(xùn)練，每只仔鼠在池中游泳120秒。第2～5天為學(xué)習(xí)階段，隨機(jī)選取一象限將大鼠頭朝池壁緩緩放入水中，記錄大鼠找到水下平臺(tái)時(shí)間，若超過(guò)60s未找到者，則引導(dǎo)至平臺(tái)停留10s，每只大鼠4次／d，中間間隔15～20min。實(shí)驗(yàn)第6天為測(cè)試階段：將大鼠分別從四個(gè)不同象限放入水中，找到平臺(tái)后令其休息10s，若120s內(nèi)找不到平臺(tái)則記時(shí)120s并將其引致平臺(tái)休息10s，從下一象限繼續(xù)試驗(yàn)，以大鼠四次測(cè)試平均值做為測(cè)試成績(jī)，記錄各組大鼠尋找平臺(tái)所花費(fèi)的時(shí)間即潛伏期（s）、總路程（cm）和第一次穿越目標(biāo)區(qū)所用時(shí)間（s）。

1.6 免疫印跡實(shí)驗(yàn) 首先提取海馬組織蛋白，仔鼠用藥2個(gè)月后禁食12h稱(chēng)重，7%水合氯醛0.05mL／kg腹麻，斷頭冰上取海馬稱(chēng)重，按照RIPA蛋白裂解試劑盒制備裂解液并加入13μL／mg裂解液冰上勻漿，12000rpm 4℃離心10min，取上清分裝，－80℃凍存。然后進(jìn)行相關(guān)準(zhǔn)備及檢測(cè)。

1.6.1 蛋白定量檢測(cè)：BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)：冰浴上制備好準(zhǔn)備液和標(biāo)準(zhǔn)品，96孔板上25μL／孔依次加入標(biāo)準(zhǔn)品并做兩個(gè)復(fù)孔，等量去離子水做空白對(duì)照，等量10倍去離子水稀釋蛋白樣品上樣；每孔加200μL配置好的BCA混合工作液，混勻后37℃孵育30min；酶標(biāo)儀562nm讀取吸光值計(jì)算蛋白濃度；loading buffer稀釋樣品使其終濃度5μg／μL。

1.6.2 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳：配置10%分離膠和4%積層膠，待膠凝固后加入Maker和樣品各15uL；按60V電壓分離膠和90v電壓積層膠電泳。

1.6.3 轉(zhuǎn)膜：按順序組裝轉(zhuǎn)膜裝置，冰浴380A轉(zhuǎn)膜約1.5h；取出PVDF膜，1%麗春紅染色后現(xiàn)清晰、連續(xù)粉紅色條帶；去離子水洗去麗春紅，將膜放入ddH2O平皿中，搖床80rpm震蕩清洗5min。

1.6.4 抗體雜交：將膜置入TBST配置的5%脫脂奶粉平皿中搖床震蕩，室溫封閉1h；塑料袋加入1∶150比例TBST稀釋一抗，PVDF膜置入塑料袋封口，4℃冰箱過(guò)夜；取出膜清洗，加入TBST 1∶1000稀釋的二抗封口，搖床室溫封閉1h。

1.6.5 發(fā)光檢測(cè)：ECL發(fā)光試劑盒避光制備發(fā)光工作液，暗室中壓片、顯影液顯影、清洗后定影；凝膠成像儀照相、全自動(dòng)攝影儀拍攝掃描并測(cè)定光密度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 將蛋白灰度值與內(nèi)參β－actin灰度值比 較，得 出 BDNF／β－actin、TrkB／β－actin、CaMK2／β－actin 和CREB／β－actin比值，反應(yīng)各樣品中蛋白的表達(dá)水平。SPSS16.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果 2.1 腎虛質(zhì)大鼠學(xué)習(xí)記憶的變化（Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)） ①潛伏期：模型組長(zhǎng)于空白組、左歸丸、右歸丸組（P＜0.05）；左歸丸、右歸丸組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。②總路程：模型組長(zhǎng)于空白組、左歸丸、右歸丸組（P＜0.05）；左歸丸、右歸丸組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。③第一次穿越時(shí)間：模型組略長(zhǎng)于其他三組，與右歸丸組相比差異有顯著性（P＜0.05）；但與空白組和左歸丸組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 Morris水迷宮參數(shù)比較（±s，n＝10）

表1 Morris水迷宮參數(shù)比較（±s，n＝10）

42.9±3.1 719.2±50.9 16.9±0.9模型組 65.3±10.7 1184.4±116.3 18.1±1.8左歸丸組 44.2±8.6 916.5±160.5 17.3±2.5右歸丸組）空白組48.7±9.1 813.3±140.4 16.2±2.1

2.2 腎虛質(zhì)大鼠海馬BDNF、TrkB、CREB和CaMK的表達(dá)變化 使用免疫印跡法對(duì)各組大鼠的海馬組織的BDNF、TrkB、CREB和CaMK的表達(dá)進(jìn)行分析，如圖1所示，腎虛質(zhì)模型組的海馬BDNF、TrkB、CaMK2及CREB表達(dá)均出現(xiàn)下調(diào)，而左歸丸及右歸丸干預(yù)后2組大鼠的BDNF、TrkB、CaMK2及CREB表達(dá)出現(xiàn)部分升高。對(duì)各組蛋白的表達(dá)進(jìn)行定量分析，如表2所示，與空白組比較，模型組BDNF、TrkB、CaMK2、CREB蛋白表達(dá)均顯著下降（P＜0.05）；左歸丸組的BDNF、TrkB、、CREB略高于模型組但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），CaMK2顯著高于模型組（P＜0.05）。右歸丸組BDNF、TrkB、CREB高于對(duì)照組但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），CaMK2顯著性高于模型組（P＜0.05）。左、右歸丸組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 海馬BDNF、TrkB、CREB和CaMK的含量變化（±s，n＝10）

表2 海馬BDNF、TrkB、CREB和CaMK的含量變化（±s，n＝10）

0.75±0.22 0.62±0.21 1.03±0.05 0.88±0.24組別 BDNF／β－actin TrkB／β－actin CaMK2／β－actin CREB／β 0.92±0.12 0.89±0.30 1.14±0.07 0.97±0.22模型組 0.59±0.22 0.58±0.22 0.53±0.06 0.83±0.26左歸丸組 0.79±0.23 0.72±0.23 1.01±0.05 0.91±0.30右歸丸組－actin空白組

3 討 論 腎虛體質(zhì)是各類(lèi)人群常見(jiàn)的體質(zhì)類(lèi)型之一，是以腎中精氣虧虛，腎臟功能低下為主要特征的一種體質(zhì)狀態(tài)。腎藏精舍志、主骨、生髓、通腦，歷代醫(yī)家無(wú)論從理論探討，還是臨床實(shí)踐方面，均認(rèn)為腎虛體質(zhì)的一個(gè)重要表現(xiàn)特征是學(xué)習(xí)記憶能力的減低。學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程的基礎(chǔ)是神經(jīng)元之間的連接，即突觸在形態(tài)和功能上的改變，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）具有防止神經(jīng)元死亡的功能，是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的一種，主要由大腦皮質(zhì)和海馬的神經(jīng)元產(chǎn)生；酪氨酸激酶B（TrkB）為BDNF的特異性受體，當(dāng)BDNF與TrkB結(jié)合可調(diào)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)信號(hào)［4］。研究阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）模型大鼠的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鈣／鈣調(diào)素依賴(lài)的蛋白激酶II（CaMK II）－α與 AD關(guān)系密切［5］。CaMK II－β蛋白參與突觸構(gòu)建過(guò)程，促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶的恢復(fù)，CaMLII－β降低表達(dá)則造成認(rèn)知功能障礙［6］。cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）作為核內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，其本身也可被BDNF激活，增強(qiáng)CREB功能可明顯增強(qiáng)動(dòng)物的長(zhǎng)期記憶能力［7］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腎虛質(zhì)大鼠海馬BDNF蛋白表達(dá)下降，其相關(guān)信號(hào)分子TrkB、CaMK2、CREB亦出現(xiàn)一定程度的降低，補(bǔ)腎方藥左歸丸、右歸丸在一定程度上可以上調(diào)其下降的異常表達(dá)，證明補(bǔ)腎中藥在腎虛質(zhì)腦功能減退方面可通過(guò)改善神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子低表達(dá)使其恢復(fù)正常從而起到改善腎虛質(zhì)衰退的腦功能。提示腎虛質(zhì)大鼠學(xué)習(xí)記憶與海馬BDNF及其相關(guān)分子的表達(dá)變化，是腎藏志理論的重要神經(jīng)生物學(xué)重要指標(biāo)。對(duì)于預(yù)防亞健康狀態(tài)的產(chǎn)生以及對(duì)老年性腦功能疾病和多種慢性疾病的防治具有重要的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

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