張 瑜 董 蕾

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(西安 710004)

馬連草中藥制劑對潰瘍性結(jié)腸炎的作用機制*

張 瑜 董 蕾△

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(西安 710004)

目的：建立三硝基苯磺酸(TNBS) 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型，觀察馬連草制劑對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的治療作用，并探討其機制。方法：將60只SD大鼠用5%三硝基苯磺酸溶液(100mg/kg)、50%乙醇溶液0.25mL灌腸1次建立潰瘍性結(jié)腸炎模型，造模成功后隨機分為模型組，柳氮磺吡啶組，馬連草制劑高、中、低劑量組，地塞米松組，每組10只，并另取10只未造模大鼠作為正常對照組。除正常組和模型組外，其余各組從第2天開始用相應(yīng)藥物治療，9d后處死動物，觀察結(jié)腸大體形態(tài)和組織學(xué)改變，ELISA法測定大鼠血清TNF-α含量，并檢測腸黏膜髓過氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量。結(jié)果：模型組較正常組體重明顯下降，結(jié)腸大體形態(tài)，組織學(xué)損傷評分升高，血清TNF-α含量，結(jié)腸組織中MPO活性、MDA含量比正常組升高，SOD活性比正常組下降,經(jīng)灌腸后各治療組均可不同程度逆轉(zhuǎn)這些變化，馬連草制劑高劑量組優(yōu)于其他治療組。結(jié)論：馬連草制劑能夠有效治療TNBS誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎，高劑量組治療效果優(yōu)于中、低劑量組，減輕細胞因子損傷，促進氧自由基清除,減輕脂質(zhì)過氧化損傷，調(diào)節(jié)機體免疫是其治療潰瘍性結(jié)腸炎的可能機制。

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種直腸和結(jié)腸慢性非特異性炎癥性疾病。其病因和發(fā)病機制尚不清楚。近年來中醫(yī)藥治療本病積累了豐富的經(jīng)驗，尤其是中藥灌腸治療具有使藥物直達病所、保證藥物作用濃度、保護腸道潰瘍面，不良反應(yīng)少等特點，具有積極的臨床意義[1]。我們自擬了包含馬齒莧、黃連、甘草、三七四種中藥的馬連草制劑，通過本實驗研究了該制劑對三硝基苯磺酸所誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型的治療作用，并探討相關(guān)的作用機制。

1 材料和方法 1.1 動 物 雄性SD大鼠70只，體重200～250g，SPF級，購買并飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)動物實驗中心。

1.2 藥 物 馬連草制劑是由馬齒莧60g，黃連20g，甘草20g，三七粉12g組成的中藥復(fù)方。生藥由西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房提供，將藥物洗凈，浸泡1h，加水文火煎煮兩次，第1次30min(以沸騰開始計算)，第2次40min，合并煎液，濾過，95℃水浴濃縮，使每毫升含生藥1.12g。藥物制成后，高壓滅菌消毒分裝，4℃冰箱保存?zhèn)溆??；前愤拎?SPSA)為上海三維制藥有限公司生產(chǎn)，將片劑去糖衣研細，用時加蒸餾水配成0. 1 g/mL的混懸液。地塞米松為山西晉新雙鶴藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，用時加生理鹽水配制成0.18mg/mL的溶液。5%2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)為美國Sigma公司產(chǎn)品，批號P2297. TNF-αELISA試劑盒為美國BenderMedSystems產(chǎn)品，超氧化物歧化酶(SOD)測試盒,髓過氧化物酶(MPO)測試盒，丙二醛(MDA)測定試劑盒，BCA法蛋白定量試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

2 實驗方法 2.1 建立動物模型 60只大鼠禁食不禁飲24h，用4%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉(300mg/kg)后，將直徑2mm的硅膠管插入大鼠結(jié)腸至距肛門約8cm處，緩慢注入相應(yīng)體重比例的5%三硝基苯磺酸溶液(100mg/kg)、50%乙醇溶液0.25mL[2]，然后再注入一段長約0.3mL的空氣，倒拎大鼠1min，造模后歸籠，自由飲食，每天記錄體重、觀察精神、皮毛、大便、活動、飲食、存活等情況[3]。

2.2 動物分組 造模后60只大鼠隨機分為模型組，柳氮磺吡啶組，馬連草制劑高、中、低劑量組，地塞米松組，每組10只，另10只未造模大鼠作為空白對照組(正常組)。

2.3 給 藥 從造模第2天起，除正常組、模型組外，其余各組開始灌腸治療。SASP組:SASP混懸液灌腸，按0. 4g/kg劑量。馬連草制劑高、中、低劑量組分別按10g、5g、2.5g生藥每公斤體重的劑量灌腸，相當(dāng)于成人用量的6.4、3.2、1.6倍。地塞米松組：地塞米松溶液灌腸，按0.9mg/kg劑量。各組每日給藥一次，連續(xù)給藥9d。

2.4 動物處理及病理切片制作 至造模后第10天，腹主動脈抽血處死各組動物，取肛門至回盲部結(jié)腸，沿腸系膜縱行剖開，冰生理鹽水反復(fù)沖洗，除去血液，濾紙拭干，觀察大體形態(tài)改變，每段結(jié)腸自距肛門1cm、4cm、8cm處取3塊組織標(biāo)本(3mm×10mm)，另于炎癥嚴重或潰瘍處至少取1塊組織，用4%甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片(5μm)，HE染色，觀察組織學(xué)改變。形態(tài)及組織學(xué)改變分別參照王皓等提出的評分標(biāo)準(zhǔn)進行評分。其余結(jié)腸組織快速放液氮中速凍，轉(zhuǎn)入-70℃低溫冰箱保存，用于檢測MPO、SOD、MDA水平。造模后因病變嚴重而自行死亡的大鼠，結(jié)腸組織也均按上述方法處理。

2.5 檢測指標(biāo)與方法 MPO、SOD、MDA水平測定 將凍存的結(jié)腸解凍，稱取遠端結(jié)腸組織約1g，放入試管，再加9倍體積冰冷PBS緩沖液(pH7.4)冰浴勻漿，4℃下2000r/min離心10min，取上清液。采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性；硫代巴比妥酸比色法(TBA)測定MDA含量；采用普通生化方法測定MPO含量。具體操作按試劑盒說明書(南京建成生物工程研究所提供)進行。血清TNF-α含量測定 大鼠腹主動脈無菌抽血，4℃靜置過夜，3000 r/min離心20 min，取上清，分裝，置于-20℃冰箱保存待測，使用ELISA試劑盒，按照說明書，測定大鼠血清TNF-α含量。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理,所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析比較各組數(shù)據(jù)間的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果 3.1 大便性狀、體重改變及存活情況 各組大鼠造模后，14～24h后均出現(xiàn)腹瀉，表現(xiàn)為黃色稀便、水樣便、黏液便，或肛周體毛被稀便沾染，少數(shù)排膿血便，咖啡色稀水便，甚至肛周尾部嚴重脫毛，此外還出現(xiàn)精神萎靡，易激惹，活動量及攝食量減少等癥狀。各治療組治療后大便均在2～5d內(nèi)恢復(fù)正常，其他癥狀也得到不同程度的改善，而模型組腹瀉及其他癥狀可持續(xù)1周以上。正常組大鼠在10d內(nèi)平均體重增加99.50g±16.12g，模型組和各治療組造模后體重均下降，模型組體重下降可持續(xù)7～8d以上甚至整個觀察時間，10d內(nèi)平均體重增加-32.21g±13.10g，顯著低于正常組及各治療組(P<0.01)，各治療組灌腸2-5后即出現(xiàn)體重回升，馬連草制劑高劑量組10d內(nèi)體重平均增加71.40g±15.26g，顯著高于其他治療組(P<0.01)，馬連草制劑中、低劑量組平均體重增加42.40g±14.86g，21.89g±12.35g，柳氮磺吡啶組29.78g±12.86g，地塞米松組30.33g±12.80g，這4組體重增加無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。模型組大鼠造模后死亡3只，死亡率30%；正常組、馬連草制劑高、中劑量組無死亡；柳氮磺吡啶組、地塞米松組、馬連草制劑低劑量組各死亡1只，死亡率均為10%。

3.2 大體形態(tài)、組織學(xué)損傷 模型組死亡大鼠解剖尸體可見結(jié)腸組織發(fā)黑壞死，壞死范圍4～6cm，腸腔明顯擴張，其中一只出現(xiàn)腸穿孔，一只并發(fā)腸梗阻，3只均有腸壁與脾臟粘連難以分開，少量腹水形成。其余7只均有結(jié)腸與周圍組織不同程度的粘連，結(jié)腸標(biāo)本表現(xiàn)為黏膜水腫，紅斑，潰瘍形成，炎癥和潰瘍位于距肛門8cm范圍內(nèi)，潰瘍呈白色線狀或灶性，周圍黏膜增厚,腸壁損傷部位有假膜樣物覆蓋。各治療組治療后結(jié)腸病變?nèi)庋塾^察均有不同程度的改善。光鏡下模型組表現(xiàn)為黏膜上皮細胞脫落、糜爛和潰瘍形成，腸腺萎縮甚至消失，密度減低，杯狀細胞減少，炎癥存在于黏膜和黏膜下層，少數(shù)可達肌層，可見炎癥細胞浸潤，主要為中性粒細胞，還有數(shù)量不等的巨噬細胞和嗜酸性粒細胞，潰瘍周圍可見隱窩變形。治療后結(jié)腸黏膜得到修復(fù)，偶見較小的潰瘍面存在，黏膜及黏膜下層可見淋巴細胞和漿細胞浸潤，結(jié)締組織增生并纖維化，黏膜下小血管增生，見表1，圖1。

表1 結(jié)腸大體形態(tài)，組織學(xué)損傷評分

注：與正常組比較，△P<0.01,▲P<0.05；與模型組比較，□P<0.01

A正常組B模型組C馬連草制劑高劑量組D馬連草制劑中劑量組E馬連草制劑低劑量組F柳氮磺吡啶組G地塞米松組

圖1 大體形態(tài)及病理切片表現(xiàn)(HE×100)

3.3 各組大鼠血清TNF-α含量 模型組大鼠血清TNF-α含量比正常組均顯著升高(P<0.01),而各治療組大鼠血清TNF-α含量均較模型組顯著下降(P<0.01)，馬連草制劑高劑量組TNF-α含量接近甚至低于正常水平(P>0.05),明顯低于其他治療組(P<0.05)，見表2。

表2 大鼠血清TNF-α含量

3.4 各組大鼠結(jié)腸組織中MPO、SOD活性及MDA含量 模型組大鼠結(jié)腸組織中MPO活性比正常組顯著升高(P<0.01)，而各治療組大鼠結(jié)腸組織中MPO活性均較模型組顯著下降(P<0.01)，馬連草制劑高劑量組MPO活性降至接近正常組水平(P>0.05)，低于其他治療組(P<0.05)。模型組大鼠結(jié)腸組織中SOD活性比正常組顯著下降(P<0.01)，而各治療組大鼠結(jié)腸組織中SOD活性均較模型組顯著上升(P<0.01)，馬連草高劑量組和地塞米松組SOD活性升至接近正常組水平(P>0.05)模型組大鼠結(jié)腸組織中MDA含量較正常組顯著升高(P<0.01)，而各治療組大鼠結(jié)腸組織中MDA含量均較模型組顯著下降(P<0.01)，馬連草制劑高劑量組MDA含量接近甚至低于正常組(P>0.05)，見表3。

表3 大鼠結(jié)腸組織中MPO、SOD活性及MDA含量

4 討 論 本實驗研究結(jié)果表明，三硝基苯磺酸所誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎出現(xiàn)腹瀉，體重下降，精神萎靡，攝食量及活動量減少甚至死亡等癥狀，遠端結(jié)腸黏膜充血、水腫，潰瘍形成，病變呈連續(xù)性分布，光鏡下表現(xiàn)為黏膜上皮細胞脫落、糜爛和潰瘍形成，腺體密度降低甚至消失，杯狀細胞減少，炎癥多存在于黏膜和黏膜下層，少數(shù)可達肌層，可見多種炎癥細胞浸潤。結(jié)腸組織中，可作為中性粒細胞特異性標(biāo)記物的MPO活性顯著升高，脂質(zhì)過氧化終末產(chǎn)物MDA的含量顯著增加，SOD活性顯著下降。血清中致炎性細胞因子TNF-α的含量顯著上升。

中藥復(fù)方馬連草制劑治療后，腹瀉、體重下降等癥狀好轉(zhuǎn)，死亡率下降，結(jié)腸黏膜充血、水腫、潰瘍得到明顯的改善和修復(fù)，結(jié)腸組織中升高的MPO活性下降，MDA含量回降，而降低的SOD活性重新升高，血清中炎性細胞因子TNF-α的含量顯著降低，并且高劑量組的效果最為顯著，各項觀察指標(biāo)接近正常組水平，優(yōu)于中、低劑量組和柳氮磺吡啶組、地塞米松組。可見，馬連草制劑對三硝基苯磺酸所誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型有治療作用，并且受劑量的影響，劑量越大，治療作用越好?，F(xiàn)代藥理研究表明，馬齒莧有抗菌抗病毒、增強免疫、抗衰老等作用。馬齒莧含有豐富的維生素E、谷胱甘肽等營養(yǎng)性抗氧化劑，減少或消除自由基和過氧化脂質(zhì)對機體損傷，起到抗衰老的作用[4]。甘草具有清熱解毒、止渴祛痰、補脾和胃、調(diào)和諸藥等功效。據(jù)報道甘草明顯降低結(jié)腸黏膜黏連及其潰瘍分值和脾臟指數(shù)，其免疫調(diào)解機制可能是作用于抑制性巨嗜細胞，放大免疫細胞的生物學(xué)效應(yīng)，進而起到調(diào)節(jié)抗體產(chǎn)生細胞活性的作用[5-7]。黃連性寒、味苦，從黃連中提取的生物堿黃連素具有抗菌、抗?jié)儭⒄{(diào)節(jié)免疫等藥理功能[8]。三七可顯著清除氧化自由基損傷，清除主要致炎癥因子，是其治療潰瘍性結(jié)腸炎的主要作用機制之一。

綜上所述，從現(xiàn)代藥理學(xué)角度看，馬連草制劑中馬齒莧、甘草、黃連、三七均具有增強免疫力，抗衰老，抗菌抗病毒，抗?jié)兊茸饔肹9]。從傳統(tǒng)中藥配伍來看，該制劑配伍合理，結(jié)構(gòu)嚴謹，是治療潰瘍性結(jié)腸炎的有效復(fù)方制劑?？偠灾覀儾孪腭R連草制劑通過提高機體免疫功能，調(diào)控各種炎癥因子的表達，清除氧化自由基損傷等多個方面發(fā)揮治療作用，其進一步的治療機制還需要更加深入的研究。

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(收稿2015-07-29；修回2015-08-25)

*“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃課題(2012BAJ18B03-03)

結(jié)腸炎，潰瘍性/中醫(yī)藥療法 動物，實驗 大鼠

R282

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.12.056

△通訊作者