張 磊 劉 佳 于 靜 楊樹民

河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院(石家莊 050031)

豨薟草指紋圖譜研究和3種活性成分的含量測(cè)定*

張 磊 劉 佳 于 靜 楊樹民

河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院(石家莊 050031)

目的：建立豨薟草藥材HPLC指紋圖譜，并同時(shí)測(cè)定豨薟草中奇壬醇、豨薟苷及豨薟精醇3種主要活性成分的含量。方法：采用Kromasil WQ C8柱(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱，以甲醇-乙腈-0.05mol/L KH2PO4溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長215 nm，記錄不同產(chǎn)地10批豨薟草色譜圖數(shù)據(jù)，并同時(shí)測(cè)定了其中3種主要活性成分的含量。結(jié)果：建立了豨薟草HPLC指紋圖譜，10批不同來源的豨薟草藥材指紋圖譜相似度較高，并利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件”生成了豨薟草藥材的對(duì)照指紋圖譜，得到14個(gè)共有峰，各色譜峰分離度良好，符合指紋圖譜檢測(cè)要求。并成功測(cè)定了不同批次豨薟草中奇壬醇、豨薟苷及豨薟精醇3種主要活性成分的含量，結(jié)果分別為0.12%～1.41%、0.10%～2.19%、0.01%～0.39%。結(jié)論：本方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，為豨薟草藥材的鑒別和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)，并為豨薟草活性成分的含量測(cè)定提供參考方法。

豨薟草收載于《中國藥典》2010版一部，具有祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨、解毒、化濕熱的功效，中醫(yī)臨床主治風(fēng)濕痹痛、筋骨不利、腰膝冷痛、四肢麻痹、半身不遂、風(fēng)疹濕瘡等癥[1]。主要產(chǎn)區(qū)有河北、四川、浙江、湖北等，主要含有二萜類、倍半萜類、黃酮類等化學(xué)成分，研究表明，豨薟草中奇壬醇、豨薟精醇、豨薟苷具有抗風(fēng)濕、抗血栓、抗炎鎮(zhèn)痛及心血管保護(hù)等生物活性[2-3]。目前國內(nèi)大多是對(duì)豨薟草中化學(xué)成分的研究，而對(duì)在同一色譜條件下測(cè)定豨薟草的多種活性成分和指紋圖譜的研究較少。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法，研究并建立中藥豨薟草的指紋圖譜，并對(duì)不同批次的豨薟草藥材進(jìn)行對(duì)比，以期為豨薟草的質(zhì)量控制建立有效的方法，并為豨薟草的臨床用藥提供參考。

1 儀器與試藥 1.1 儀 器 Agilent -1100高效液相色譜儀(包括G1322A在線脫氣機(jī)，G1311A四元梯度泵，G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱、 G1315B DAD可變波長紫外檢測(cè)器，美國Agilent公司)；METTLER AE240型1/10000天平 ( 北京賽多利斯儀器有限公司) 。

1.2 試 劑 甲醇、乙腈；蒸餾水，其他試劑均為分析純。對(duì)照品:奇壬醇對(duì)照品(批號(hào)111726-200601，中國生物制品檢定研究院)提供，豨薟苷對(duì)照品(批號(hào)30-1007，上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心)、豨薟精醇對(duì)照品(批號(hào)03-2006，上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心)。藥材:10批藥材均購自藥材市場(chǎng)，依次為：120401批(河北安國)、120501批(河北安國)、20120701-1批(湖北)、130811批(湖北)、131101CP651批(河北安國)、1401001批(四川)、120901CP651批(河北安國)、130101批(浙江)、20100901批(河北安國)、110701批(湖北)。

2 方法與結(jié)果 2.1 對(duì)照品溶液的制備 取奇壬醇、豨薟苷、豨薟精醇對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋制成濃度分別為0.24、0.84、0.20 mg/mL的對(duì)照品溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備 豨薟草藥材粉碎，過40目篩。取約20.0 g精密稱定，置500mL圓底燒瓶中，加10倍量的70%乙醇溶液，搖勻，稱定質(zhì)量，加熱回流提取40 min，取出，放冷至室溫，用70%乙醇溶液補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 指紋圖譜方法的建立 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn):色譜柱：Kromasil WQ C8(4.6mm×250mm，5μm)，流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.05mol/L KH2PO4溶液，梯度洗脫程序見表1；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長：215 nm。所有組分均在60min內(nèi)檢測(cè)完成，除未達(dá)到基線分離的兩峰合并外，其余各峰之間的分離度均大于1.5。豨薟草藥材色譜圖見圖1，奇壬醇、豨薟苷、豨薟精醇對(duì)照品色譜圖見圖2。

表1 梯度洗脫程序表

專屬性試驗(yàn):分別取空白溶劑(甲醇-乙腈-0.05mol/L KH2PO4=6：28：66)和供試品溶液，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，空白溶劑不干擾供試品溶液的測(cè)定，專屬性良好。精密度試驗(yàn):取同一份豨薟草藥材的供試品溶液，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄色譜圖。利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版軟件計(jì)算相似度，結(jié)果均大于0.9；各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.16%，相對(duì)峰面積的RSD均小于1.5%。結(jié)果表明，儀器的精密度良好。重復(fù)性試驗(yàn):取同一批豨薟草藥材，分別按 “2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣，記錄色譜圖。相似度計(jì)算結(jié)果均大于0.9；各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.36%，相對(duì)峰面積的RSD均小于1.45 %。結(jié)果表明，該方法的重復(fù)性良好。穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一份豨薟草藥材的供試品溶液，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖。相似度計(jì)算結(jié)果均大于0.9；各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.1%，相對(duì)峰面積的RSD均小于2%，結(jié)果表明，供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。豨薟草藥材指紋圖譜的建立:取10批不同產(chǎn)地豨薟草藥材，按 “2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，得豨薟草藥材指紋圖譜，見圖3。采用國家藥典委員會(huì)編寫的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版”軟件生成豨薟草共有模式的對(duì)照指紋圖譜，得到14個(gè)共有峰，通過與對(duì)照品圖譜對(duì)照，指認(rèn)其中的1號(hào)峰為奇壬醇，2號(hào)峰為豨薟苷、8號(hào)峰為豨薟精醇。

相似度評(píng)價(jià)：利用相似度評(píng)價(jià)軟件對(duì)上述10批豨薟草藥材的指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，其相似度依次為0.912、0.908、0.923、0.607、0.928、0.489、0.905、0.653、0.621、0.619。由相似度結(jié)果可知，不同來源的10批豨薟草藥材中有5批的相似度均在0.9以上，6號(hào)藥材相似度在0.5以下，不同產(chǎn)地的豨薟草藥材批間差異較大，河北安國產(chǎn)地藥材相似度普遍高于其他產(chǎn)地。

2.4 豨薟草中奇壬醇、豨薟苷和豨薟精醇的含量測(cè)定 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜條件同“2.3.1”，在此色譜條件下，精密量取供試品溶液10μL，注入HPLC色譜儀，記錄色譜圖至60 min，理論塔板數(shù)按奇壬醇、豨薟苷和豨薟精醇計(jì)算分別為45 000、40 000和60 000，與其他色譜峰的分離度大于1.5，達(dá)到基線分離。線性關(guān)系考察:精密量取“2.1”項(xiàng)下制備的對(duì)照品混合溶液適量，稀釋成含有奇壬醇、豨薟苷、豨薟精醇分別為15～240μg/mL、、52.5～840μg/mL、12.5～200μg/mL的對(duì)照品溶液。吸取上述溶液10μL，注入HPLC色譜儀，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)計(jì)算得回歸方程如下，奇壬醇：Y=6.57X+9.50(R2=0.9999)；豨薟苷：Y=2.1744X+78.975(R2=0.9999)；豨薟精醇：Y=8.331X+32.129(R2=0.9995)，表明在該色譜條件下，各成分線性關(guān)系良好。精密度試驗(yàn)：取1號(hào)豨薟草藥材適量，精密稱定，制備供試品溶液，吸取10μL，注入高效液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算得奇壬醇、豨薟苷和豨薟精醇峰面積的RSD分別為0.6%、1.1%和0.9%，表明該方法精密度良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)：取1號(hào)豨薟草藥材適量，精密稱定，制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24h連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄保留時(shí)間和峰面積，結(jié)果奇壬醇、豨薟苷和豨薟精醇峰面積的RSD分別為1.0%、1.3%和1.1%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。重現(xiàn)性試驗(yàn)：取1號(hào)豨薟草藥材適量，精密稱定6份，制備供試品溶液，分別吸取10μL，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，結(jié)果奇壬醇、豨薟苷和豨薟精醇峰面積的RSD分別為1.7%、1.6%和 2.0%，表明該方法重現(xiàn)性良好。加樣回收率試驗(yàn)：取1號(hào)豨薟草藥材約10.0 g，共6份，精密稱定，分別精密量取奇壬醇、豨薟苷和豨薟精醇對(duì)照品溶液1 mL(約相當(dāng)于豨薟草藥材含奇壬醇、豨薟苷和豨薟精醇的50%)，依次加入上述6份藥材中，制備供試品溶液，依法測(cè)定，結(jié)果奇壬醇、豨薟苷和豨薟精醇的平均回收率分別為 99.18%、101.77%和102.34%，RSD分別為0.9%，1.3%和1.1%，表明該方法準(zhǔn)確度高，可用于3種成分的含量測(cè)定。樣品測(cè)定：取10批不同產(chǎn)地和不同批次的豨薟草藥材，制備供試品溶液，依法測(cè)定，平行測(cè)定3次，計(jì)算供試品中奇壬醇、豨薟苷和豨薟精醇的含量，結(jié)果見表2。

表2 10批豨薟草藥材中奇壬醇、豨薟苷和豨薟精醇的含量測(cè)定結(jié)果(mg/g)

3 討 論 不同來源的豨薟草藥材指紋圖譜相似度存在差異，10批豨薟草藥材中有5批的相似度均在0.9以上，其中河北安國產(chǎn)地的指紋圖譜相似度普遍高于其他產(chǎn)區(qū)樣品，證明了固定藥材產(chǎn)地對(duì)于保證藥材質(zhì)量的重要意義。含量測(cè)定結(jié)果表明，含量測(cè)定結(jié)果顯示豨薟草主要活性成分含量大小順序?yàn)槠嫒纱?豨薟苷>豨薟精醇，其中河北安國產(chǎn)地藥材中豨薟精醇含量均明顯高于其他產(chǎn)地。不同來源10批豨薟草藥材中奇壬醇、豨薟苷和豨薟精醇的含量差異較大，藥材質(zhì)量存在優(yōu)劣。初步推測(cè)這可能與藥材不同產(chǎn)地、不同采收期、不同生長年限等因素有關(guān)，這些影響含量變化的因素還有待進(jìn)一步考察。

另外，由相似度評(píng)價(jià)結(jié)果可知，不同產(chǎn)地的10批豨薟草藥材指紋圖譜中14個(gè)特征指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間一致，但各共有峰相對(duì)峰面積有一定的差異，證明各批次藥材之間的質(zhì)量存在差異。結(jié)合主要活性成分含量測(cè)定的結(jié)果，表明豨薟草藥材指紋圖譜的相似度與其主要活性成分的含量存在一定的相關(guān)性，可為豨薟草藥材的品質(zhì)評(píng)價(jià)、規(guī)范種植產(chǎn)地、發(fā)展道地藥材提供科學(xué)指導(dǎo)。

[1] 滕天立，徐世芳，陳峰陽，等.中藥豨薟草的化學(xué)成分及其藥理作用研究進(jìn)展[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2015,32(2)：250-260

[2] 孔繁瑤，胡慧華，田志浩.炮制前后豨薟草指標(biāo)性成分及指紋圖譜研究[J].中國中藥雜志，2014,39(15)：2907-2911

[3] Wang J P，Zhou Y M, Ye YJ, et al. Topical anti-inflammatory andanalgesic activity of kirenol isolated from Siegesbeckia orientalis [J]J Ethnopharmacol，2011,137(3)：1089-1094。

(收稿2015-07-29；修回2015-08-25)

Determination of fingerprint of Herba Siegesbeckiae and 3 kinds of active ingredients

Zhang Lei Liu Jia Yu Jing et al

The First Hospital of Hebei Medical University(shijiazhuang 050031)

Objective ：To establish Siegesbeckia herb material HPLC fingerprint, and simultaneous determination of Herba Siegesbeckiae kirenol, Siegesbeckia glycosides and Siegesbeckia alcohol 3 kinds of main active ingredient content. Methods：Kromasil WQ C8 column (4.6 mm×250 mm, 5 m) column, methanol - acetonitrile (0.05 mol / L KH2PO4 solution for flow by gradient elution, flow rate of 1.0 mL / min, column temperature of 30 DEG C, into the sample weight of 10 g l, detection wavelength of 215 nm recorded from different regions of 10 batches of Herba Siegesbeckiae chromatogram data, and simultaneous determination of the content of three kinds of active ingredients. Results： Herba Siegesbeckiae HPLC fingerprint were established. Ten batches of different sources of Siegesbeckia herb fingerprint similarity higher, and the traditional Chinese medicine chromatographic fingerprint similarity evaluation software to generate the control fingerprint of Herba Siegesbeckiae herbs, get 14 common peaks, all kinds of spectral peaks were well separated, in line with the fingerprint. And the successful determination of the content of different batches of Herba Siegesbeckiae kirenol, Siegesbeckia glycosides and Siegesbeckia alcohol 3 kinds of main active components, the results were 0.12% to 1.41%, 0.10% ～ 2.19%, 0.01% ～ 0.39%. Conclusion ：This method operation is simple, accurate and reproducible, Siegesbeckia herb identification and quality control to provide a scientific basis, and Herba Siegesbeckiae active ingredient content determination to provide reference method.

HPLC @Determination of active ingredients Herba Siegesbeckiae

*河北省中醫(yī)藥管理局基金資助項(xiàng)目(2013009)

色譜法，高效液相 @活性成分含量測(cè)定 豨薟草

R282

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.12.052