袁佳妮 曹 蔚 周暄宣 楊 倩 孫紀元 謝艷華 王四旺

第四軍醫(yī)大學(xué)(西安 710032)

紫外分光光度法測定靶向修飾脂質(zhì)體中蟾毒靈的含量*

袁佳妮 曹 蔚 周暄宣 楊 倩 孫紀元 謝艷華 王四旺△

第四軍醫(yī)大學(xué)(西安 710032)

目的：建立靶向修飾的蟾毒靈脂質(zhì)體( BLs)制劑中蟾毒靈( Bu)含量測定的方法。方法：采用紫外分光光度法，通過測定波長300nm處的吸光度，計算BLs制劑中Bu的含量。結(jié)果：Bu在15.62-250.0μg/mL的濃度范圍內(nèi)，于300nm處的吸光度線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=0.0114X-0.0346(R2=0.9997),平均回收率為99.82%，RSD為1.13%(n=9)。結(jié)論：本方法操作簡單，且穩(wěn)定性、準確度和精密度均符合要求，可用于BLs制劑中Bu含量的測定，并計算得到BLs制劑中Bu包封率。

傳統(tǒng)中藥材蟾酥(Venenum Bufonis)又名蟾蜍眉脂、蛤蟆酥，是蟾蜍科中華大蟾蜍(Bufo,bufogargarizans Cantor)或黑框蟾蜍(Bufomelanostictus Schneider)的耳后腺和皮膚腺分泌的白色漿液，采集后濾凈曬干制得[1]。蟾酥性辛，溫，味甘平，有毒。入胃、腎經(jīng)，歸心經(jīng)，具有解毒消腫、強心、止痛、開竅醒神的功效?！侗静菥V目》曾記載蟾酥“治一切惡腫”，其治療腫瘤具有悠久的歷史。蟾毒靈(Bufalin, Bu)屬于蟾毒甾烯類化合物，分子式為C24H34O4，是蟾酥抗腫瘤的主要活性單體成分[2]。研究表明，Bu對多種惡性腫瘤具有抑制作用， 具有較為廣闊的臨床應(yīng)用潛能[3-4]。但是，蟾毒靈水溶性差，毒性強且體內(nèi)半衰期短，靜脈注射治療窗狹窄，口服給藥蟾毒靈容易分解失效，極大的限制了其臨床應(yīng)用[5-6]。

納米制劑是近年來新興的靶向遞藥系統(tǒng)，研究表明，腫瘤細胞具有的吞噬能力遠甚于正常細胞，同時，腫瘤病灶部位的血管內(nèi)皮細胞縫隙遠大于正常部位的血管內(nèi)皮細胞，因此與進入正常組織、器官相比，納米粒更易進入并富集于腫瘤病變部位[7-8]。同時載藥納米粒在體內(nèi)能夠緩釋抗腫瘤藥物，延長藥物在腫瘤內(nèi)的存留時間，有效延長藥物作用時間，提高療效[9-10]。我們課題組將蟾毒靈制備成脂質(zhì)體納米制劑，以期改變其水溶性，降低毒性，延長半衰期，增加蟾毒靈抗腫瘤臨床應(yīng)用的可行性。本文在參考相關(guān)研究文獻的基礎(chǔ)上，應(yīng)用紫外分光光度法建立了測定蟾毒靈脂質(zhì)體BLs中Bu含量的方法。

1 材 料 UV2600型紫外分光光度儀(德國Techcompany)；ME235S型電子分析天平(德國賽多利斯公司)；KQ-300E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；超純水系統(tǒng)(美國密理博公司)；bufalin(陜西寶雞辰光生物科技公司，純度%)；大豆卵磷脂(Sigma-Aldrich，St Louis, MO, USA)；膽固醇(Sigma-Aldrich，St Louis, MO, USA)；其他試劑均為分析純，實驗室用水為超純水。

2 方 法 2.1 供試溶液的制備 對照品溶液的制備:精密稱取Bu 10.0mg，置于10mL棕色容量瓶中，加無水乙醇，搖勻，定容至刻度線，超聲震蕩使之充分溶解，配制成1.0mg/mL的Bu標準品儲備液，待用;供試品溶液的制備:精密量取BLs溶液1mL, 置于10mL具塞玻璃試管中，超聲10min后轉(zhuǎn)移至10mL棕色容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度線，搖勻，即得?？瞻字|(zhì)體溶液的制備:同供試品溶液制備方法。

2.2 方法學(xué)建立 2.2.1 檢測波長的確定：將一定濃度的對照品溶液(Bufalin,100μg/mL)、供試品溶液(BLs)，空白脂質(zhì)體溶液(Blank)，無水乙醇為空白對照，應(yīng)用紫外分光光度儀在200～700nm范圍內(nèi)全波段掃描。

2.2.2 標準曲線的建立：分別精密量取對照品溶液0.156,0.312,0.625,1.25,2.50mL于10mL棕色容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度線，得到濃度分別為15.62, 31.25, 62.50, 125.0, 250.0μg/mL的系列對照品溶液，4℃冰箱中避光保存?zhèn)溆?。以無水乙醇作空白，紫外分光光度儀在300nm處分別測定吸光度，以待測物Bu濃度(C)為橫坐標，待測物Bu吸光度(A)為縱坐標，進行線性回歸。

2.2.3 精密度試驗：取Bu對照品溶液(濃度分別為15.62， 62.50， 125.0μg/mL)，紫外分光光度儀在300nm處測定吸光度，日內(nèi)組1d內(nèi)連續(xù)測定5次，日間組同一條件下每隔1d測定一次，連續(xù)測定5d，記錄吸光度值，根據(jù)回歸方程計算其濃度，進而得到日內(nèi)精密度及日間精密度。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗:取Bu對照品溶液(濃度分別為15.62， 62.50， 125.0μg/mL)，分別在低溫(-4℃)、常溫(22℃)、高溫(65℃)下放置12h后測定其吸光度，按回歸方程計算濃度，評價其穩(wěn)定性。

2.2.5 重復(fù)性試驗：精密量取自制BLs溶液5份，按照“2.1”項下同供試品溶液制備方法溶進行操作，測定吸光度，根據(jù)回歸方程計算濃度。

2.2.6 加樣回收率測定：分別準確量取Bu對照品溶液1mL(濃度31.25μg/mL)置于9個10mL棕色容量瓶中，分為3組，每組3份。分別加入Bu對照品溶液(15.62μg/mL)1.0mL、2.0mL、3.0mL，配置成低、中、高三種濃度的溶液。以無水乙醇為空白對照，分別測定其在300nm處吸光度值，計算回收率。

2.2.7 樣品檢測：制備3批BLs制劑(每批制劑

體積為2.5mL)，精密量取BLs溶液1mL，分別置于3個10mL棕色容量瓶中，無水乙醇定容至刻度線。以無水乙醇為空白對照，在300nm波長處測定吸光度值，根據(jù)線性回歸方程測得其濃度C，并由稀釋倍數(shù)n(n=100)計算得到BLs制劑中Bu的含量。由于每批BLs制劑制備處方中Bu加入量為0.60mg，求得BLs制劑中Bu包封率。

3 結(jié) 果 3.1 檢測波長的確定 蟾毒靈(Bufalin)、蟾毒靈脂質(zhì)體制劑(BLs)、空白脂質(zhì)體制劑(Blank)三者的全波長掃描圖可知，Bu的最大吸收波長為300nm，且在300nm波長處，空白脂質(zhì)體溶液沒有吸收，不會干擾蟾毒靈檢測，專屬性較強，見圖1。

(1.Bufalin；2.BLs；3.blank)

圖1 蟾毒靈、蟾毒靈脂質(zhì)體制劑及空白脂質(zhì)體制劑的紫外吸收光譜圖

3.2 標準曲線的建立 由試驗可知，蟾毒靈的濃度及其吸光度之間具有良好的線性關(guān)系，線性擬合得到標準曲線方程為Y=0.0114X-0.0346，R2=0.9997(n=5)，其標準曲線。結(jié)果顯示，蟾毒靈在15.62至250.0μg/mL的濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，符合分析測試要求。

3.3 精密度試驗 由測定結(jié)果可知，見表1，所有樣品的日內(nèi)RSD及日間RSD均小于1.0%，精密度良好，符合質(zhì)量控制要求。

表1 精密度試驗結(jié)果

3.4 穩(wěn)定性試驗 結(jié)果如表2，所有樣品的回收率均在97.27%～113.35%之間，符合質(zhì)量控制要求。

3.5 重復(fù)性試驗 結(jié)果如表3，5份由同一處方制備而成的BLs制劑的RSD值為0.16%，表明重復(fù)性較好，符合分析要求。

表2穩(wěn)定性試驗結(jié)果(n=6)

表3 重復(fù)性試驗結(jié)果(n=5)

3.6 加樣回收率測定 其結(jié)果見表4，所有樣品的回收率均在98.30%～101.76%之間，求得平均回收率為99.82%，RSD值為1.13%(n=9)，試驗結(jié)果符合分析要求，見表4。

表4加樣回收率試驗結(jié)果(n=9)

3.7 樣品檢測 結(jié)果見表5，根據(jù)測得的樣品吸光度求得3批BLs制劑中Bu的包封率分別為67.69%、68.24%、68.93%。

表5 蟾毒靈脂質(zhì)體制劑樣品的含量測定結(jié)果

4 討 論 本試驗研制的BLs，以蛋黃卵磷脂和膽固醇為載體，將蟾毒靈單體藥物包載于脂質(zhì)體制劑中，并對蟾毒靈脂質(zhì)體進行靶向修飾，以達到定位緩釋效果，提高蟾毒靈的生物利用度，延長作用時間，降低藥物毒性，提高藥物安全性，增加其臨床應(yīng)用的價值。本試驗建立了應(yīng)用紫外分光光度法測定蟾毒靈脂質(zhì)體制劑中蟾毒靈含量的方法，方法學(xué)結(jié)果表明，該方法簡便易行，且準確度高、重現(xiàn)性好，可應(yīng)用于蟾毒靈含量的測定。

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(收稿2015-07-29；修回2015-08-30)

Content determination of bufalin in targeted liposomes by ultraviolet spectrophotometry

Yuan JianiCao WeiZhou Xuanxuanet al

Fourth Military Medical University( Xi'an 710032)

Objective: To establish the method determination of bufalin(Bu) from Bufalin liposomes(BLs). Methods: Ultraviolet spectrometric assay was used, l=300nm. Results: It had good linearity with the 15.62-250.0μg/mL concentration range of Bu. The regression is Y=0.0114X-0.0346(R2=0.9997). The recovery from the sample was 99.82%, RSD=1.12%(n=9). Conclusion: This method is simple, stable and accurate, which could be used to quality standards for Bu of BLs.

@Bufalin @Ultraviolet spectrometric content determination

*陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目(2015KTZDSF02-01-02)

@蟾毒靈 @紫外分光光度法

R282

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.12.051

△通訊作者