李 雅 范引科 姜姍姍 楊 潔 趙 崗 謝人明

陜西省腫瘤醫(yī)院 (西安 710061)

抗癌方有效部位群對(duì)荷瘤小鼠的抑瘤作用*

李 雅 范引科△姜姍姍△楊 潔△趙 崗△謝人明△

陜西省腫瘤醫(yī)院 (西安 710061)

目的：觀察抗癌方有效部位群對(duì)小鼠移植性S180肉瘤、H22肝癌瘤體的抑制作用及腫瘤壞死因子(TNF)活性的影響。方法：通過(guò)小鼠移植性S180肉瘤生長(zhǎng)試驗(yàn)、小鼠移植性H22肝癌瘤株生長(zhǎng)試驗(yàn)及采用MTT法測(cè)定腫瘤壞死因子(TNF)活性試驗(yàn)，觀察抗癌方對(duì)S180荷瘤小鼠、H22荷瘤小鼠的瘤體重量、抑瘤率及腫瘤壞死因子(TNF)活性的影響。結(jié)果：抗癌方大劑量組(1.00g/kg)、中劑量組(0.50g/kg)、小劑量組(0.25g/kg)能夠明顯抑制小鼠移植性S180、H22荷瘤小鼠瘤體的生長(zhǎng)，減少瘤體重量、增強(qiáng)抑瘤率(P<0.01，P<0.05)；抗癌方大劑量組(1.00g/kg)、中劑量組(0.50g/kg) 明顯升高TNF活性(P<0.05或0.01)。結(jié)論：抗癌方對(duì)小鼠移植性S180肉瘤、H22肝癌具有顯著的抑瘤作用，增強(qiáng)腫瘤壞死因子(TNF)活性是其可能作用機(jī)制之一。

惡性腫瘤是目前危害人類(lèi)健康最嚴(yán)重的疾病之一，我國(guó)已進(jìn)入老齡化社會(huì)，腫瘤發(fā)病率及死亡率呈高發(fā)趨勢(shì)，從天然植物中尋找低毒、高效的抗癌活性成分藥物仍是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者熱衷的研究課題。

抗癌方有效部位群(簡(jiǎn)稱(chēng)抗癌方)出自我院名老中醫(yī)驗(yàn)方，由蟾皮、莪術(shù)、延胡索等諸藥配伍組合而成，具有解毒散結(jié)，活血祛瘀，行氣止痛之功效。臨床觀察證實(shí)用于肝癌、胃癌等多種腫瘤及癌痛的治療具有較好效果。我們通過(guò)抑瘤實(shí)驗(yàn)等系列全面探討抗癌方抗腫瘤作用與機(jī)理，為闡明其科學(xué)內(nèi)涵，進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供充分的科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料 1.1 受試藥物 抗癌方，由蟾皮、莪術(shù)、延胡索等諸藥經(jīng)提取得到有效部位配伍組合而成,含蟾毒配基類(lèi)化合物，莪術(shù)揮發(fā)油類(lèi)，異喹啉類(lèi)生物堿等多種成分，具有解毒散結(jié)，活血祛瘀，行氣止痛之功效。1g藥粉相當(dāng)3.02 g原生藥。

1.2 陽(yáng)性藥物 注射用環(huán)磷酰胺，批準(zhǔn)文號(hào)(國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)H14023686)，山西普德藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：0.2g。

1.3 瘤 株 小鼠S180肉瘤細(xì)胞株，肝癌H22細(xì)胞株，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 KM小鼠，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重18～22g，許可證號(hào)：SCXK(陜)2010-001。

1.5 試劑及儀器 氯化鈉注射液:西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清： TBD31HB， 100mL，Gibco公司；胰蛋白酶消化液：西安舟鼎國(guó)公司；二甲基亞砜(DMSO)：美國(guó)Solarbio公司；刀豆蛋白A(ConA)：西安舟鼎國(guó)公司；RPMI-1640 ：Gbico公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)：西安舟鼎國(guó)公司； 96孔培養(yǎng)板:美國(guó)Corning公司；電子天平：型號(hào)：BS210S 北京賽多利斯天平廠；普通光學(xué)顯微鏡：olympus 生產(chǎn)；SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺(tái)，型號(hào)：NO.0904192，蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)；恒溫培養(yǎng)箱：Heraeus ；酶標(biāo)儀：BIO-RAD Model 680 serial NO.13628 Made in Japan。

2 實(shí)驗(yàn)方法 2.1抗癌方對(duì)小鼠移植性S180肉瘤生長(zhǎng)的影響 按文獻(xiàn)方法[1-2]，取KM小鼠50只，體重18～22g，每次試驗(yàn)均采用單一性別，在潔凈工作臺(tái)內(nèi)制備瘤細(xì)胞懸液(1×107個(gè)/mL)，每只小鼠無(wú)菌條件下腋下接種瘤細(xì)胞懸液0.2mL，計(jì)瘤細(xì)胞數(shù)約為2×106個(gè)。24h后按體重隨機(jī)分為5組，分別為荷瘤對(duì)照組(常水,10mL/kg)、陽(yáng)性對(duì)照組(環(huán)磷酰胺,20mg/kg)和抗癌方大劑量組(1.00g/kg)、中劑量組(0.50g/kg)、小劑量組(0.25g/kg)。各組灌胃體積均為10mL/kg，1d1次，連續(xù)給藥10d。末次給藥后次日，稱(chēng)體重后處死小鼠，剖取瘤塊，計(jì)算體重和抑瘤率,試驗(yàn)重復(fù)2次, 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理t檢驗(yàn)。

2.2 抗癌方對(duì)小鼠H22肝癌瘤株生長(zhǎng)及腫瘤壞死因子(TNF)活性的影響 2.2.1 按文獻(xiàn)方法[1-2]，KM小鼠50只，雄性，體重 18～22g。在潔凈工作臺(tái)內(nèi)無(wú)菌操作制備小鼠肝癌瘤細(xì)胞懸液(1×107個(gè)/mL)，每只小鼠無(wú)菌條件下右前肢腋部皮下接種肝癌細(xì)胞懸液0.2mL，計(jì)瘤細(xì)胞數(shù)約為2×106個(gè)。24h后按體重隨機(jī)分為五組: 荷瘤對(duì)照組(常水,10mL/kg)、陽(yáng)性對(duì)照組(環(huán)磷酰胺,20mg/kg)和抗癌方大劑量組(1.00g/kg)、中劑量組(0.50g/kg)、小劑量組(0.25g/kg)。各組灌胃體積均為10mL/kg，1d1次，連續(xù)給藥10d。 末次給藥后1.5h,稱(chēng)小鼠體重后處死，無(wú)菌制備脾細(xì)胞懸液[3]；解剖取瘤稱(chēng)重，按公式計(jì)算腫瘤抑瘤率，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理t檢驗(yàn)。

2.2.2 TNF的誘生活性測(cè)定[3]:將制備的小鼠脾細(xì)胞懸液用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔500μL，每孔再加終濃度為5μg/mL的ConA，500μL/孔，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，取上清液備用。

采用MTT法測(cè)定TNF的活性[3]將生長(zhǎng)良好的L929細(xì)胞消化液消化配制成4×105/mL，接種于96孔培養(yǎng)板100μL/孔，將待測(cè)樣品也加入培養(yǎng)板100μL/孔，每只待測(cè)樣品均設(shè)5孔，同時(shí)設(shè)靶細(xì)胞對(duì)照，加入靶細(xì)胞和RPMI-1640各100μL。37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，輕輕吸去上清液100μL，加入MTT(1mg/mL)試液100μL，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h后，吸棄上清液，每孔加DMSO100μL，作用30min，用酶標(biāo)測(cè)定儀測(cè)570nm處的吸收度,統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用t檢驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3.1 抗癌方對(duì)小鼠移植性S180肉瘤生長(zhǎng)的影響 由表1、表2結(jié)果可見(jiàn)：抗癌方大劑量組(1.00g/kg)、中劑量組(0.50g/kg)、小劑量組(0.25g/kg)、 陽(yáng)性對(duì)照組(環(huán)磷酰胺,20mg/kg)能明顯抑制小鼠移植性S180瘤體的生長(zhǎng)(P<0.01,P<0.05)，且呈一定劑量關(guān)系。

表1 抗癌方對(duì)小鼠移植性S180肉瘤生長(zhǎng)的影響(♂)

注：與荷瘤對(duì)照組相比,△P<0.05；▲P<0.01

表2 抗癌方對(duì)小鼠移植性S180肉瘤生長(zhǎng)的影響(♀)

注：與荷瘤對(duì)照組比較,△P<0.05；▲P<0.01

3.2抗癌方對(duì)小鼠H22肝癌瘤體生長(zhǎng)的影響 由表3結(jié)果可見(jiàn)：抗癌方大劑量組(1.00g/kg)、中劑量組(0.50g/kg)、小劑量組(0.25g/kg)、 陽(yáng)性對(duì)照組(環(huán)磷酰胺,20mg/kg)明顯抑制小鼠移植性H22肝癌瘤體的生長(zhǎng)(P<0.01)，抑瘤率分別達(dá)到57.20%、46.51%、36.74%、78.60%，試驗(yàn)呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。

表3 抗癌方對(duì)小鼠移植性肝癌生長(zhǎng)的影響

注：與荷瘤對(duì)照組相比: △P<0.05；▲P<0.01

3.3 抗癌方對(duì)小鼠H22肝癌瘤株TNF(腫瘤壞死因子)活性測(cè)定 由表4結(jié)果可見(jiàn)：抗癌方大劑量組(1.00g/kg)、中劑量組(0.50g/kg)與荷瘤對(duì)照組比較TNF活性明顯升高 (P<0.05或0.01)，環(huán)磷酰胺組與荷瘤對(duì)照組比較，具有降低TNF活性的作用(P<0.01)。

表4 抗癌方對(duì)小鼠H22肝癌瘤株

注：與荷瘤對(duì)照組相比: △P<0.05 ；▲P<0.01

4 討 論 惡性腫瘤是目前危害人類(lèi)健康最嚴(yán)重的疾病之一，腫瘤發(fā)病率及死亡率呈高發(fā)趨勢(shì)。2l世紀(jì)初，我國(guó)每年死于癌癥的人數(shù)已高達(dá)150萬(wàn)[4]。

近年來(lái)的研究表明，蟾皮抗腫瘤作用主要是蟾毒配基類(lèi)，對(duì)白血病細(xì)胞、實(shí)體瘤細(xì)胞都有生長(zhǎng)抑制和誘導(dǎo)分化作用，證實(shí)它可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化和凋亡還能抑制腫瘤血管和血管內(nèi)皮增生[5]。國(guó)內(nèi)學(xué)者已從不同角度和層次證明了莪術(shù)及其抗腫瘤成分莪術(shù)醇、欖香烯、莪術(shù)酮等的抗腫瘤作用[6]；延胡索的主要成分中延胡索乙素鎮(zhèn)痛作用最強(qiáng),科學(xué)實(shí)驗(yàn)表明延胡索具有很好的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和催眠的藥理作用[7]。TNF是迄今發(fā)現(xiàn)的直接殺傷腫瘤作用最強(qiáng)的生物學(xué)活性因子之一，能選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，而不影響正常細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和代謝功能，且能協(xié)同其它生物學(xué)因子功能，擴(kuò)大抗腫瘤譜[3]。

本研究結(jié)果表明抗癌方對(duì)小鼠移植性S180肉瘤、H22肝癌具有顯著的抑瘤作用，能夠增強(qiáng)腫瘤壞死因子(TNF)活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示抗癌方既具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，又具有調(diào)節(jié)抗腫瘤細(xì)胞活性因子TNF增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。說(shuō)明抗癌方可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生TNF,通過(guò)TNF直接殺傷腫瘤細(xì)胞是其抗腫瘤作用機(jī)制之一。

抗癌方中多種中藥來(lái)源的化學(xué)成分不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞具有直接的細(xì)胞毒殺傷作用,而且能夠從不同途徑提高腫瘤患者的免疫功能,這將為我們找到療效確切、毒副作用小的抗腫瘤藥物而奠定基礎(chǔ)[8]。我們將繼續(xù)通過(guò)抗腫瘤免疫實(shí)驗(yàn)等進(jìn)一步全面探討抗癌方抗腫瘤作用與機(jī)理，為臨床應(yīng)用提供充分的科學(xué)依據(jù)。

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(收稿2015-06-05；修回2015-07-19)

*陜西省中醫(yī)藥管理局課題(2012-JC18)

@抗癌方 腫瘤壞死因子 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 小鼠

R73-3

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.11.047

△陜西省中醫(yī)藥研究院(西安 710003)