陳莉雯 李毅民 謝瑞芳 周 昕

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院藥劑科 (上海200032)

△通訊作者

黃連解毒湯HPLC指紋圖譜的建立

陳莉雯 李毅民 謝瑞芳 周 昕△

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院藥劑科 (上海200032)

目的：建立黃連解毒湯水煎液高效液相色譜法(HPLC)指紋圖譜，為黃連解毒湯的質(zhì)控提供依據(jù)。方法：采用HPLC-DAD檢測器，XDB-C18PN990967-902色譜柱(4.6×250mm,5μm)；流動相A為乙腈，流動相B為0.1%磷酸水，流速為1 mL/min，柱溫：25℃，檢測波長：280 nm、240nm，梯度洗脫黃連解毒湯樣品。結(jié)果：建立了含有30個色譜峰的高效液相色譜圖，均得到了良好的基線分離；同時對鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、梔子苷等指標(biāo)成分進行了含量檢測。結(jié)論：該方法簡便快捷、精密度高、重現(xiàn)性好、回收率穩(wěn)定，可用于黃連解毒湯的質(zhì)量控制。

本實驗收集了10個批次不同產(chǎn)地、不同生產(chǎn)時間、不同廠家的黃連、黃芩、黃柏、梔子等藥材，按處方比例交叉組方后通過高效液相色譜法(HPLC)建立了黃連解毒湯水煎液的HPLC指紋圖譜，并對其方法學(xué)進行了考察，同時測定其中三大類(黃酮類、生物堿類、環(huán)烯醚萜類)7種成分(鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、梔子苷)的含量，為該方的全面質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與材料 儀器：美國惠普公司的Agilent 1100高效液相色譜儀、上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠的XW-80A旋渦混合器、上海必能超聲儀器公司的SB2200 超聲儀、上海醫(yī)用分析儀器廠的Sartorius BS110S精密電子天平、TGL-16G 臺式高速離心機、鄭州長城科工貿(mào)有限公司的SHB-III循環(huán)水式多用真空泵、上海躍進醫(yī)療器械廠的XMT-152電熱恒溫干燥箱。

試劑：HPLC甲醇(德國默克公司)、HPLC乙腈(德國默克公司)、磷酸(上海聯(lián)合化工廠)、所用水均為純凈水，通過Milli-Q 水處理系統(tǒng)(Millipore, Bedford, MA, USA)進行處理。

對照品：梔子苷(批號110749-200714)，鹽酸巴馬汀(批號110732-200907)，鹽酸小檗堿(批號110713-200208)，黃芩苷(批號110715-200413)，黃芩素(批號111595-0200905)等均購自中國藥品生物制品檢定所(純度>99%)。鹽酸藥根堿(批號110733-201108)，漢黃芩素(批號111514-200403)等購自中國食品藥品檢定研究所(純度>99%)。

藥材：按處方量交叉組合不同批次的黃連、黃芩、黃柏、梔子藥材，組成10個批次的黃連解毒湯(見表1)。

2 方法與結(jié)果 色譜條件：采用XDB-C18 PN990967-902色譜柱(4.6×250mm,5μm)；通過流動相A為乙腈和流動相B為0.1%磷酸水進行梯度洗脫，具體條件如圖1所示；流速為1 mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：280 nm(梔子苷檢測波長為240 nm)；進樣量：5 μL；檢測時間：90 min。

圖1 黃連解毒湯色譜條件

對照品溶液的制備：精密稱取鹽酸小檗堿4 mg、鹽酸藥根堿0.6 mg、鹽酸巴馬汀0.8 mg、黃芩苷4.7 mg、黃芩素0.65 mg、漢黃芩素0.65 mg、梔子苷7.2 mg，將所稱取的藥品分別置于5 mL量瓶，應(yīng)用甲醇定容，并進行不同濃度的稀釋，0.22 μm微孔濾膜濾過即為對照品溶液。

供試品溶液的制備：對組合成的10個批次黃連解毒湯分別加10倍量水進行處理，冷浸30min，武火加熱至沸后文火保持微沸20min，注意趁熱過濾，再加水8倍量，武火加熱至沸后轉(zhuǎn)為文火微沸20min，并趁熱過濾，將2次濾液進行合并。用10mL的量瓶分裝合煎液，每瓶各2mL，再加甲醇約至10mL，超聲提取20 min，冷卻至室溫，補充溶劑至刻度，搖勻，靜置過夜后，取上清液，進行離心(10,000 轉(zhuǎn)/min)10 min，再經(jīng)過0.22 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

表1 藥材產(chǎn)地及購買廠家來源

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：將對照品溶液精密吸取注入色譜儀，進樣量為5 μL，測定峰面積按2.1項方法，以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品含量為橫坐標(biāo)，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密度及加樣回收率試驗：按高、中、低劑量將同一份黃連解毒湯(JQZJ3)分別加入對照品溶液，按2.3項下的處理得供試品溶液，連續(xù)測定3次分別于1d內(nèi)完成，以5μL為每次進樣量，記錄峰面積，計算回收率、日間及日內(nèi)精密度。分別測定各對照品的最低檢測限(LOD)及最低定量限(LOQ)于信噪比(S/N)為3、10時。

穩(wěn)定性試驗：取同一份黃連解毒湯的供試品溶液，在0,2,4,24,48 h分別進樣5 μL，記錄峰面積，計算RSD，考察色譜條件的穩(wěn)定性。

重現(xiàn)性試驗：選取黃連解毒湯合煎液2 mL，按2.3項下藥液處理方法平行處理3份樣品，按照2.1項下色譜條件，進樣5 μL，考察方法重現(xiàn)性。

供試品測定：按照2.1.項下色譜條件，進樣3 μL，檢測分析，記錄90 min色譜圖，每個供試品溶液進樣3次，建立黃連解毒湯合煎液的HPLC指紋圖譜。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計：參照建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用回歸分析的方法計算樣品指標(biāo)成分的含量。

以參照物對應(yīng)的色譜峰(s)的相對保留時間和峰面積為1，各指紋峰保留時間與同一圖譜中對照峰的保留時間的比值為各指紋峰的相對保留時間RRT)，各指紋峰峰面積與同一圖譜中對照峰的峰面積的比值為各指紋峰的相對峰面積(RPA)，計算各批藥材指紋圖譜的共有峰的RRT和RPA。

采用國家藥典委員會開發(fā)的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004年A版)，疊加供試品的指紋圖譜。對各批次藥材及煎液運用夾角余弦法計算相似度。根據(jù)幾何學(xué)多維空間的向量夾角制定向量余弦法，把兩個指紋當(dāng)作兩個向量，計算夾角余弦相似度，進行相似度分析。

圖譜情況：從供試品圖譜可以看出，在現(xiàn)有色譜條件下，7個指標(biāo)成分在280 nm檢測波長下均得到良好的基線分離(圖2)。而梔子苷在240 nm檢測波長下峰型更清晰可見，因此，這里將黃連解毒湯在240 nm檢測波長下的指紋圖譜單獨列開，以更好的觀察指標(biāo)成分梔子苷(圖3)。

檢測波長為280 nm時一共得到30個共有峰，其中3為梔子苷，15為鹽酸藥根堿，17為黃芩苷，18為鹽酸巴馬汀，19為鹽酸小檗堿，27為黃芩素，28為漢黃芩素(圖2)。

(3:梔子苷,15:鹽酸藥根堿,17:黃芩苷,18:鹽酸巴馬汀,19:鹽酸小檗堿,27:黃芩素,28:漢黃芩素)

圖3 黃連解毒湯傳統(tǒng)煎煮色譜圖 (240 nm)(1:梔子苷)

方法學(xué)結(jié)果表明：各指標(biāo)成分在相應(yīng)的范圍內(nèi)，均有良好的相關(guān)系數(shù)(>0.9994)，線性關(guān)系良好(表2)；除了黃芩素日間RSD=10.32%外，各指標(biāo)成分的日內(nèi)及日間RSD均<2.50%，肯定了本方法的精密度；定量限及最低檢測限均能滿足樣品測定的要求；梔子苷回收率為92.47%～106.86%，鹽酸小檗堿回收率為110.97%～115.14%，鹽酸藥根堿回收率為基本為112.26%～116.26%，鹽酸巴馬汀回收率為111.97%～112.65%，黃芩苷回收率為105.46%～107.69%，黃芩素回收率為87.32%～101.09%，漢黃芩素回收率為98.43%～110.14%，表明回收率良好。供試品主要指標(biāo)的成分保留時間控制在：RSD為0.05%～0.33%，相對峰面積RSD為0.18%～1.72%，由此可知該試驗方法在48h內(nèi)基本穩(wěn)定。主要指標(biāo)成分相對保留時間的RSD均<0.8%，相對峰面積的RSD在1.09%～4.83%之間，表明該方法重現(xiàn)性良好?？傃灾F(xiàn)有色譜法精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、回收率良好，可以進行下一步分析。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

對照品回歸方程相關(guān)系數(shù)(r)線性范圍(μg)梔子苷y=1349.21x-20.740.9999660.11～7.20鹽酸巴馬汀y=1429.77x+2.550.9999330.16～1.12鹽酸藥根堿y=1485.35x+13.330.9996990.12～0.60鹽酸小檗堿y=1215.79x+18.850.9997680.12～3.20黃芩素y=2810.60x-31.250.9997130.07～0.78漢黃芩素y=4144.87x-31.020.9998530.02～0.65黃芩苷y=2445.25x-67.110.9994320.48～4.70

指標(biāo)成分含量結(jié)果：對黃連解毒湯水煎液不同批次的成分進行分析，結(jié)果表明(表3)：不同批次的指標(biāo)成分含量具有一定差異，RSD在8.91%～45.38%之間，有的成分含量甚至可以相差數(shù)倍，如ZW17與ZW18中的黃芩苷、ZW18與ZW20中的黃芩素。

表3 不同批次黃連解毒湯水煎液指標(biāo)成分含量(mg/g)

相似度結(jié)果：在黃連解毒湯水煎液圖譜中，黃芩苷峰在10批合煎液中基本一致，且黃芩苷有合理的洗脫時間和已知的藥理活性，因此將黃芩苷選為參照峰。以此為對照計算相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各色譜峰的相對保留時間的RSD均小于1%，但是相對峰面積的RSD較大，說明藥液各批次的保留時間相對穩(wěn)定，但各批次峰面積含量有一定差異。

3 討 論 黃連解毒湯首載于《肘后備急方》，為清熱解毒經(jīng)典名方，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、抗真菌、抗血小板、抗氧化等藥理作用[1-4]?？梢詥为毣蚵?lián)合其他藥物治療不穩(wěn)定型心絞痛、糖尿病、骨髓瘤、肛周膿腫以及神經(jīng)系統(tǒng)等多種疾病[6-10]。從藥物學(xué)角度來看，黃連解毒湯的理化性質(zhì)差異較大、化學(xué)成分較多、分離難度較大等，因此先前的很多研究報道都局限在整體藥效學(xué)的研究，而缺乏對其全方經(jīng)配伍組合、煎煮后的藥理變化的深入探討[11-14]。故此，本文著重研究該方煎煮后湯劑的化學(xué)特征。

目前，指紋圖譜是一種已經(jīng)應(yīng)用成熟的分析方法，既有量的測定，又有質(zhì)的特征檢測，對研究對象可作出全面、綜合地反映，較好的體現(xiàn)中藥成分的復(fù)雜性和相關(guān)性。在中醫(yī)藥現(xiàn)代化的研究中，將指紋圖譜質(zhì)量評價體系引入到相關(guān)研究的成果較少，本實驗建立了黃連解毒湯的HPLC指紋圖譜，并采用相似度分析對指紋圖譜進行了評價。結(jié)果表明，不同批次的黃連解毒湯指紋圖譜特征、指標(biāo)成分的含量存在一定差異，這說明產(chǎn)地、采收、加工方式、存儲時間和方法以及煎煮過程對湯劑的質(zhì)量均存在可能的影響。然而，如何將指紋圖譜的豐富信息綜合起來來評價中藥質(zhì)量是本文不足之處，有待今后將各種化學(xué)信息、藥效信息綜合起來，從而更系統(tǒng)地評價藥物質(zhì)量。

同時，從本次研究過程來看，高效液相色譜法在應(yīng)用中可以收集到藥品定性、定量的雙重信息，可以將復(fù)雜的方劑化學(xué)成分進行個體化區(qū)分。這種點面結(jié)合的研究方法，是適合于中藥方劑復(fù)合型組成特點的。在未來的探索中，我們應(yīng)注重與方劑生產(chǎn)的實際結(jié)合，在目前中醫(yī)藥需求市場日益擴大的情勢下，力圖為中醫(yī)藥現(xiàn)代化生產(chǎn)提供相應(yīng)的參考依據(jù)，使科學(xué)研究成果高效的轉(zhuǎn)化為實際生產(chǎn)的方法。

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(收稿2014- 08-15；修回2014-11-25)

黃連解毒湯 @高效液相色譜法

O657.7

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.02.054