艾慶燕 趙豫鳳 王愛紅 楊加周 王艷梅

延安大學醫(yī)學院(延安 716000)

卷丹百合體外對肺腺癌A549細胞抑制作用的實驗研究*

艾慶燕 趙豫鳳△王愛紅 楊加周 王艷梅

延安大學醫(yī)學院(延安 716000)

目的：研究百合對肺腺癌細胞株A549增殖作用的影響及其相關機制。方法：體外培養(yǎng)肺腺癌細胞株A549，用不同濃度的百合水提物分別作用于對數(shù)期生長的A549細胞24、48和72 h，MTT(甲基噻唑基四唑)比色法檢測百合對A549細胞增殖的抑制率，碘化丙啶(PI)染色，熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)改變及凋亡情況。結果：MTT法檢測結果顯示，百合水提物在1～8mg/mL濃度范圍內(nèi)、24～72h 時間范圍內(nèi)對A549的生長有明顯抑制作用，且呈濃度和時間依賴關系(P<0.05)；PI染色熒光顯微鏡觀察顯示百合作用48h后，細胞出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學改變。結論：百合具有體外抑制肺腺癌細胞株A549增殖的作用，其可能是通過誘導腫瘤細胞凋亡而發(fā)揮抑制A549細胞增殖的作用。

肺癌是世界上發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一[1]，其中75%～80%是非小細胞肺癌，其雖對放、化療敏感，但化療藥物毒副作用較大，且易產(chǎn)生耐藥和出現(xiàn)復發(fā)、轉移。從植物來源的化合物在治療癌癥中具有多方位、多靶點、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢，符合腫瘤多因素、多環(huán)節(jié)致病的機理，對植物性藥物抗腫瘤有效部位、有效成分及作用機理的研究目前已成為國內(nèi)外研究熱點。百合(Lilium spp.)是多年生宿根草本植物，國內(nèi)外學者對百合的化學成分提取、生物活性物質、產(chǎn)品加工及應用等方面進行了大量研究。現(xiàn)代醫(yī)藥學研究證實百合具有止咳化痰、抗疲勞、耐缺氧、降血糖、抑制遲發(fā)性過敏反應、催眠安神、抗癌等功效[2]。本實驗應用體外培養(yǎng)的人肺癌A549細胞株，探討卷丹百合活性成分對A549細胞增殖的影響，為闡明百合的抗腫瘤機制及臨床應用提供新的治療思路和實驗依據(jù)。

1 實驗材料 主要試劑及材料 實驗用人肺癌細胞株A549由延安大學醫(yī)學實驗中心液氮保存。卷丹百合由西北農(nóng)林大學林學院提供。細胞用RPMIl640培養(yǎng)基、胎牛血清( FCS)及細胞消化液胰酶(Tyrisin)均購自美國Gibco BRL公司；碘化丙錠( PI)、二甲基亞砜( DMSO)、MTT 等購于美國sigma公司。熒光倒置顯微鏡采用Nikon顯微鏡，酶標儀采用美國Bio-Rad 680 型全自動酶標儀。

2 實驗方法 2.1 細胞復蘇培養(yǎng) 從液氮中取出凍存保種的細胞株，迅速置于37℃水浴融化，用培養(yǎng)基洗滌1次。A549細胞常規(guī)培養(yǎng)于37℃、飽和濕度、5%CO2的無菌培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基為RPM I-1640，含10%新生牛血清、1%雙抗(青霉素、鏈霉素) ，2～3d傳代1次，取對數(shù)生長期細胞應用于實驗。

2.2 卷丹百合活性成分的提取 卷丹百合球根鱗片在60 ℃下烘干，粉碎成粉末備用。稱取5 g百合球根干粉，置于三角瓶中，加入150 mL去離子水，70℃超聲提取40min，重復1次，過濾并將濾液蒸發(fā)干，配制50mg/mL的溶液備用。

2.3 MTT 法測細胞增殖率的變化 收集對數(shù)生長期A549細胞，制成單細胞懸液，以1×105/mL的密度接種于96 孔板，每孔100μL，在5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細胞貼壁后，吸出培養(yǎng)液，加入百合水提物，藥物濃度分別為1、2、4、8mg/mL，每組設6個復孔，加藥后分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加MTT溶液( 5 g /L) 20μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸凈含MTT的培養(yǎng)液，加入二甲亞砜( DMSO) 150μL/孔，振蕩10 min，使MTT還原產(chǎn)物甲臜完全溶解，用酶標儀(波長490 nm )測定每孔的光密度(OD值)，取平均值計算抑制率。以空白細胞組為對照，其細胞存活率為100%，計算處理后細胞的生存率。細胞生長抑制率(% ) = (1-實驗組OD值/對照組OD值)×100 %。

2.4 PI染色法觀察肺癌細胞的形態(tài)變化 A549細胞生長至對數(shù)生長期時，調整細胞密度為2×104～2×105個/mL，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2mL，待細胞生長密度達到80%的融合時，加入卷丹百合水提物，濃度分別為2、4、8mg/mL作用于培養(yǎng)的腫瘤細胞，培養(yǎng)時間為48h，重復三次，光鏡下觀察細胞形態(tài)改變，然后以1 000 r /min 離心5 min，棄去培養(yǎng)液，2mL PBS 洗1次，加入50 mg /mL的碘化丙啶(PI)染料，避光染色30 min，熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)改變并拍照。

3 實驗結果3.1 百合對A549細胞增殖抑制作用 MTT結果顯示百合在1～8mg/mL濃度范圍內(nèi)能明顯抑制體外培養(yǎng)的A549細胞生長，并呈現(xiàn)出時間和濃度的依賴性。隨著用藥時間延長，抑制率明顯上升(P<0.05)。相同作用時間下，隨著藥物濃度的增加，其對A549抑制作用越明顯 (P<0.05，見表1)。

表1 不同濃度百合對A549的影響(±s)

注：△與對照組比較P<0.05；▲與對照組比較P<0.01

3.2 顯微鏡下觀察百合對A549細胞生長的抑制 光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)不同濃度的百合作用48h后A549細胞形態(tài)發(fā)生了明顯的改變。用PI 染色后倒置熒光顯微鏡下觀察，空白組的A549細胞呈現(xiàn)梭形，輪廓清晰，細胞密度大；不同濃度的百合作用48h 后的細胞與對照組相比較發(fā)生明顯的形態(tài)改變 (見圖1)，A549細胞皺縮、輪廓模糊，細胞密度明顯降低，細胞間隙增大，并出現(xiàn)大量凋亡細胞，胞核濃縮、裂解；尤其8mg/mL濃度的百合作用后細胞呈圓團形，細胞核聚集成團塊狀。

圖1 不同濃度百合作用48h 后A549細胞生長的PI染色顯微圖(×200)

A:空白對照組； B:2mg/mL的百合作用后的細胞；C:4mg/mL的百合作用后的細胞；D:8mg/mL的百合作用后的細胞。

4 討 論 肺癌生物學特性十分復雜，惡性程度高，目前肺癌的早期診斷比較困難，約70%患者在確診時已屬Ⅲ-Ⅳ期，且發(fā)病率逐年上升，臨床多采用以化療為主的綜合治療方法，毒副作用大。尋找毒副作用小的抗腫瘤藥物是目前整個醫(yī)學界的一大課題，目前國內(nèi)外抗腫瘤藥物研究的一個重要方向是從天然產(chǎn)物(植物或中草藥)提取具有毒副作用小的治療惡性腫瘤的成分[3,4]。我國是應用和栽培百合最早的國家，中藥百合始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，百合肉質鱗莖的鱗片，性味甘寒，有養(yǎng)陰清肺、清心安神之功，具有較好的藥用價值和保健功能。近年來對百合的化學成分、藥理作用、臨床應用方面已做了大量研究，發(fā)現(xiàn)百合球莖中含有多種生物活性成分，如多糖、甾體皂甙及類黃酮、有機酸、蛋白質、維生素、生物堿、磷脂、無機元素、膳食纖維等物質。

本研究MTT結果表明，百合在體外對人肺癌細胞株A549有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴和時間依賴性，尤其8 mg/mL的百合作用72 h 后，對肺癌細胞抑制率可高達54.56%，由于本研究采用的是百合的粗提取物，說明百合的多種生物活性成分具有抑制癌細胞增殖的作用。百合中的甙類為甾體皂苷，根據(jù)甙元結構的不同，可將其歸納為螺甾皂苷、異螺甾皂苷、呋甾皂苷、變形螺甾烷皂苷四大類，從百合中分離得到的甾體類化合物共有47個[5]，百合皂苷及其衍生物能抑制TPA 刺激的宮頸癌細胞，并抑制各種人類惡性腫瘤細胞，如胰腺癌、骨肉瘤、嗜鉻細胞瘤等[6]。有研究表明白首烏甾體皂苷類成分K1N可通過阻滯A549肺癌細胞進入G2/M期，抑制肺癌細胞的生長增殖，C1N、C2N將肺癌細胞阻滯在G0/G1期，阻止受損細胞進入S期進行DNA合成而抑制肺癌細胞的過度增殖[7]。所以筆者推測百合皂苷具有抗腫瘤、抗癌活性，并且其可以抑制肺癌細胞的增殖生長。百合含秋水仙堿能抑制癌細胞的增殖，作用機理是抑制腫瘤細胞的紡錘體，使其停留在分裂中期，不能進行有效的有絲分裂。多糖成分抗腫瘤活性的作用表現(xiàn)為提高宿主免疫功能，也有對腫瘤細胞直接殺傷和抑制的作用。純化百合多糖能抑制H22小鼠肝癌生長，同時能增強荷瘤小鼠的免疫功能[8]。LBPS-I多糖對移植性黑色素B16和Lewis肺癌有較強的抑制作用。百合中的多種活性成分可能作用于癌細胞的不同階段，使細胞生長所需要的DNA、RNA、蛋白質合成受到嚴重阻礙，或破壞癌細胞膜，引起肺癌細胞死亡。

凋亡是受基因調控的細胞程序性死亡，腫瘤細胞的凋亡受到許多凋亡調控基因及酶的影響，細胞增殖過度，凋亡受阻是惡性腫瘤的重要生物學特征之一。黃酮類化合物抗腫瘤通過抑制腫瘤細胞的增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，干擾腫瘤細胞信號轉導和控制基因表達以及抑制血管生成等體現(xiàn)[9]。黃酮類化合物可以激活乳腺癌細胞中的DCL腫瘤抑制基因，抑制細胞增殖，使細胞周期停滯在G2-M，進而誘導p21Waf1基因表達，引起腫瘤凋亡，還能通過抑制細胞信號轉導過程中關鍵酶的活性，作用于腫瘤細胞[9]。本實驗中百合作用48h后的腫瘤細胞，經(jīng)PI染色熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細胞發(fā)生了明顯的形態(tài)改變，細胞形狀模糊，細胞間隙增大，出現(xiàn)了凋亡細胞形態(tài)的改變。說明百合可以誘導人肺腺癌A549細胞凋亡，這可能是百合抑制人肺腺癌A549細胞增殖的另一機制。

百合是衛(wèi)生部審批通過的首批藥食兩用品之一，是一療效確切安全可靠的防病治病之品，其特點是來源廣泛、價格低廉、不良反應輕。百合抗瘤機制與傳統(tǒng)化療藥有著完全不同的特點，并可與其他抗癌藥協(xié)同增效，因此在確定其抗癌活性的基礎上，其作用機制值得進一步深入研究，隨著科學技術的進步和對百合成分的深入研究，有望獲得低毒并具有明確抗腫瘤作用和機制的抗癌藥物，將具有良好的發(fā)展前景。

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(收稿2014-11-15；修回2014-12-11)

Depressant effects of Lilium lancifolium on human pulmonary adenocarcinoma cell line A549in vitro

Medical College of Yan’an University(Yan’an 716000)

Ai Qingyan Zhao Yufeng Wang Aihong et al

Objective：Investigate the effects of Lilium lancifoliumon inhibition of pulmonary adenocarcinoma cell line A549in vitro and explore its mechanism．Methods：The A549cells in vitro were treated with Lilium lancifolium at different concentrations to 24h,48h and 72h respectively. MTT assay was used to examine the proliferation．PI staining were used to observe the morphological changes of cancer cells．Results：The depressant effects of Lilium lancifolium on human A549were determined by MTT assay after at 24h, 48h and 72h.The concentration of Lilium lancif olium was 1～8mg/mL. Lilium lancifolium could obviously inhibit proliferation of A549cells, the effect was a time-dose-dependen tmanner(P<0.05). Pl Fluorescence microscope indicated that apoptotic change was observed in A549cells after treatment with Lilium lancifolium for 48h. Conclusion：Lilium lancifolium can inhibit the growth of A549cells remarkably by inducing apoptosis and blocking cell cycle．

Lung Neoplasms/experiment research Apoptosis @Lilium

*延安市科技項目 (2013-kw03 )

肺腺癌/實驗研究 細胞凋亡 @百合

R730.5

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.04.051

△通訊作者