滿思藝 謝 培 王郁金 周永學(xué)

陜西中醫(yī)學(xué)院 (咸陽(yáng)712046)

·實(shí)驗(yàn)研究·

硝菔通結(jié)方對(duì)便秘大鼠血清5-HT和結(jié)腸組織AQP3的影響*

滿思藝 謝 培 王郁金 周永學(xué)△

陜西中醫(yī)學(xué)院 (咸陽(yáng)712046)

目的：觀察硝菔通結(jié)方對(duì)便秘模型大鼠血清5-HT和結(jié)腸組織AQP3表達(dá)的影響，揭示該方治療便秘的作用機(jī)制。方法：將50只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、硝菔通結(jié)方低、中、高劑量組。除正常組外，其余各組大鼠以15mg/kg復(fù)方地芬諾酯混懸液灌胃28 d，復(fù)制便秘模型。模型成功后，分別給藥21d，后取血清和結(jié)腸組織，ELISA法檢測(cè)血清5-HT含量，Q-PCR法檢測(cè)結(jié)腸組織AQP3的mRNA表達(dá)。結(jié)果：模型組的大鼠血清中5-HT含量與正常組比較明顯升高(P<0.05)；藥物治療后，各治療組血清中5-HT含量均降低(P<0.05)，其中硝菔通結(jié)方高劑量組最為顯著(P<0.01)；模型組結(jié)腸組織中AQP3與正常組比較表達(dá)升高(P<0.05)，各劑量的硝菔通結(jié)方治療組均降低了結(jié)腸組織中AQP3的表達(dá)，其中硝菔通結(jié)方高劑量組最為明顯(P<0.05)。結(jié)論：硝菔通結(jié)方可通過(guò)降低血清5-HT含量和降低結(jié)腸組織AQP3的表達(dá)從而促進(jìn)腸道動(dòng)力和調(diào)節(jié)腸道水液代謝，對(duì)功能性便秘發(fā)揮治療作用。

功能性便秘是以排便次數(shù)減少、糞便量減少、糞便干結(jié)、排便費(fèi)力等為表現(xiàn)的臨床常見(jiàn)病，并且隨著年齡增加，便秘的發(fā)生率和嚴(yán)重程度也會(huì)隨之增加[1]。便秘已成為嚴(yán)重影響現(xiàn)代人生活質(zhì)量的疾病嚴(yán)，并且易誘發(fā)結(jié)腸癌、心腦血管意外等疾病[2]。硝菔通結(jié)方是在清代著名醫(yī)家張錫純所創(chuàng)名方“硝菔通結(jié)湯”的基礎(chǔ)上，根據(jù)功能性便秘常以腎虛為主的特點(diǎn)，加入了助陽(yáng)通便的肉蓯蓉和潤(rùn)腸通便的當(dāng)歸。全方由芒硝、萊菔、肉蓯蓉、當(dāng)歸組成，用于治療腎虛腸燥型便秘臨床療效確切，但該方的作用機(jī)制目前尚不十分清楚。而現(xiàn)代研究表明，功能性便秘的發(fā)生于腸道動(dòng)力失常和水液代謝紊亂密切相關(guān)，而腸神經(jīng)遞質(zhì)5羥色胺(5-HT)和水通道蛋白3(AQP3)與腸道動(dòng)力和水液代謝密切相關(guān)[3-5]。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察硝菔通結(jié)方對(duì)功能性便秘大鼠體內(nèi)5-HT及AQP3的影響，為該方的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法 1.1 動(dòng)物 選用成年雄性SD大鼠50只，體重200～250g，購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(陜)2012-003。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，自由攝食及飲水。

1.2 主要試劑和儀器 大鼠5-HT Elisa檢測(cè)試劑盒：批號(hào)：23007331；上海西唐生物技術(shù)有限公司； EasyPure RNA Kit：批號(hào)：ER101-01H30716Q046，北京全式金生物技術(shù)有限公司；cDNA合成試劑盒、Q-PCR試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司; AQP3引物的設(shè)計(jì)與合成：南京金斯瑞生物科技有限公司；PCR儀EDC-810型：北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；核酸測(cè)定儀，型號(hào)：NANODROP2000C，Thermo(美國(guó))公司；高速分散器(內(nèi)切式勻漿機(jī))，XHF-D；寧波新芝生物科技股份有限公司；全自動(dòng)高壓滅菌器：5Y0915，日本三洋公司；酶標(biāo)儀：ELX808， Bio Tek，美國(guó)伯騰儀器有限公司；低溫4℃離心機(jī)：上海第三儀器廠。

1.3 分組與造模 采用隨機(jī)數(shù)字法將大鼠隨機(jī)分為正常組、功能性便秘(FC)模型組、硝菔通結(jié)方低劑量組、硝菔通結(jié)方中劑量組、硝菔通結(jié)方高劑量組，每組10只。除正常組外的各組大鼠每日灌服復(fù)方地芬諾酯溶液，灌服濃度為15mg/kg，連續(xù)灌胃28d后，大鼠出現(xiàn)排便困難，被毛脫落，喜扎堆等現(xiàn)象，表示功能性便秘(FC)模型制造成功。正常組以等量生理鹽水灌胃。

1.4 藥物治療 對(duì)硝菔通結(jié)方低、中、高3個(gè)劑量組每日分別灌服95g/kg、190g/kg、380g/kg的硝菔通結(jié)方；正常組和FC組每日灌服2mL/100g的生理鹽水。

1.5 樣本的采集與檢測(cè) 給藥21d后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食24h，10%的水合氯醛 4mL/kg腹腔注射麻醉，開(kāi)腹腔腹主靜脈采血3～10mL，室溫靜置血液30min后離心分離出血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清中5-HT的濃度；取回盲部以下結(jié)腸組織1cm，用預(yù)冷的生理鹽水清洗，置于5mLEP管中，加入1mL RNAhold，勻漿，按RNA提取試劑盒提取總RNA，取2 μL總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，cDNA合成體系：總RNA2μL，ALL-in-one SuperMix4μL、gDNA Remover1μL,加RNase-free Water定容至20μL，輕輕混勻，42℃孵育15min，85℃加熱5min，測(cè)定cDNA，備用。Q-PCR法檢測(cè)mRNA表達(dá)，PCR反應(yīng)體系：PCR Mix 10μL，引物各0.4μL，cDNA量根據(jù)濃度定，加滅菌蒸餾水補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 S；57℃退火45S；72℃延伸40S；共40-45個(gè)循環(huán)72℃終末延伸10 min。引物序列見(jiàn)表1。

表1 Q-PCR引物序列

2 結(jié) 果 2.1 一般情況 正常組大鼠行動(dòng)活躍、精神良好、皮毛光澤,實(shí)驗(yàn)后體重、食量隨增齡明顯高于實(shí)驗(yàn)前；模型組大鼠大便困難(便量少，便粒小，糞便干結(jié)，無(wú)光澤)，形體消瘦，喜扎堆，被毛脫落，納差，造模后體重增加不明顯；治療組(硝菔通結(jié)方低、中、高劑量組)大鼠在治療后，體重均有增加，精神狀態(tài)及排便情況出現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)，扎堆現(xiàn)象消失，造模時(shí)脫落的被毛重新長(zhǎng)出。

2.2 硝菔通結(jié)方對(duì)功能性便秘大鼠血清5-HT含量的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清5-HT含量顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，硝菔通結(jié)方高、中、低劑量大鼠血清5-HT濃度明顯降低(P<0.05)，其中以高劑量組最為明顯(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 硝菔通結(jié)方對(duì)功能性便秘大鼠血清中5-HT含量的影響

注：與對(duì)照組比較，△P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05，◇P<0.01

2.3 硝菔通結(jié)方對(duì)功能性便秘大鼠結(jié)腸組織AQP3表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組結(jié)腸組織中AQP3表達(dá)較正常組有顯著性升高(P<0.05)；硝菔通結(jié)方各劑量可有效降低結(jié)腸組織中AQP3的表達(dá), 其中高劑量組與模型組具有顯著性(P<0.05)差異,見(jiàn)表3。

表3 大鼠結(jié)腸組織AQP3的表達(dá)

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05。

討 論 5-HT是腸神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)，由嗜鉻細(xì)胞(enterochromaffin cells, EC)通過(guò)色氨酸羥化酶1(tryptophan hydroxylase 1，Tph-1)合成，具有促進(jìn)腸蠕動(dòng)和分泌的作用。5-HT釋放并作用于靶細(xì)胞發(fā)揮作用后，必須重吸收至細(xì)胞內(nèi)降解、滅活，終止其作用，該過(guò)程即由5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體(serotonin transporter, SERT)完成。因此，5-HT對(duì)胃腸道運(yùn)動(dòng)功能的調(diào)節(jié)需要5-HT、5-HT受體、SERT的共同參與才能完成[6]。研究發(fā)現(xiàn)[7,8]便秘患者的結(jié)腸黏膜5-HT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和染色強(qiáng)度均以及TpH1的轉(zhuǎn)錄明顯增加，但EC細(xì)胞的數(shù)量及SERT轉(zhuǎn)錄水平卻無(wú)改變，因此推斷黏膜內(nèi)5-HT的合成和釋放增加，可能是由于其受體敏感性和反應(yīng)性下降，從而導(dǎo)致便秘[9]。本實(shí)驗(yàn)中便秘模型大鼠血清中5-HT含量明顯高于正常組，經(jīng)過(guò)硝菔通結(jié)方治療后，5-HT含量下降至正常值，提示硝菔通結(jié)方通過(guò)改善5-HT的受體敏感性和反應(yīng)性從而恢復(fù)腸神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)胃腸道調(diào)節(jié)的作用。

AQP3屬跨膜蛋白家族，主要分布于人類(lèi)小腸和結(jié)腸的上皮細(xì)胞中，其所介導(dǎo)的自由水快速被動(dòng)的跨生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)是水進(jìn)出細(xì)胞的主要途徑，在消化道上皮細(xì)胞對(duì)水的吸收中起重要作用[10]。AQP3具體的作用機(jī)制尚不十分清楚，但臨床研究發(fā)現(xiàn)功能性便秘患者右半結(jié)腸AQP3含量顯著高于對(duì)照組[11]，且應(yīng)用瀉藥后，結(jié)腸中AQP3的表達(dá)顯著降低[5][12]。這些結(jié)果都提示AQP3可能通過(guò)將糞便中的水分轉(zhuǎn)運(yùn)至結(jié)腸上皮細(xì)胞，從而降低糞便含水量。AQP3表達(dá)升高引起糞便含水量降低，繼而引發(fā)便秘，這可能是便秘發(fā)生的一個(gè)重要機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)中便秘模型大鼠腸組織中AQP3表達(dá)顯著升高，經(jīng)過(guò)硝菔通結(jié)方治療，大鼠結(jié)腸組織中AQP3表達(dá)降低，提示硝菔通結(jié)方通過(guò)降低AQP3從而調(diào)節(jié)腸道對(duì)水分的吸收，對(duì)功能性便秘發(fā)揮治療作用。

[1] Bouras EP,Tangalos EG,et al. Chrome constipation in the elderly[J].Gastroenterol Cline North Am,2009,38(3):463-480.

[2] Chmulson Wasserman M,Francisconi C,Olden K,et al. The Latin-American Consensus on Chronic Constipation [J] .Gastroenterol Hepatol , 2008, 31(2): 59-74.

[3] Camilleri M. Serotonin in the gastrointestinal tract[J]. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes 2009, 16: 53-59.

[4] 丁健華,傅傳剛,趙榮華.五羥色胺在胃腸道功能性疾病中的研究現(xiàn)狀[J].世界華人消化雜志,2005,13: 2405-2408.

[5] Ikarashi N, Kon R, Iizasa T, et al. Inhibition of aquaporin-3 water channel in the colon induces diarrhea[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin,2012,35(6):957-962.

[6] Coates MD,Mahoney CR,Linden DR,Sampson JE,Chen J,Blaszyk H,Crowell MD, harkey KA,Ger-shon MD,Mawe GM, Moses PL.Molecular defects in mucosal serotonin content and decreased sero-tonin reuptake transporter in ulcerative colitis and irritable bowel syndrome[J].Gastroenterology 2004,126: 1657-1664.

[7] Zhao RH, Baig MK, Thaler KJ, Mack J, Abramson S, Woodhouse S, Tamir H, Wexner SD.Reduced expression of serotonin receptor(s) in the left colon of patients with colonic inertia[J]. Dis Colon Rectum 2003, 46: 81-86.

[8] Costedio MM, Coates MD, Brooks EM, et al. Mucosal serotonin signaling is altered in chronic constipation but not in opiate-induced constipation[J]. Am J Gastroenterol 2010,105: 1173-1180.

[9] Dunlop SP, Coleman NS, Blackshaw E, Perkins AC, Singh G, Marsden CA, Spiller RC. Abnormalities of 5-hydroxytryptamine metabolism in irritable bowel syndrome[J]. Clin Gastroenterol Hepatol 2005; 3: 349-357.

[10] Matsuzaki T, Tajika Y, Ablimit A, Aquaporins in the digestive system[J]. Med Electron Microsc.2004,37(2):71-80.

[11] 楊會(huì)鋒,袁維堂.水通道蛋白3和水通道蛋白9在結(jié)腸黏膜的表達(dá)及意義[J].醫(yī)藥論壇雜志, 2007,28(6):12-14.

[12] Nobutomo Ikarashi, Ayako Mimura, Risako Kon, Tomohiko Iizasa, Midori Omodaka, Chika Nagoya,Makoto Ishii, Takahiro Toda, Wataru Ochiai, Kiyoshi Sugiyama. The concomitant use of an osmotic laxative, magnesium sulphate,and a stimulant laxative, bisacodyl, does not enhance the laxative effect[J]. European Journal of Pharmaceutical Sciences,2012,45:73-78.

(收稿2014-11-10；修回2014-11-25)

序號(hào)標(biāo)注范例

根據(jù)國(guó)家科技期刊編排規(guī)范要求，凡投入本刊的論文具備使用6級(jí)序號(hào)條件的稿件，必須規(guī)范標(biāo)注序號(hào)，即層次標(biāo)題的序號(hào)一律用阿拉伯?dāng)?shù)字連續(xù)編碼，不同層次的數(shù)字間用小圓點(diǎn)“.”相隔，末位數(shù)字后不加點(diǎn)號(hào)，如“1”,“1.1”,“1.1.1”，“1.1.1.1”，“1.1.1.1.1”，和文內(nèi)序號(hào)“①，②，③，④”等等；各層次標(biāo)題的序號(hào)一律空兩格書(shū)寫(xiě)，序號(hào)后空1個(gè)字距接排標(biāo)題。不具備使用6級(jí)序號(hào)條件的稿件一律不使用6級(jí)序號(hào)，也不能隨意標(biāo)注序號(hào)。只具備使用第6級(jí)序號(hào)(即文內(nèi)序號(hào)如"①，②，③，④")可單獨(dú)使用。

陜西醫(yī)學(xué)、陜西中醫(yī)雜志社

Effects of Xiaofu Tongjie Prescription on the 5-HT content in Serum and the Expression of AQP3in Colon in Constipated Rats

ShaanXi University of Chinese Medicine(Xianyang 712046)

Man Siyi Xie Pei Wang Yujin et al

Objective:To observe the effect of Xiaofu Tongjie prescription effect on the 5-HT content in serum and the mRNA expression of AQP3in colon in constipated rats, so as to reveal the mechanism of the prescription in the treatment of constipation. Methods: 50 male SD rats were randomly divided into normal control group, model group, Xiaofu Tongjie-low dose group, Xiaofu Tongjie-medium dose group and Xiaofutongjie-high dose group. Except the normal control group, the rest of the rats were intragastrically administered with 15mg/kg compound diphenoxylate for 28 days to replicate the constipation model. Then serum and colonic tissue samples were collected after 21 days of treatment. The 5-HT content in serum were detected with ELISA method and the mRNA expression of AQP3were detected with Q-PCR method.Results: The 5-HT content in serum of the model group increased significantly compared with the normal control group(P<0.05). After prescription treatment, the 5-HT level in each treatment group decreased (P<0.05),and the Xiaofu Tongjie-high dose group marked decreases (P<0.01). AQP3expression in colonic tissue of model group increases compared with the common control group (P<0.05), different dose of the Xiaofutongjie prescription groups all decrease the AQP3expression in colonic tissue, but Xiaofu Tongjie-high dose group marked ecreasesP<0.05).Conclusion:Xiaofutongjie prescription can reduce the 5-HT content in serum and decrease the mRNA expression of AQP3in colon, thus to improve the intestinal power and regulate the water metabolism of intestinal tract. Consequently, it has a great therapeutic effect on functional constipation.

Constipation unctional/integrated Chinese traditional and western medicine therapy @Xiaofu Tongjie prescription Animal，Experiment Rats

*國(guó)家自然科學(xué)基金(81273663)；國(guó)家課題重大專(zhuān)項(xiàng)(2012ZX09103201-037)

便秘，功能性/中西醫(yī)結(jié)合療法 @硝菔通結(jié)方 動(dòng)物，實(shí)驗(yàn) 大鼠

R256.35

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.04.050

△通訊作者，陜西省胃腸病證方藥研究室(咸陽(yáng)712046)