張夢(mèng)迪 王集會(huì) 高世杰△ 宋俊玉 郭 欣 姚鵬宇 劉方明

山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院2011級(jí)制藥工程 (濟(jì)南250355)

砒霜酶解工藝研究*

張夢(mèng)迪 王集會(huì)▲高世杰△▲宋俊玉 郭 欣 姚鵬宇□劉方明■

山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院2011級(jí)制藥工程 (濟(jì)南250355)

目的:研究砒霜有效成分三氧化二砷(As2O3)的最佳酶解工藝。方法：本實(shí)驗(yàn)研究所用試劑為分析純的As2O3，采用半仿生酶解法，按照進(jìn)入消化系統(tǒng)順序，先篩選出仿胃的最佳酶解工藝，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行仿腸酶解。以酶底比、酶解時(shí)間和pH值為考察因素，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，用二乙基二硫代氨基甲酸銀法測(cè)定可溶解的相對(duì)砷離子含量，以砷轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，選擇最佳酶解工藝。結(jié)果：仿胃以A2B1C2酶解后砷轉(zhuǎn)化率最高，仿腸以A2B2C3酶解后砷轉(zhuǎn)化率最高。結(jié)論：仿胃在pH<2.0的環(huán)境，酶底比為1，酶解時(shí)間為60 min的酶解工藝最佳，砷的轉(zhuǎn)化率最高。仿腸在pH=7.5，酶底比為1.5，酶解時(shí)間為360 min時(shí)的酶解工藝最佳，砷轉(zhuǎn)化率最高。

砒霜始載于《日華子本草》，由砒石升華而來(lái)，該藥味辛、酸、大熱、有大毒，歸肝、胃經(jīng)，《本草綱目》中記載砒石解毒治壅、爛肉，蝕瘀腐?，F(xiàn)代臨床與雄黃合用治療化療后感染類疾病[2]。作為一種傳統(tǒng)的“以毒攻毒”藥物，該藥除應(yīng)用于一些普通內(nèi)外科病癥外，還在惡性腫瘤的治療方面顯示出了良好的應(yīng)用前景。但該藥毒性較大，在有毒中藥中金屬元素砷的毒性，一直是廣泛應(yīng)用于臨床的難題，科學(xué)研究中對(duì)藥品中砷的含量也十分關(guān)注[3]。近年來(lái)砒霜在惡性腫瘤的治療中顯示出了良好的應(yīng)用前景。砒霜主要成分是三氧化二砷(As2O3)，As2O3在治療慢性粒細(xì)胞性白血病(CML)、急性粒細(xì)胞性白血病(ALP)、骨質(zhì)增生異常綜合征(MDS)等惡性血液系統(tǒng)疾病療效顯著，且對(duì)人胃癌移植瘤Flt-1、KDR和VEGFR-3表達(dá)有抑制作用[4，5]。但該藥毒性較大，如何推廣應(yīng)用是臨床的難題。本實(shí)驗(yàn)以分析純As2O3為原料，用生物酶仿生提取的方法模擬人體內(nèi)的消化過(guò)程，以pH值、酶底比、酶解時(shí)間為考察因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，用二乙基二硫代氨基甲酸銀法測(cè)定酶解后溶解砷，以砷轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，確定了最佳酶解工藝。近年來(lái)臨床中主要研究砷注射劑抗肝癌的作用，而砷口服制劑酶解工藝的研究較少。

1 儀器與試劑 FA1004N型電子分析天平(上海精密儀器有限公司)；SK-1快速混勻漩渦器(國(guó)華儀器)；KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；PHS-2C型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)(上海今邁儀器儀表公司)；LDZ4-0.8型離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；HWLC型電熱恒溫水溫箱(北京醫(yī)療設(shè)備廠)；UV9100B型可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司)；儀表恒溫水浴鍋(黃驊市綜合電器廠)

胃蛋白酶(批號(hào)：20120203，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，胰蛋白酶(批號(hào)：20120529，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，As2O3(分析純)，濃鹽酸(分析純)，pH緩沖劑(鄰苯二甲酸氫鉀、混合磷酸鹽)，鋅粒(分析純)，醋酸鉛，三氯甲烷，酸性氯化錫試液、DCC銀、碘化鉀等均根據(jù)文獻(xiàn)[1]配制。

2 方法與結(jié)果 2.1 砷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取標(biāo)準(zhǔn)砷溶液(10μg/mL)0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，分別置于測(cè)砷裝置的磨口錐形瓶中，加鹽酸5 mL、水21 mL、碘化鉀試液5 mL，最后滴加酸性氯化錫試液5滴，室溫下放置10 min后，加無(wú)砷鋅粒2 g，立即將導(dǎo)氣管與磨口錐形瓶密塞，使生成的砷化氫氣體導(dǎo)入平底玻璃管中。將磨口錐形瓶置于25 ℃～40 ℃水浴中反應(yīng)45 min。取下平底玻璃管，添加三氯甲烷至5 mL刻度，混勻。將溶液移至1 cm比色皿中，用分光光度計(jì)在510 nm波長(zhǎng)處以二乙基二硫代氨基甲酸銀試液為空白對(duì)照，測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)砷溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為 y=0.1701x-0.0202。

2.2 設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)選取最佳酶解工藝 以pH值、酶底比、酶解時(shí)間為因素，仿胃酶解調(diào)節(jié)不同的pH值(1.0,1.5,2.0)，加入不同量的胃蛋白酶(0.02g，0.03g，0.04 g)，并于37℃水浴中提取相應(yīng)的的時(shí)間(30 min,60 min,90 min)。仿腸酶解調(diào)節(jié)不同pH值(6.5,7.5,8.5)后加入不同量的胰蛋白酶(0.025g，0.03g，0.035g)，并于37℃水浴中提取相應(yīng)的時(shí)間(240 min,300 min,360 min)。

砷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3 超聲提取 精密稱取As2O30.02 g，加100 mL水溶解并稱重，超聲提取30min后稱重并補(bǔ)足損失的水，再加100 mL水溶解并稱重，超聲提取30min后再次稱重并補(bǔ)足損失的水。

2.4 仿胃提取 超聲提取后，調(diào)節(jié)不同的pH值(1.0,1.5,2.0)，加入不同量的胃蛋白酶(0.02 g，0.03 g，0.04 g)，并于37℃水浴中提取相應(yīng)的的時(shí)間(30 min,60 min,90 min)，然后經(jīng)85℃水浴30 min殺酶。取適量于3000 rpm轉(zhuǎn)速下離心10 min后，移取400 μL上清液，定容至10mL，用DCC銀法測(cè)定該溶液中砷的含量。各因素離均差平方和計(jì)算公式SSj=(Ⅰj2+Ⅱj2+Ⅲj2)/9-C；Rj=Ⅰj2+Ⅱj2+Ⅲj2。方差分析表明,因素A對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響非常顯著，因素B也有顯著影響，而因素C對(duì)試驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有顯著影響。

由表1可見(jiàn)，試驗(yàn)方案為A2B1C2(pH值為2.0，酶底比為1，酶解時(shí)間為60 min)時(shí)，砷轉(zhuǎn)化率最高。因此，選取砷的轉(zhuǎn)化率最高的方案A2B1C2為最佳方案。酶解時(shí)間對(duì)試驗(yàn)沒(méi)有顯著性影響，pH值和酶底比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果均有顯著性影響。表1、2中的D列只是對(duì)誤差的顯著性分析，不作為因素。

2.5 仿腸提取 經(jīng)最佳仿胃酶解工藝(pH值為2.0，酶底比為1，酶解時(shí)間為60min)提取后，調(diào)節(jié)不同pH值(6.5,7.5,8.5)后加入不同量的胰蛋白酶(0.025 g，0.03 g，0.035 g)，并于37 ℃水浴中提取相應(yīng)的時(shí)間(240 min,300 min,360 min)，然后經(jīng)85 ℃水浴30 min殺酶。取適量于3000 rpm轉(zhuǎn)速下離心10 min后，移取400μL上清液，定容至10 mL，用DCC銀法測(cè)定該溶液中砷的含量。方差分析表明,因素A和C對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響非常顯著，而因素B對(duì)試驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有顯著影響。注:方差分析使用SPSS計(jì)算。

由表2可見(jiàn)，試驗(yàn)方案為A2B2C3(pH值為7.5的環(huán)境下，酶底比為1.5，酶解時(shí)間為360 min)時(shí)，砷轉(zhuǎn)化率最高。因此，選取砷的轉(zhuǎn)化率最高的方案A2B2C3為最佳方案,酶底比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有顯著性影響，pH值和酶解時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響。

根據(jù)仿胃顯著性分析表明pH和酶底比有顯著性影響，根據(jù)表1分析結(jié)果表明仿胃酶解最佳工藝為A2B1C2。即在pH值為2.0的環(huán)境下，酶底比為1，酶解時(shí)間為60 min的酶解工藝最佳，此酶解工藝的砷轉(zhuǎn)化率最高。根據(jù)仿腸顯著性分析表明pH值和酶解時(shí)間有顯著性影響，根據(jù)表2分析結(jié)果表明仿腸酶解最佳工藝為A2B2C3。即在pH值為7.5、酶底比為1.5、酶解時(shí)間為360 min時(shí)的酶解工藝最佳，此時(shí)砷的轉(zhuǎn)化率最高。

表1 仿胃酶解工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 仿腸酶解工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論 采用半仿生的方法，因人體消化吸收順序先經(jīng)過(guò)胃的消化吸收再進(jìn)入腸中，所以此實(shí)驗(yàn)先篩選出仿胃的最佳酶解工藝，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行仿腸酶解。仿胃酶解在pH值為2.0的環(huán)境下，酶底比為1，酶解時(shí)間為60 min的酶解工藝最佳，此酶解工藝的砷轉(zhuǎn)化率最高，仿腸酶解在pH值為7.5、酶底比為1.5、酶解時(shí)間為360 min時(shí)的酶解工藝最佳，此時(shí)砷的轉(zhuǎn)化率最高可以為含As2O3口服藥物的研究提供參考。因?yàn)锳s203在水中的溶解度很小，自然溶解耗時(shí)，超聲提取有助溶的作用，經(jīng)驗(yàn)證，超聲提取1h可加速砷溶解于水，保證酶解的是未溶于水的As203。As203是兩性物質(zhì)，微溶于水，溶于酸堿，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明pH可影響As203的在水中的溶解度。本實(shí)驗(yàn)酶解研究用分析純的As2O3代替砒霜，是以砷轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)探究酶解最佳工藝的，若以藥理活性為指標(biāo)進(jìn)行研究，會(huì)更具有臨床意義，此工作有待于今后的進(jìn)一步研究。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(2010年版，一部)[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出出社.2010，附錄50:51.

[2] 朱文艷.復(fù)方雄黃膏治療化療肛周感染療效觀察[J].陜西中醫(yī),2011，32(8):1027-1030.

[3] 王新霞，宋雪玲.對(duì)中藥龍齒重金屬及砷鹽限度規(guī)定的討論.陜西中醫(yī),2012，33(2):233-236.

[4] 冉 伶，劉文君.三氧化二砷抗腫瘤作用機(jī)制研究進(jìn)展.中國(guó)醫(yī)藥科學(xué),2012，2(1):39

[5] 徐爾迪，肖延風(fēng).三氧化二砷對(duì)人胃癌裸鼠移植瘤Flt-1、KDR和VEGFR-3表達(dá)的影響.陜西醫(yī)學(xué)雜志,2013，42(8):943-947.

(收稿2014- 09-02；修回2014-11-17)

Study on the process of Chinese medicine arsenic enzymolysis

2011 Levels of Pharmaceutical Engineering of Shandong University of Traditional Chinese Medicine(Jinan 250355)

Zhang Mengdi Wang Jihui Gao Shijie et al

Objective：To study the effective components of arsenic trioxidearsenic (As2O3) solution optimum enzyme. Methods:The experimental study of the reagents used for the analysis of pure As2O3, using semi bionic enzymatic method, according to the order into the digestive system, first screened the optimum enzyme hydrolysis process of imitation of the stomach, carried out on the basis of imitation intestinal enzyme solution. In the enzyme substrate ratio, enzymolysis time and PH value as factors,orthogonal experiment design, the determination of the relative content of arsenic ions dissolved with two ethyl two dithiocarbamate method with silver,arsenic transformation rate as an index, select the optimum hydrolysis process. Results: Imitation of stomach to A2B1C2 after enzymatic hydrolysis arsenic transformation rate is the highest, in imitation of the intestine to A2B2C3 after enzymatic hydrolysis of arsenic the highest conversion rate.Conclusion: imitation of stomach in pH < 2 environment, enzyme substrate ratio is 1, and the hydrolysis time of 60 min enzymolysis technology is the highest conversion rate of arsenic. In imitation of intestinal pH=7.5, enzyme substrate ratio is 1.5, the hydrolysis time is 360 min when the enzymolysis technology is best, the highest conversion rate of arsenic.

Arsenic @the enzymolysis technology

*山東中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生訓(xùn)練(SRT)計(jì)劃資助項(xiàng)目(2014172)

砒霜 @酶解工藝

R282

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.04.047

△通訊作者

▲山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心化學(xué)實(shí)驗(yàn)室 (濟(jì)南250355)

□山東中醫(yī)藥大學(xué)2012級(jí)中西醫(yī)結(jié)合臨床 (濟(jì)南250355)

■北京劉方明國(guó)際醫(yī)藥研究院 (北京100083)