于 倩 王 清 袁澤軼 吳惠豐 趙建民①

(1. 中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所 中國(guó)科學(xué)院海岸帶環(huán)境過(guò)程與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 煙臺(tái) 264003;2. 國(guó)家海洋信息中心 天津 300171; 3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

浮游植物是海洋生態(tài)系統(tǒng)中最主要的初級(jí)生產(chǎn)者, 其生長(zhǎng)通常受到氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素的限制(Huanget al, 2005)。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為, 氮是近海浮游植物生長(zhǎng)的主要營(yíng)養(yǎng)鹽限制因子(Rytheret al, 1971; Zehret al, 2011; Hoet al, 2013), 但初級(jí)生產(chǎn)的磷限制也相繼在地中海、紅海、馬尾藻海和北大西洋等海區(qū)被發(fā)現(xiàn)(Thingstadet al, 1998; Wuet al, 2000)。

近年來(lái), 由于陸源氮輸入的增加和磷輸入量的減少, 已導(dǎo)致我國(guó)近海磷潛在限制的趨勢(shì)愈發(fā)嚴(yán)重(Xuet al, 2010)。在海洋環(huán)境中, 溶解態(tài)磷主要以溶解無(wú)機(jī)磷(Dissolved inorganic phosphorus, DIP)和溶解有機(jī)磷(Dissolved organic phosphorus, DOP)兩種形式存在?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn), 浮游植物對(duì)不同形態(tài)磷源的利用能力存在差異, 且這種差異可能影響到種群在生態(tài)系統(tǒng)中的競(jìng)爭(zhēng)地位(Hoppe, 2003; Kruskopfet al,2004; Xuet al, 2010)。通常來(lái)說(shuō), DIP可被多數(shù)浮游植物直接吸收利用, 而 DOP則需要通過(guò)一系列酶的水解作用轉(zhuǎn)化為DIP后再被利用(Ohet al, 2002; Huanget al, 2005; 張清春等, 2005)。例如, 在DIP限制條件下,浮游植物可通過(guò)胞外堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AP)分解水體中的 DOP, 釋放磷酸根供細(xì)胞吸收利用(Hoppe, 2003; 唐洪杰等, 2006)。此外, 浮游植物也可以利用胞內(nèi)酸性磷酸酶(Acid phosphatase, AcP)水解儲(chǔ)存于胞內(nèi)的磷, 以維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)(趙艷芳等,2009)。

具槽帕拉藻(Paralia sulcata)隸屬于中心硅藻綱、帕拉藻屬, 是一種廣泛分布在溫帶半咸水沿海區(qū)域的底棲硅藻(McQuoidet al, 2003; Gebühret al, 2009)。研究發(fā)現(xiàn), 具槽帕拉藻的生長(zhǎng)狀態(tài)和外界環(huán)境緊密相關(guān)(Gebühret al, 2009); 同時(shí), 該物種具有易沉降、難降解的特性, 使其能夠在沉積物中得以較好地保存, 因此常被用作海洋環(huán)境的指示物種(McQuoidet al, 2003)。目前, 國(guó)內(nèi)外學(xué)者已針對(duì)具槽帕拉藻的生態(tài)特征開(kāi)展了相關(guān)研究(Hobsonet al, 1997; Zong 1997), 但關(guān)于其對(duì)不同磷源利用能力的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)比較不同形態(tài)磷源對(duì)具槽帕拉藻生長(zhǎng)及磷酸酶活力的影響, 可為探討浮游植物對(duì)不同形態(tài)磷源的吸收利用特征提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 藻種及試劑

實(shí)驗(yàn)所用具槽帕拉藻(Paralia sulcata)分離自渤海近岸海域, 并在本實(shí)驗(yàn)室保存。藻種采用 f/2培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng), 培養(yǎng)條件如下: 溫度為(23.0±0.50)°C,光暗周期為14:10h, 光照強(qiáng)度為3.0×103lx。正式實(shí)驗(yàn)前, 通過(guò)添加抗生素(硫酸鏈霉素與青霉素鈉鹽混合液)的方式對(duì)預(yù)接種藻液進(jìn)行滅菌處理(Kwonet al,2013)。

5種不同形態(tài)的磷源分別為磷酸二氫鉀(KH2PO4)、β-甘油磷酸鈉(Sodium-β-glycerophosphate, β-G-P)、葡萄糖-6-磷酸(Glucose-6-phosphate, G-6-P)、三磷酸腺苷二鈉(Adenosine disodium triphosphate, ATP)和卵磷脂(Lecithin, LEC), 均購(gòu)自Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

參照 Harrison等(1980)的方法配制人工海水, 經(jīng)0.22μm 孔徑醋酸纖維濾膜過(guò)濾后, 配制 f/2培養(yǎng)基,用于藻細(xì)胞培養(yǎng)。將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的具槽帕拉藻經(jīng)5.0×103r/min離心 15min, 收集藻細(xì)胞并用人工海水清洗 2次, 接種于未添加營(yíng)養(yǎng)鹽的過(guò)濾消毒海水中(初始藻密度約為 5.0×103cells/mL), 培養(yǎng) 3天以消耗母液中的磷。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中, 設(shè)置5個(gè)處理組分別添加不同形態(tài)的磷源, 各形態(tài)磷的初始濃度均為 4.0μmol/L, 調(diào)整N︰P=16︰1, 其他營(yíng)養(yǎng)鹽成分按照f(shuō)/2培養(yǎng)基進(jìn)行添加, 每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)重復(fù), 實(shí)驗(yàn)周期為7天。

1.3 藻細(xì)胞計(jì)數(shù)

采用浮游植物計(jì)數(shù)框進(jìn)行顯微鏡鏡檢計(jì)數(shù); 每24h取樣一次, 各處理組平行取樣3次并測(cè)算平均值,記錄細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)據(jù)并分析細(xì)胞生長(zhǎng)情況(李英等,2005)。

1.4 DIP和DOP的含量測(cè)定

DIP含量的測(cè)定采用磷鉬藍(lán)比色法(Leeet al, 2013);培養(yǎng)液中的總?cè)芙鈶B(tài)磷(Total dissolved phosphorus,TDP)和藻細(xì)胞內(nèi)的 TDP含量采用過(guò)硫酸鉀(K2S2O8)氧化法測(cè)定(Jeffrieset al, 1979); DOP濃度以TDP減去DIP的濃度測(cè)算。

1.5 磷酸酶活性分析

AP和AcP活性的測(cè)定參照Wynne(1977)的方法進(jìn)行, 采用對(duì)硝基苯酚磷酸鹽(p-nitrophenyl phosphate,pNPP)作為底物。藻細(xì)胞分別經(jīng) Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L, pH 9.0)和醋酸-醋酸鈉緩沖液(0.20mol/L,pH 5.0)勻漿, 用于后續(xù)的AP和AcP活性測(cè)定。測(cè)定過(guò)程中, 以未加底物的藻細(xì)胞勻漿液作為空白組。酶活力單位定義如下: 在 30°C條件下, 單位時(shí)間內(nèi)每個(gè)藻細(xì)胞產(chǎn)生的磷酸酶釋放 1.0μg對(duì)硝基苯酚(p-nitrophenol, PNP)作為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示; 利用 SPSS16.0軟件對(duì)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析, 當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為處理之間存在顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同磷源對(duì)具槽帕拉藻生長(zhǎng)的影響

由圖1可知, 5種不同形態(tài)磷源均可促進(jìn)具槽帕拉藻的生長(zhǎng)。其中, 以G-6-P為磷源處理組的藻細(xì)胞生長(zhǎng)最好, 從第2天開(kāi)始細(xì)胞密度就高于其它處理組,至第 6天時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到最高值(3.2×104cells/mL);以ATP為磷源的處理組次之, 第5天時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到峰值(2.7×104cells/mL), 但從第 6天開(kāi)始細(xì)胞密度迅速下降; 以β-G-P和LEC為磷源的處理組中, 藻細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)及細(xì)胞密度相近, 分別在第5天和第6天達(dá)到細(xì)胞密度的峰值(均為 2.5×104cells/mL)。相對(duì)于以DOP為磷源的處理組, 添加KH2PO4處理組的細(xì)胞生長(zhǎng)較差, 第5天時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到最大值(2.4×104cells/mL)。

圖1 不同形態(tài)磷源對(duì)具槽帕拉藻生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of different phosphorus substrates on growth of P.sulcata

2.2 具槽帕拉藻的磷酸酶活性

不同形態(tài)磷源對(duì)具槽帕拉藻生長(zhǎng)過(guò)程中 AP和AcP活性的影響如圖2和圖3所示。在實(shí)驗(yàn)期間, 具槽帕拉藻的 AP活性總體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì);其中, 在以大分子 DOP為磷源的處理組中(LEC處理組), AP活性始終保持最高。以KH2PO4為磷源的處理組, AP活性在前2天迅速下降, 從第6天(0.55×10–5U/cell)開(kāi)始出現(xiàn)升高至實(shí)驗(yàn)結(jié)束(0.74×10–5U/cell)。在以β-G-P、G-6-P和ATP三種小分子DOP為磷源的處理組中, AP活性均呈現(xiàn)降低趨勢(shì), 分別在第 5天(0.20×10–5U/cell)、第 4 天(0.16×10–5U/cell)和第 5 天(0.24×10–5U/cell)時(shí)酶活性達(dá)到最低; 之后 AP酶活性有所上升, 且 ATP處理組的酶活性較 β-G-P、G-6-P處理組上升緩慢。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí), 在 3種小分子 DOP處理組中, AP活性由高到低的順序分別為 β-G-P>G-6-P>ATP。

圖2 不同形態(tài)磷源對(duì)具槽帕拉藻AP活性的影響Fig.2 Effects of different phosphorus substrates on AP activities of P. sulcata

圖3 不同形態(tài)磷源對(duì)具槽帕拉藻AcP活性的影響Fig.3 Effects of different phosphorus substrates on AcP activities of P. sulcata

AcP活性在前兩天呈上升趨勢(shì), 之后出現(xiàn)略微降低, 從第 4天開(kāi)始呈上升趨勢(shì)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí), ATP處理組的 AcP 活性最高(0.80×10–6U/cell), KH2PO4處理組最低(0.58×10–6U/cell), 其它三組的 AcP活性水平相當(dāng)(≈0.60×10–6U/cell)。

2.3 具槽帕拉藻胞內(nèi)TDP和培養(yǎng)液中磷濃度的變化

具槽帕拉藻胞內(nèi)TDP的變化如圖4所示。總體而言, 胞內(nèi)TDP在前2天呈現(xiàn)上升趨勢(shì), 各處理組的胞內(nèi)TDP均達(dá)到最高值; 其中, 以KH2PO4處理組的胞內(nèi) TDP 濃度最高(5.9×10–8μmol/cell)。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng), KH2PO4、β-G-P、LEC、G-6-P處理組的胞內(nèi)

TDP濃度相對(duì)平穩(wěn), 而ATP處理組則在第6天迅速下降。至第7天時(shí), 5種磷源處理組的胞內(nèi)TDP濃度由高到低的順序?yàn)镵H2PO4>β-G-P>LEC>G-6-P>ATP。

圖4 不同形態(tài)磷源對(duì)具槽帕拉藻胞內(nèi)TDP濃度的影響Fig.4 Effects of different phosphorus substrates on intercellular TDP of P. sulcata

在DOP處理組中, 培養(yǎng)液中的DOP濃度均迅速下降, 至第 2天已降至 0.20—0.30μmol/L; 而從第 3天至實(shí)驗(yàn)結(jié)束, DOP濃度變化幅度較小, 基本維持在平穩(wěn)狀態(tài)(圖5)。對(duì)DIP而言, KH2PO4處理組的DIP在實(shí)驗(yàn)前2天迅速下降, 然后趨于穩(wěn)定, 在第7天時(shí)DIP濃度為 0.91μmol/L; 而 DOP處理組培養(yǎng)液中的DIP在第2天達(dá)到峰值(0.80—1.20μmol/L), 隨后從第3天開(kāi)始逐步降低(圖6)。

3 討論

3.1 不同形態(tài)磷源對(duì)具槽帕拉藻生長(zhǎng)的影響

磷是浮游植物賴以生存和繁殖的必需營(yíng)養(yǎng)元素之一(Sa?udo-Wilhelmyet al, 2004; Xuet al, 2010; Leeet al, 2013), 是近海初級(jí)生產(chǎn)力的重要限制性因子(Dyhrmanet al, 2006a; Hyneset al, 2009)。通常認(rèn)為,DIP是浮游植物最重要的磷源; 但越來(lái)越多的證據(jù)表明, DOP也可作為浮游植物的重要磷源, 尤其是在DIP貧乏的海域(Cotneret al, 1992; Bonin, 1988)。

圖5 不同形態(tài)磷源對(duì)培養(yǎng)液中DOP濃度的影響Fig.5 Effects of different phosphorus substrates on DOP concentrations of the culture medium

圖6 不同形態(tài)磷源對(duì)培養(yǎng)液中DIP濃度的影響Fig.6 Effects of different phosphorus substrates on DIP concentrations of the culture medium

天然海水中含有分子量不同、種類繁多的 DOP化合物(Duursmaet al, 1981; 黃邦欽等, 1995)。研究表明, 不同浮游植物對(duì) DOP化合物的利用特征存在差異。例如, 東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)可有效利用 G-6-P、ATP、β-G-P(Huanget al, 2005; 李英等, 2005); 球形棕囊藻(Phaecocystis globosa)在以LEC作為磷源的培養(yǎng)基中能夠快速生長(zhǎng)(王艷等,2006); 束毛藻(TrichodesmiumIMS101)具有高效代謝G-6-P、單磷酸腺苷的能力(Sa?udo-Wilhelmy, 2006;Beversdorfet al, 2010)。此外, Wang 等(2011)研究發(fā)現(xiàn),海洋卡盾藻(Chattonella marina)可以有效利用多種核苷酸和β-G-P, 但其對(duì)磷酸三乙酯(Triethyl phosphate,TEP)和對(duì)硝基苯磷酸二乙酯(Nitrophenyl phosphate,NPP)的利用效率較低。

在本研究中, 具槽帕拉藻在5種不同形態(tài)磷源下均能正常生長(zhǎng), 表明具槽帕拉藻具有較為廣泛的磷源利用能力。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn), 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí) KH2PO4處理組培養(yǎng)液中的 TDP濃度最高, 即單位時(shí)間內(nèi)的磷消耗量最少, 并且藻細(xì)胞在 KH2PO4中的生長(zhǎng)速度也低于DOP處理組, 表明DOP比KH2PO4更有利于具槽帕拉藻的生長(zhǎng)。通過(guò)與中肋骨條藻(Skeletonema costatum)比較發(fā)現(xiàn), 在營(yíng)養(yǎng)條件充足的情況下, 具槽帕拉藻相對(duì)于中肋骨條藻其延遲期較短, 表明其能夠快速的適應(yīng)環(huán)境, 這些特性可能是具槽帕拉藻成為夏季和冬季黃渤海海域主要優(yōu)勢(shì)種的原因之一。

3.2 不同磷源對(duì)AP活性的影響

眾多研究證實(shí), AP在磷生物地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用(Dyhrmanet al, 1999; Labryet al, 2005)。Dyhrman等(2006b)在研究海岸系統(tǒng)中DOP的循環(huán)作用時(shí), 將AP活性作為DOP生物可利用性的衡量標(biāo)準(zhǔn)。大量研究表明, 在DIP缺失的環(huán)境中, 藻細(xì)胞能夠通過(guò)誘導(dǎo)合成 AP, 以分解水體中的DOP來(lái)維持細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖(Feuilladeet al, 1990;Huanget al, 2005; Baiet al, 2014)。

在實(shí)驗(yàn)起始階段, 饑餓處理導(dǎo)致各處理組均具有較高的AP活性; 隨著磷源的加入, 各處理組的AP活性均快速降低, 表明AP可以指示具槽帕拉藻受磷限制的狀況。在本研究中, 3種小分子 DOP處理組AP的活性變化規(guī)律與 KH2PO4處理組相似; 而在大分子 DOP(LEC)處理組中, 雖然 AP活性在實(shí)驗(yàn)初期有所下降, 但從第3天開(kāi)始變化不明顯, 且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期中始終保持較高活性。據(jù)此推測(cè), 小分子DOP可能較大分子DOP更易于被AP水解, 從而導(dǎo)致其吸收利用與無(wú)機(jī)磷酸鹽類似。此外, 具槽帕拉藻也存在直接吸收小分子DOP的可能性。洪華生等(1992)認(rèn)為,藻類對(duì) DOP的利用可能存在兩條途徑: 對(duì)于大分子DOP需要經(jīng)過(guò)磷酸酶水解后被吸收利用; 另一方面,小分子DOP也能夠被直接吸收利用。例如, Johannes(1964)研究發(fā)現(xiàn),Achnanthes subhyalina能夠直接吸收水生動(dòng)物分泌的DOP, 以及自身代謝產(chǎn)生的DOP。由于海水中的 DOP化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜, 不同種類浮游植物對(duì)DOP的利用方式仍需進(jìn)一步研究。

3.3 不同磷源對(duì)AcP活性的影響

近年來(lái), 胞內(nèi)磷酸鹽也被發(fā)現(xiàn)是影響浮游植物生長(zhǎng)的重要因子之一(Senft, 1978; Hoppe, 2003)。已有研究發(fā)現(xiàn), 某些浮游植物在外界磷酸鹽充足的條件下, 能夠在胞內(nèi)積累和儲(chǔ)存大量的磷酸鹽; 而當(dāng)胞外磷酸鹽缺失時(shí), 藻細(xì)胞可以利用胞內(nèi)儲(chǔ)存的磷酸鹽來(lái)維持細(xì)胞的快速生長(zhǎng)(Hernándezet al, 2002; Huanget al, 2005)。在本研究中, 實(shí)驗(yàn)初期培養(yǎng)液中的TDP濃度迅速下降, 并維持在較低水平, 而藻細(xì)胞內(nèi)的TDP含量在實(shí)驗(yàn)初期快速上升, 表明在胞外磷源充足的時(shí)候, 具槽帕拉藻能夠在胞內(nèi)儲(chǔ)存磷。

由圖3可見(jiàn), 藻細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)起始階段具有較低的AcP活性, 可能是由于饑餓處理導(dǎo)致胞內(nèi)儲(chǔ)存的磷被消耗殆盡, 進(jìn)而限制了藻細(xì)胞生長(zhǎng)并導(dǎo)致 AcP活性的降低。在添加營(yíng)養(yǎng)鹽后, 隨著藻細(xì)胞對(duì)磷元素的吸收, AcP活性又表現(xiàn)出上升趨勢(shì)。結(jié)合藻細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(圖1)分析, 發(fā)現(xiàn)在3—5天胞外TDP濃度處于低水平時(shí), 具槽帕拉藻并未立刻停止生長(zhǎng); 此時(shí)胞內(nèi) AcP活性有升高趨勢(shì)而胞內(nèi) TDP呈下降趨, 表明在外界TDP濃度較低時(shí), 具槽帕拉藻通過(guò) AcP動(dòng)員胞內(nèi)儲(chǔ)存的磷源以維持藻細(xì)胞生長(zhǎng)。

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