李 維，向 芬，李賽君，劉紅艷，包小村

（湖南省茶葉研究所，湖南 長沙 410125）

氮素是世界農業(yè)生產中消耗量最大的元素之一[1]，氮的消耗量日益增加，但利用效率逐漸下降。從國內外的示蹤實驗結果看，茶樹的氮肥利用率只有 10%～50%[2]。大量氮素因揮發(fā)、流失浪費，引起一系列的環(huán)境污染問題[3]。隨著人口數量的激增，能源危機、環(huán)境污染等問題成為人們關注的焦點，如何提高作物氮素效率成為當前植物營養(yǎng)學的研究熱點。

土壤中存在多種形態(tài)的氮源，長期的生物進化和環(huán)境適應導致植物根系對不同形態(tài)氮的吸收部位、機理及調控有較大差別。因此，植物長期生長在以某一形態(tài)氮源為主的土壤上就形成了不同的氮吸收機制，從而導致不同種類植物根系對土壤中不同氮源的吸收具有明顯的選擇性。在以或為主要氮源的土壤中，植物表現出明顯的喜或喜特性，而在氮礦化和硝化受到抑制的地區(qū)（如高緯度地區(qū)），植物也可以直接吸收利用土壤中的有機氮[4]。以茶樹為例，不同地域的茶樹長期以來受到其生態(tài)環(huán)境、地域土壤以及人為馴化等方面的影響，各茶樹品種對不同形態(tài)氮的喜好程度，以及同形態(tài)氮素的利用效率之間均存在著顯著差異[5-7]。

植物氮利用率主要取決于銨轉運、同化效率的高低，因此，研究茶樹氮素利用效率應從其氮轉運入手，開展茶樹的氮轉運、同化機理研究，從作物生理學與植物分子生物學方面解析茶樹對的轉運與同化機制，提高茶樹對氮肥的利用效率，對實現茶葉高產高效、減輕環(huán)境污染和促進茶產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。文中對茶樹以及其他植物的轉運、同化方面的研究以及先進生物技術手段在茶樹上的應用進行了綜述并提出了展望，為提高茶樹氮素利用提供有效的理論參考。

茶樹作為一種喜銨性作物[2]，與其他植物有所不同，它是以葉片為收獲目標，不僅要歷經春茶、夏茶、秋茶3 次茶葉采摘，還需要進行采茶期末的樹冠修剪，帶走大量氮素，茶樹本身不能固氮，因此，茶樹對外界氮素的需求量極大。茶樹體內游離氨基酸以茶氨酸為主，并將其作為一種中間氮源在根部合成并貯存，當地上部分生長需要氮素營養(yǎng)時，氮素可以茶氨酸和酰胺的形式通過木質部向上運輸。因此，茶樹在的轉運方面也必然與其他植物存在差異。王新超[1]、阮建云[8]等的研究表明，茶樹氮素的利用效率與吸收速率均存在品種間和氮素水平間的顯著差異，而其根系對氮的吸收效率是決定不同品種茶樹氮素利用效率差異的主要因素。其研究還表明，茶樹對銨態(tài)氮的吸收與同化速率呈極顯著正相關。向芬[6]等對游離氨基酸總量不同的保靖黃金茶1 號、福鼎大白茶、白毫早3個品種在不同梯度銨處理下根系活力的表現情況進行了研究，結果亦表明，茶樹品種間、相同品種不同銨濃度處理間茶樹根系活力均存在顯著差異，且與其游離氨基酸總量呈正相關，這進一步證明了銨態(tài)氮的同化速率與轉運速率密切相關。

茶樹GS 酶活研究方面，王新超等[1]比較了不同基因型茶樹的GS 酶活性，杜旭華等[25]結合農作物上提取GS 并測定的方法，針對茶樹進行了不同pH 緩沖液等提取方法對GS 酶活的影響研究，并得出不同基因型茶樹的GS 酶活差異顯著。由此可知，不同基因型茶樹GS 合成酶基因（CsGS）必然有其特異性。目前茶樹中部分CsGS 編碼基因[26-29]已被克隆。Rana N K 等[30]對茶樹不同部位的組織、器官中GS 酶活與CsGS 表達特征進行了研究，結果表明CsGS 在芽頭中表達量最高，且隨著葉位和葉齡的增加其表達量逐漸下降，GS 酶活也表現出同樣的趨勢。此外，Rana N K 等[31]的研究還表明芽頭和嫩葉中CsGS 表達受氮素形態(tài)的影響。暗處理時，CsGS 表達只受到銨態(tài)氮的影響，硝態(tài)氮對其無影響，且銨態(tài)氮能增加GS 酶活，但硝態(tài)氮對GS 酶活有抑制作用；光處理下，兩種氮源對茶樹GS 酶活性均有促進作用。這表明外源銨對茶樹CsGS 表達調控作用的重要性。史成穎等[32]研究了鹽酸乙胺誘導處理茶樹愈傷組織后3～12 d，GS1;1等茶氨酸合成酶相關基因表達量明顯增加，表明其在含氮化合物特別是乙胺的同化中有積極作用，這也間接表明作為乙胺前體物質之一——外源NH4+的含量會對GS1;1 等基因表達產生一定影響[33]。這表明茶樹銨轉運效率的差異必然會影響到CsGS 等銨同化基因的表達。周小生等[34]對5個品種茶樹的GS、GOGAT 和 GDH 活性進行測定，并對其關聯(lián)基因CsGS 和CsGDH2 表達量進行了研究，其結果表明不同施氮水平能顯著影響茶樹葉片中同化關鍵酶活性以及相關基因表達水平，從更深層次闡述了不同基因型茶樹氮素吸收及利用效率的差異特點。

3 轉錄組測序技術為茶樹銨轉運、同化研究提供新的方法

基于高通量測序平臺的轉錄組測序技術（RNAseq），具有通量高、覆蓋范圍廣、精度高等特點，能夠在單核苷酸水平對任意物種的整體轉錄活動進行檢測，也可以用于分析真核生物復雜的轉錄本的結構及表達水平，提供最全面的轉錄組信息[35]。另外，RNA-Seq 的靈敏度高，在分析轉錄本的結構和表達水平的同時，還能發(fā)現未知和稀有轉錄本。轉錄組學的研究從擬南芥、水稻等模式植物到紫花苜蓿、番茄等非模式植物鑒定了大量的逆境脅迫、元素處理等等的應答基因，并對作物相應的作用機理進行了探討，加深了人們對作物體內分子響應機制的認識[36]。因此，通過RNA-seq，不僅可以提供大量候選功能基因，也是一個經濟快速地得到大量作物轉錄組信息的新方法，而能否發(fā)現新的功能基因成為衡量以測序技術為代表的轉錄組學的關鍵價值所在。

茶樹轉錄組學方面，史成穎等[32]通過基于新一代Ilumina 測序平臺的深度轉錄組測序技術，得到了127 094個茶樹的unigene，通過與Uniprot、NCBI 的NR、COG 數據庫、Pfam、KEGG 等數據庫進行序列比對，注釋了55 088個unigene 的功能，并從中選擇了11個可能與茶氨酸代謝相關的基因進行qRT-PCR來定量分析它們在茶氨酸含量差異明顯的茶愈傷組織中表達量的差異。王麗鴛等[37]通過應用新一代高通量測序技術對茶樹花進行轉錄組測序，通過基因表達水平RPKM 值分布分析，發(fā)現茶樹花的轉錄組以中低表達豐度的基因為主。經過和蛋白數據庫NR、Sw issprot、KEGG 和COG 4個數據庫比對，共有50 975 條茶樹花轉錄組的unigene 被注釋。這些均表明轉錄組學越來越受到茶葉科技人員的重視。關于茶樹銨轉運、同化吸收的研究較少，其機理還不太清楚，與其他作物相比，眾多銨轉運、同化關鍵基因亟待發(fā)掘。通過RNA-seq 獲取大量茶樹轉錄組信息，可以為深入研究茶樹的轉運、同化機理提供新的技術手段。

4 展 望

[1]王新超，楊亞軍，陳 亮，等. 茶樹氮素利用效率相關生理生化指標初探[J]. 作物學報， 2005，（7）：926-931.

[2]楊亞軍. 中國茶樹栽培學[M]. 上海：上?？茖W技術出版社，2005.[3]李寶珍，范曉榮，徐國華. 植物吸收利用銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的分子調控[J]. 植物生理學通訊，2009，（1）：80-88.

[4]霍常富，孫海龍，范志強，等. 根系氮吸收過程及其主要調節(jié)因子[J]. 應用生態(tài)學報， 2007，（6）：1356-1364.

[5]王新超，楊亞軍，陳 亮，等. 不同品種茶樹氮素效率差異研究[J]. 茶葉科學， 2004，（2）： 93-98.

[6]向 芬，劉紅艷，付海平，等. 不同組合時間施氮對茶樹生長及茶葉品質的影響[J]. 茶葉通訊，2014，（4）：23-26.

[7]杜旭華，彭方仁. 無機氮素形態(tài)對茶樹氮素吸收動力學特性及個體生長的影響[J]. 作物學報，2010，（2 ）：327-334.

[8]阮建云，王曉萍，崔思真，等. 茶樹品種間氮素營養(yǎng)的差異及其機制的研究[J]. 中國茶葉，1993，（3）：35-37.

[9]Glass A D，Britto D T，Kaiser B N，et al. The regulation of nitrate and ammonium transport systems in plants[J]. Journal of Experimental Botany， 2002， 53（370）： 855-864.

[10]駱媛媛，柳參奎. 植物中銨轉運蛋白的研究進展[J]. 基因組學與應用生物學，2009，28（2）：373-379.

[11]Ninnemann O，Jauniaux J，Frommer W. Identification of a high affinity NH4+transporter from plants[J]. The EMBO journal，1994，13（15）：3464.

[12]鄧若磊，谷俊濤，路文靜，等. 水稻銨轉運蛋白基因 OsAMT1; 4 和 OsAMT5 的特征分析，功能和表達[J]. 中國農業(yè)科學，2007，40（11）：2395-2402.

[13]Jahn T P，M?ller A L，Zeuthen T，et al. Aquaporin homologues in plants and mammals transport ammonia[J]. FEBS letters，2004，574（1）：31-36.

[14]Gazzarrini S，Lejay L，Gojon A，et al. Three functional transporters for constitutive， diurnally regulated， and starvation-induced uptake of ammonium into Arabidopsis roots[J]. The Plant Cell Online，1999，11（5）：937-947.

[15]Loqué D，Yuan L，Kojima S，et al. Additive contribution of AMT1; 1 and AMT1; 3 to high‐affinity ammonium uptake across the plasma membrane of nitrogen‐deficient A rabidopsis roots[J]. The Plant Journal，2006，48（4）：522-534.

[16]Engineer C B，K ranz R G. Reciprocal leaf and root expression of A tAm t1. 1 and root architectural changes in response to nitrogen starvation[J]. Plant physiology，2007，143（1）： 236-250.

[17]Yang S Y，Hao D L，Cong Y，et al. The rice OsAMT1;1 is a protonindependent feedback regulated ammonium transporter[J]. Plant Cell Reports，2015，34（2）：321-330.

[18]Ma C L，Chen L. Research progress on isolation and cloning of functional genes in tea plants[J]. Frontiers of Agriculture in China，2007，1（4）：449-455.

[19]Taniguchi F，Tanaka J. Camellia sinensis CsAMT1;1 mRNA for putative ammonium transporter，complete cds. http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB117640.1， 2003.

[20]蔡紅梅，肖景華，張啟發(fā)，等. 抑制表達谷氨酰胺合成酶基因對水稻氮代謝和生長發(fā)育的影響[J]. 科學通報，2010，（10）：875-886.

[21]Tabuchi M，Sugiyama K，Ishiyama K，et al. Severe reduction in grow th rate and grain filling of rice mutants lacking OsGS1; 1，a cytosolic glutamine synthetase1; 1[J]. The Plant Journal， 2005，42（5）：641-651.

[22]Martin A，Lee J，Kichey T，et al. Two cytosolic glutamine synthetase isoforms of maize are specifically involved in the control of grain production[J]. The Plant Cell Online，2006，18（11）：3252-3274.

[23]Ochs G，Schock G，Trischler M，et al. Complexity and expression of the glutam ine synthetase multigene family in the amphidiploid crop Brassica napus[J]. Plant Molecular Biology， 1999，39（3）：395-405.

[24]Tobin A K，Yamaya T. Cellular compartmentation of ammonium assim ilation in rice and barley[J]. Journal of Experimental Botany，2001，52（356）：591-604.

[25]杜旭華，周賢軍，彭方仁. 茶樹不同器官氨同化關鍵酶活性測定及比較[J]. 經濟林研究， 2008，（2）： 23-28.

[26]Rana N K，Mohanpuria P，Yadav S K. Cloning and characterization of a cytosolic glutam ine synthetase from Camellia sinensis （L.） O. Kuntze that is upregulated by ABA，SA，and H2O2[J]. Molecular biotechnology，2008，39（1）：49-56.

[27]Tanaka J，Taniguchi F. Camellia sinensis CsGS1;1 mRNA for glutamine synthetase， complete cds[EB/OL]. http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB115183.1，2003.

[28]Tanaka J，Taniguchi F. Camellia sinensis CsGS1;2 mRNA for glutamine synthetase， complete cds. http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB115184.1，2003.

[29]Tanaka J，Taniguchi F. Camellia sinensis CsGS1;3 mRNA for glutamine synthetase， complete cds[EB/OL]. http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB117934.1，2003.

[30]Rana N，M ohanpuria P，Yadav S. Expression of tea cytosolic glutamine synthetase is tissue specific and induced by cadmium and salt stress[J]. Biologia Plantarum，2008，52（2）： 361-364.

[31]Rana N K，Mohanpuria P，Kumar V，et al. A CsGS is regulated at transcriptional level during developmental stages and nitrogen utilization in Camellia sinensis（L.）O. Kuntze[J]. Molecular biology reports，2010，37（2）：703-710.

[32]史成穎. 茶樹幼根EST 文庫構建及茶氨酸代謝相關基因表達分析[D]. 合肥：安徽農業(yè)大學，2011.

[33]宛曉春. 茶葉生物化學[M]. 北京：中國農業(yè)出版社，2006.

[34]周小生. 茶樹氮素營養(yǎng)的快速診斷及其相關的生理生化指標的研究[D]. 合肥：安徽農業(yè)大學，2012.

[35]基因測序和芯片解決方案[EB/OL]. http ：//www.illumina.com.cn. 2015.

[36]付 暢，黃 宇. 轉錄組學平臺技術及其在植物抗逆分子生物學中的應用[J]. 生物技術通報，2011，（6）：40-46.

[37]王麗鴛. 基于est 數據庫和轉錄組測序的茶樹DNA 分子標記開發(fā)與應用研究[D]. 北京： 中國農業(yè)科學院，2011.