李亞楠，趙兵令，馬淑慧，赫曉燕，范瑞文，王海東，耿建軍，董常生*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030801；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

內(nèi)皮素3在不同毛色綿羊皮膚的表達(dá)與定位

李亞楠1，趙兵令1，馬淑慧2，赫曉燕1，范瑞文1，王海東1，耿建軍1，董常生1*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030801；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

旨在探索內(nèi)皮素3(Endothelin 3，EDN3)在不同毛色綿羊皮膚的表達(dá)差異以及對(duì)毛色的影響。以不同毛色綿羊?yàn)檠芯繉?duì)象，通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)分析EDN3基因在不同毛色綿羊皮膚的表達(dá)量，通過(guò)免疫組織化學(xué)和ELISA方法對(duì)EDN3蛋白在不同毛色綿羊皮膚中的定位和表達(dá)進(jìn)行研究。1)qRT-PCR結(jié)果顯示，EDN3 在白色綿羊皮膚的相對(duì)表達(dá)量為5.540 6±0.030 7，在黑色綿羊皮膚的相對(duì)表達(dá)量為1.005 8±0.062 0。黑白花色綿羊的白色區(qū)和黑色區(qū)的相對(duì)表達(dá)量分別為4.341 9±0.087 7和1.150 1±0.005 3。2)ELISA結(jié)果顯示，EDN3在白色綿羊皮膚中的表達(dá)量為128.424 7±2.223 4，在黑色綿羊皮膚的相對(duì)表達(dá)量為25.114 4±3.248 3。在黑白花色綿羊白色皮膚中的表達(dá)量為93.945 3±7.562 2，黑色皮膚的表達(dá)量為28.606 0±9.295 9。3)免疫組織化學(xué)顯示，EDN3在綿羊皮膚毛囊的毛基質(zhì)、內(nèi)外毛根鞘、毛乳頭等區(qū)域均有表達(dá)。綜上表明，EDN3在不同毛色綿羊皮膚中均可正常表達(dá)，且表達(dá)量存在顯著差異。EDN3是維持黑色素細(xì)胞存在不可缺少的基因，但不影響綿羊黑白花的形成。

內(nèi)皮素3；綿羊；免疫組織化學(xué)

哺乳動(dòng)物被毛的生長(zhǎng)是極其復(fù)雜的生理過(guò)程，其中毛色的形成更是受到遺傳、環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)和代謝水平等多種因素的影響[1]，且遺傳基因的調(diào)控是其決定性的因素。在動(dòng)物毛色形成過(guò)程中所涉及的調(diào)控基因多達(dá)上百個(gè)[2]，例如MC1R、MITF、TRP1、TRP2、EDN3等。內(nèi)皮素(Endothelin，EDN)由內(nèi)皮細(xì)胞合成，有3種形態(tài)的異構(gòu)體(EDN1，EDN2，EDN3)，均由21個(gè)氨基酸組成[3]，是一類具有強(qiáng)大的促分化和促有絲分裂的生長(zhǎng)因子，廣泛作用于包括皮膚在內(nèi)的大部分組織。目前已知的內(nèi)皮素受體有A和B兩種亞型，均屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族。兩種受體分布的位置不盡相同，對(duì)內(nèi)皮素的親和力也存在差異，EDN3是近來(lái)研究較多的一種活性肽，對(duì)黑色素細(xì)胞的生存、發(fā)育以及色素的沉積有著不可或缺的作用。EDN3主要是通過(guò)與內(nèi)皮縮血管肽B型受體(EDNRB)結(jié)合，對(duì)于由神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育而來(lái)的黑色素細(xì)胞的成熟及分化發(fā)揮至關(guān)重要的作用[4]，是其有效的促進(jìn)因子。已有研究表明，EDN3對(duì)小鼠的黑色素細(xì)胞色素沉積有明顯作用，因而進(jìn)一步明確EDN3對(duì)不同毛色皮膚的黑色素沉積的影響作用可以對(duì)毛色的相關(guān)研究提供新的研究依據(jù)。目前有研究表明，內(nèi)源性的EDN3在胚胎形成的早期誘導(dǎo)神經(jīng)嵴細(xì)胞的正常遷移和分化[5-7]，隨著胚胎的發(fā)育，EDN3對(duì)真皮黑色素細(xì)胞的正常維持也是必不可少的[8]；同時(shí)還可在后期的發(fā)育中代償性的補(bǔ)充Kit的作用[9]，對(duì)早期色素的形成有至關(guān)重要的作用。而外源性的EDN3不僅對(duì)黑色素細(xì)胞前體的分化有明顯的促進(jìn)作用，還能影響已分化的黑色素細(xì)胞的分裂增殖，最終可產(chǎn)生一種類似于人類黑色素細(xì)胞增多癥的表型。在以角化驅(qū)動(dòng)的小鼠為模型的研究中，EDN3可誘導(dǎo)成年小鼠皮膚真皮層出現(xiàn)色素沉著[8]。前期的試驗(yàn)大多以黑色素細(xì)胞為主要研究對(duì)象闡述EDN3對(duì)其產(chǎn)生的影響，對(duì)于EDN3與色素形成的關(guān)系研究較少，且對(duì)于EDN3是否會(huì)影響綿羊黑白花的形成少有提及，其與純色綿羊是否存在差異？本研究主要通過(guò)對(duì)不同毛色的綿羊皮膚中的EDN3進(jìn)行檢測(cè)，以探究EDN3對(duì)綿羊毛色的影響及其與綿羊黑白花形成的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑

RNA提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒( TaKaRa 公司)，QuantiFast SYBR Green PCR Kit( QIAGEN 公司)，綿羊內(nèi)皮素3 ELISA 試劑盒(上海西塘生物科技公司進(jìn)口)，DAB顯色試劑盒(康為世紀(jì)公司)，EDN3抗體(博奧森公司)，Streptavidin-HRP試劑盒(康為世紀(jì)公司)。

1.2 材料

隨機(jī)挑取1歲左右小尾寒羊全白、全黑、花黑綿羊各3只(由渾源羊場(chǎng)提供)，背部皮膚凈毛后，用取皮器取約1 cm的皮膚組織3塊，其中2塊快速置于液氮保存，用于提取總RNA及總蛋白，1塊置于Bouin’s液中固定，制作石蠟切片，用于免疫組化染色。

1.3 方法

1.3.1 RNA提取和cDNA合成 從液氮中取出皮膚于液氮中研磨成粉末，Trizol 法提取綿羊皮膚總 RNA，并電泳檢測(cè)其完整性。按照 TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行 cDNA 合成。反轉(zhuǎn)錄體系：oligdT Primer 1 μL，dNTP Mix 1 μL，總 RNA 濃度<5 μg，加水至 10 μL。體系混勻后置于 PCR 儀中，按條件65 ℃ 5 min，冰上2 min進(jìn)行反應(yīng)；取上述產(chǎn)物10 μL，5×Primer script buffer 4 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，Primer script II RTase 1 μL，加水至20 μL?；靹蚝?，置于 PCR 儀中按 45 ℃ 40 min，70 ℃ 15 min進(jìn)行反應(yīng)，-20 ℃保存 cDNA備用。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng) 根據(jù)GenBank 上綿羊的EDN3 序列并利用 Premier5.0 引物設(shè)計(jì)熒光定量 PCR 擴(kuò)增引物，并通過(guò) NCBI 初步檢測(cè)引物的特異性，引物由北京華大基因公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

PCR反應(yīng)體系(25 μL)：2×Taq Master Mix 12.5 μL，特異性上下游引物各1 μL，cDNA≤1 μg，加無(wú)菌水補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min.，利用未加模板(以滅菌蒸餾水代替)的反應(yīng)液作為陰性對(duì)照，以檢查是否存在污染。用 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PCR 產(chǎn)物，200 V 電泳15 min 后使用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。PCR產(chǎn)物純化后送北京華大基因生物公司雙向測(cè)序。

表1 目的基因引物序列及PCR產(chǎn)物

Table 1 Sequence of primer and condition of PCR amplification

基因Gene引物序列(5′→3′)PrimersequencePCR產(chǎn)物/bpProductsizeEDN3F：GAGCAGGGACCAAGTCAGTT，R：ATAGGGCACAGTCCGTTCAG16218SF：GAAGGGCACCACCAGGAGT，R：CAGACAAATCACTCCACCAA158

1.3.3 qRT-PCR 擴(kuò)增 熒光定量 PCR 根據(jù) QIAGEN 試劑盒進(jìn)行，反應(yīng)體系(10 μL)：2×QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix 5 μL，上下游引物各1 μL，模版≤100 ng，加水至10 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40～45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束通過(guò)2-△△CT法計(jì)算EDN3在不同毛色綿羊皮膚中的相對(duì)表達(dá)水平。△CT目的基因=CT目的基因-CT內(nèi)參基因，△△CT = △CT白色綿羊組-△CT黑色綿羊組，EDN3 mRNA表達(dá)差別倍數(shù)以2-△△CT表示。

1.3.4 ELISA 蛋白含量測(cè)定 取液氮凍存的綿羊皮膚組織，用總蛋白提取試劑盒提取總蛋白。根據(jù)ELISA試劑盒對(duì)皮膚組織中EDN3的濃度進(jìn)行測(cè)定。將蛋白樣品加入包被過(guò)綿羊EDN3單抗的酶標(biāo)板上，并于37 ℃孵育40 min，反應(yīng)完成后，甩去多余的液體，并用洗滌液充分清洗30 s×5次；每孔加入蒸餾水和一抗工作液各50 μL(空白除外)，混勻，37 ℃放置20 min；反應(yīng)完成后甩去多余的液體并用洗滌液充分清洗30 s×5次；每孔加入酶標(biāo)抗體工作液100 μL，混勻放置37 ℃ 10 min；反應(yīng)完成后，甩去多余的液體，并用洗滌液充分清洗30 s×5次；每孔加入底物工作液100 μL，置于37 ℃暗處反應(yīng)15 min；每孔加入終止液100 μL混勻，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)吸光值。

1.3.5 免疫組織化學(xué) 石蠟切片脫蠟，滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶封閉液；置37 ℃烘箱10 min，去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS 緩沖液搖洗切片5 min×3 次；滴加適量正常羊血清封閉，37 ℃溫箱孵育10 min，甩去多余液體，并滴加 1∶100 兔抗EDN3多克隆抗體，陰性對(duì)照滴加PBS緩沖液代替；4 ℃過(guò)夜；次日室溫放置30 min，PBS緩沖液沖洗5 min×3 次；滴加生物素標(biāo)記羊抗兔二抗工作液，放入37 ℃溫箱反應(yīng)10 min，用 PBS緩沖液沖洗5 min×3次；滴加HRP標(biāo)記的鏈霉親和素，放入37 ℃溫箱反應(yīng)10 min，用PBS 緩沖液沖洗5 min×3次；滴加DAB顯色10 min，PBS 緩沖液沖洗3 min×3次，蘇木素輕度復(fù)染、脫水、透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。

1.3.6 免疫組織化學(xué)圖像數(shù)據(jù)分析 用DP軟件在每張毛囊組織切片上，采集5～8個(gè)視野，應(yīng)用Image-pro plus 6.0軟件(美國(guó)MediaCybernetics公司) 對(duì)不同毛色綿羊皮膚EDN3免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行分析，測(cè)得陽(yáng)性細(xì)胞的IOD(Integral optical density)值，單因素方差分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)”表示。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)

1%凝膠電泳結(jié)果顯示，EDN3條帶清晰，無(wú)非特異性條帶。條帶大小為162 bp左右(圖1)。切膠后送華大基因測(cè)序，結(jié)果比對(duì)后正確，說(shuō)明EDN3可在綿羊體內(nèi)正常表達(dá)。

M.DL2000 DNA marker;1.全黑綿羊皮膚EDN3 PCR產(chǎn)物;2.花黑綿羊皮膚EDN3 PCR產(chǎn)物;3.全白綿羊皮膚EDN3 PCR產(chǎn)物;4.花白綿羊皮膚EDN3 PCR產(chǎn)物M.DL2000 DNA marker;1.EDN3 PCR product of black sheep skin；2.EDN3 PCR product of flower black sheep skin；3.EDN3 PCR product of white sheep skin；4.EDN3 PCR product of flower white sheep skin圖1 EDN3 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis pattern of EDN3 PCR product

2.2 qRT-PCR的擴(kuò)增

qRT-PCR結(jié)果顯示，目的基因與內(nèi)參基因的熔解曲線僅有一個(gè)明顯的峰，擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值均一，目的基因及內(nèi)參基因沒(méi)有產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增及引物二聚體(圖2A、B)；且EDN3熒光定量的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線為“S”型，曲線平行性良好，無(wú)明顯偏差，起峰點(diǎn)清晰，符合標(biāo)準(zhǔn)曲線要求(圖2C)。qRT-PCR 結(jié)果顯示，EDN3 在全白色綿羊皮膚中 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量為5.540 6±0.030 7；而在黑白花綿羊的白色皮膚中EDN3 的 mRNA 相對(duì)表達(dá)量為4.341 9±0.087 7，黑白花綿羊的黑色皮膚中mRNA的相對(duì)表達(dá)量為1.150 1±0.005 3；在全黑色綿羊皮膚的相對(duì)表達(dá)量為1.005 8±0.062 0。全白綿羊皮膚中EDN3的表達(dá)量是黑白花綿羊黑色皮膚的4.8倍，是全黑綿羊皮膚表達(dá)量的5.5倍；黑白花綿羊白色皮膚EDN3的表達(dá)量是黑白花綿羊黑色皮膚的3.8倍，是全黑綿羊皮膚的4.3倍。白色綿羊皮膚與黑色綿羊皮膚的EDN3 mRNA水平的表達(dá)差異極顯著(P<0.01)(圖2D)。

**.P<0.01。下同。A.EDN3的熔解曲線；B.18S的熔解曲線；C.EDN3和18S的擴(kuò)增曲線；D.不同綿羊皮膚EDN3的qRT-PCR分析結(jié)果**.P<0.01.The same as below.A.qRT-PCR melt curve for EDN3；B.qRT-PCR melt curve for 18S；C.qRT-PCR amplification plots for EDN3 and 18S；D.qRT-PCR analysis of EDN3 in different colors of sheep skin圖2 EDN3 mRNA表達(dá)的qRT-PCR分析Fig.2 qRT-PCR analysis of the expression of EDN3 mRNA

2.3 ELISA試驗(yàn)

經(jīng)酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)得OD值，使用CurveExpert 1.4軟件分析制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)，獲得樣品中EDN3蛋白的相對(duì)表達(dá)量。EDN3在全白色綿羊皮膚中蛋白的相對(duì)表達(dá)量為128.424 7±2.223 4；而在黑白花綿羊的白色皮膚中EDN3蛋白相對(duì)表達(dá)量為93.945 3±7.562 2，黑白花綿羊的黑色皮膚中蛋白的相對(duì)表達(dá)量為28.606 0±9.295 9；在全黑色綿羊皮膚的相對(duì)表達(dá)量為25.114 4±3.248 3。全白綿羊皮膚中EDN3蛋白表達(dá)量是黑白花綿羊黑色皮膚的4.5倍，是全黑綿羊皮膚表達(dá)量的5.1倍；黑白花綿羊白色皮膚EDN3蛋白表達(dá)量是黑色皮膚的3.3倍，是全黑綿羊皮膚的3.7倍。白色綿羊皮膚與黑色綿羊皮膚EDN3蛋白水平表達(dá)差異極顯著(P<0.01)。

2.4 免疫組織化學(xué)分析

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示(圖4)，綿羊黑色皮膚和白色皮膚中均有EDN3棕黃色的陽(yáng)性表達(dá)，且其主要表達(dá)部位為毛基質(zhì)、內(nèi)外毛根鞘等處，著色深淺不一。另黑色綿羊毛囊的毛乳頭區(qū)有少量表達(dá)，白色皮膚則比黑色的表達(dá)更少，幾乎不可見(jiàn)。通過(guò)光密度分析比較EDN3在不同毛色綿羊皮膚的表達(dá)水平，陽(yáng)性試驗(yàn)組結(jié)果表明(圖5)，白色皮膚EDN3的表達(dá)量高于黑色皮膚且差異極顯著(P<0.01)，花黑EDN3表達(dá)量高于全黑，差異顯著(P<0.05)，該結(jié)果與ELISA試驗(yàn)結(jié)果相一致。

A.EDN3的標(biāo)準(zhǔn)曲線；B.EDN3蛋白表達(dá)量的ELISA分析A.The standard curve of EDN3；B.ELISA analysis of EDN3 in different colors of sheep skin圖3 不同毛色綿羊皮膚中EDN3蛋白的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expression of EDN3 in different hair color sheep skin

A.白色綿羊皮膚EDN3陽(yáng)性組；a.白色綿羊皮膚EDN3陰性對(duì)照組；B.花白綿羊皮膚EDN3陽(yáng)性組；b.花白綿羊皮膚EDN3陰性對(duì)照組；C.花黑綿羊皮膚EDN3陽(yáng)性組；c.花黑綿羊皮膚EDN3陰性對(duì)照組；D.黑色綿羊皮膚EDN3陽(yáng)性組；d.黑色綿羊皮膚EDN3陰性對(duì)照組。1.毛基質(zhì)；2.內(nèi)毛根鞘；3.外毛根鞘；4.毛乳頭A.White sheep skin EDN3 positive group；a.White sheep skin EDN3 negative control group;B.Flower white sheep skin EDN3 positive group；b.Flower white sheep skin EDN3 negative control group;C.Flower black sheep skin EDN3 positive group；c.Flower black sheep skin EDN3 negative control group；D.Black sheep skin EDN3 positive group；d.Black sheep skin EDN3 negative control group.1.Hair follicle matrix；2.Inside root sheath；3.Outside root sheath；4.Dermal papilla圖4 EDN3在不同毛色綿羊毛囊的免疫定位200×Fig.4 Immunohistochemistry results of EDN3 in different hair color sheep skin 200×

3 討 論

*.P<0.05圖5 EDN3在不同毛色綿羊皮膚組織中的平均光密度分析Fig.5 Average optical density analysis of EDN3 in different hair color sheep skin

哺乳動(dòng)物毛色的形成取決于成熟黑素細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量、分布部位以及其合成的黑色素的含量、種類、分布和運(yùn)輸途徑等因素。黑色素細(xì)胞來(lái)源于神經(jīng)嵴細(xì)胞[10]，在黑色素小體中合成黑色素，并由其決定哺乳動(dòng)物皮膚、毛發(fā)及眼睛的最終表型[11]。內(nèi)皮素(Endothelin，EDN)由內(nèi)皮細(xì)胞合成，有3種形態(tài)的異構(gòu)體(EDN1，EDN2，EDN3)。EDN通過(guò)與G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合激活磷脂酶C(PLC)，誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加進(jìn)而參與各種生理過(guò)程[12]，主要包括血管收縮和細(xì)胞增殖[13]。已有研究表明，EDN3在鳥(niǎo)類神經(jīng)嵴細(xì)胞的培養(yǎng)中可以通過(guò)與EDNRB結(jié)合促進(jìn)神經(jīng)嵴細(xì)胞的增殖和黑色素細(xì)胞的分化[14]。在黑色素通路中，EDN3與KIT共同參與黑色細(xì)胞的存活、增殖和分化等，而同時(shí)阻斷EDNRB和KIT信號(hào)則會(huì)導(dǎo)致黑色素前體細(xì)胞完全消失，任一通路的存在均可維持黑色素前體細(xì)胞的存在[9]。A.G.Baynash等[15]通過(guò)細(xì)胞試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EDN3及其受體在神經(jīng)嵴細(xì)胞和黑色素細(xì)胞的增殖和分化中起重要的作用，并推測(cè)人類EDN3缺失可能會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)性巨結(jié)腸病癥。另有報(bào)道稱KIT受體酪氨酸激酶W位點(diǎn)的突變不影響黑色素細(xì)胞的遷移和分化，但是嚴(yán)重影響黑色素細(xì)胞的存在[16]。體外研究表明，黑色素前體細(xì)胞的增殖和分化對(duì)EDN3活性肽存在一定的劑量依賴[17-19]。本試驗(yàn)蛋白定位和定量結(jié)果顯示，EDN3在不同毛色皮膚毛囊內(nèi)均有表達(dá)，但是白色皮膚表達(dá)量明顯多于黑色。不同毛色皮膚定位圖所顯示的陽(yáng)性反應(yīng)區(qū)也存在一些差異，白色與花白色皮膚定位顯示陽(yáng)性反應(yīng)的區(qū)域均勻分布于內(nèi)外毛根鞘和毛基質(zhì)等處，而在毛乳頭區(qū)僅有少量存在。黑色與花黑色皮膚則顯示EDN3陽(yáng)性反應(yīng)在毛基質(zhì)等黑色素細(xì)胞活躍的區(qū)域大量存在，毛乳頭區(qū)的陽(yáng)性反應(yīng)也有明顯的增多。試驗(yàn)結(jié)果提示，EDN3對(duì)黑色與花黑色綿羊皮膚內(nèi)的黑色素細(xì)胞有一定的促進(jìn)作用，活化細(xì)胞增加色素的合成。EDN3對(duì)白色及花白色綿羊皮膚毛囊內(nèi)的黑色素細(xì)胞有維持作用，即EDN3對(duì)黑色素細(xì)胞的生存是必不可少的，白色綿羊皮膚需要EDN3較高的表達(dá)量以維持色素細(xì)胞的存在。楊?yuàn)檴櫟萚20]認(rèn)為EDN3可能與綿羊毛色形成具有相關(guān)性，但從本試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)EDN3可能與維持黑色素細(xì)胞活性及其發(fā)育有較大關(guān)系，在色素顆粒形成上具有協(xié)調(diào)作用。同時(shí)由于存在樣品采集時(shí)對(duì)綿羊品種和年齡等選擇上的不一致，均可能導(dǎo)致結(jié)果存在差異。

EDN3與EDNRB任一位點(diǎn)的隱形突變會(huì)產(chǎn)生相似的表型，包括不同程度的色素減退和無(wú)神經(jīng)節(jié)的巨結(jié)腸疾病，其中色素減退的表型是胚胎期黑色素細(xì)胞的減少和隨后黑色素細(xì)胞的異常遷移所造成。R.J.Garcia等[8]成功得到內(nèi)皮素3過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠模型，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎早期EDN3的表達(dá)對(duì)表型的形成非常重要，黑色素前體細(xì)胞的數(shù)量顯著增多，成年轉(zhuǎn)基因鼠的真皮層已分化的黑色素細(xì)胞數(shù)量增多，且成年鼠皮膚色素沉著的表型需要內(nèi)皮素3的持續(xù)表達(dá)來(lái)維持。該轉(zhuǎn)基因鼠與Agouti、KIT等基因的突變體小鼠雜交可改變其原有表型。有研究顯示，EDN3和EDNRB途徑對(duì)黑色素前體細(xì)胞和已分化成熟的黑色素細(xì)胞都有促進(jìn)作用。但是也有研究表明，毛發(fā)與皮膚中的黑色素細(xì)胞即使在分享或共用同一信號(hào)通路時(shí)，表型顏色的形成也是相互獨(dú)立的[21]。EDN3在成年綿羊皮膚中存在差異，且在白色綿羊皮膚內(nèi)表達(dá)量較高，說(shuō)明在成年綿羊中EDN3并未直接作用于色素的生成，后期毛發(fā)顏色形成時(shí)受到其他路徑的調(diào)控，影響表型的形成。C.B.Kaelin等[22]對(duì)貓科動(dòng)物花紋表型的形成做了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)EDN3在花紋間的表達(dá)存在差異，并進(jìn)一步證實(shí)EDN3對(duì)早期花紋的形成有一定的影響，且作為第二信使誘導(dǎo)胚胎時(shí)期黑色素細(xì)胞增多，對(duì)后期花紋的形成有明顯的異化作用。同時(shí)他們還證實(shí)EDN3在相鄰花紋區(qū)域維持高低不同的表達(dá)進(jìn)而維持毛發(fā)空間的差異，這一差異始終貫穿于毛囊的發(fā)育周期。而表型的變化則歸因于EDN3引起的色素顆粒類型的變化，即真黑素向褐黑素的轉(zhuǎn)變。該研究說(shuō)明EDN3對(duì)褐黑素的生成和顆粒的沉積有一定的影響并對(duì)花紋的形成有促進(jìn)作用，但是本試驗(yàn)結(jié)果卻顯示白色與花白色綿羊皮膚內(nèi)EDN3的表達(dá)量均顯著高于花黑色綿羊皮膚的表達(dá)量，與其研究結(jié)果不符，表明EDN3不是影響綿羊皮膚黑白花形成的主要基因，影響綿羊皮膚黑白花形成的因素還有待進(jìn)一步研究。試驗(yàn)結(jié)果顯示真黑素大量聚集的黑色綿羊皮膚內(nèi)，EDN3的存在較少，表明EDN3與真黑素及褐黑素之間存在一定的協(xié)調(diào)相關(guān)性。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，EDN3在不同毛色綿羊皮膚中均可正常表達(dá)，且存在顯著差異。EDN3是維持黑色素細(xì)胞存在不可缺少的基因，但不影響綿羊黑白花的形成。

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(編輯 程金華)

EDN3 Expression and Localization in Sheep Skin with Different Coat Color

LI Ya-nan1，ZHAO Bing-ling1，MA Shu-hui2，HE Xiao-yan1，F(xiàn)AN Rui-wen1WANG Hai-dong1，GENG Jian-jun1，DONG Chang-sheng1*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China;2.CollegeofVeterinaryMedicine，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China)

To explore the expression of endothelin 3 in different coat color of sheep skin and the effect ofEDN3 on the sheep coat color，the experiment analyzed the mRNA and protein expression level ofEDN3 in sheep skin of different coat colors in different coat color ship by real-time quantitative PCR，ELISA and immunohistochemistry.1)qRT-PCR showed that the relative expressive ofEDN3 mRNA in white sheep skin was 5.540 6±0.030 7，while in black was 1.005 8±0.062 0.The gene expression quantity ofEDN3 in white and black skin tissue of the same individuality was 4.341 9±0.087 7 and 1.150 1±0.005 3.2)ELISA results showed that the expression ofEDN3 protein in white and black were 128.424 7±2.223 4 and 25.114 4±3.248 3.The protein expression ofEDN3 in white and black skin of the same individuality were 93.945 3±7.562 2 and 28.606 0±9.295 9.3)TheEDN3 was located in the matrix，outer root sheath and dermal papilla of hair follicular by immunohischemistry.Experiments showed that theEDN3 expressed normally in black and white sheep skin，and the expression quantity had significant differences.The research indicated thatEDN3 was indispensable to maintain the presence of the melanocyte，and didn’t affect the formation of friesian sheep.

endothelin-3；sheep；immunohistochemistry

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.026

2014-03-12

國(guó)家“863”計(jì)劃(2013AA102506);國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31302049;31172283);山西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2012011046-6);高校博士點(diǎn)基金(20131403120002)

李亞楠(1989-)，女，河南扶溝人，碩士生，主要從事毛色相關(guān)研究，E-mail：18404966095@163.com

*通信作者：董常生，教授，E-mail：csdong18@163.com

S826.2

A

0366-6964(2015)12-2322-07