魏立琴，王東升，董書(shū)偉，鄺曉嬌，張世棟*，嚴(yán)作廷*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，蘭州 730050；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070)

丹翹液對(duì)脂多糖誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥相關(guān)因子的抑制效應(yīng)分析

魏立琴1，2，王東升1，董書(shū)偉1，鄺曉嬌1，張世棟1*，嚴(yán)作廷1*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，蘭州 730050；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070)

為研究丹翹液的體外抗炎作用及其抗炎機(jī)制，利用LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞建立炎癥模型，MTT法檢測(cè)不同濃度丹翹液對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力影響；NO測(cè)試盒檢測(cè)丹翹液對(duì)LPS誘導(dǎo)的NO釋放量的影響；ELISA方法檢測(cè)丹翹液對(duì)LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6和PGE2分泌的影響；RT-PCR方法檢測(cè)丹翹液對(duì)LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6、COX-2和iNOS基因轉(zhuǎn)錄的影響；Western blot檢測(cè)對(duì)細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示丹翹液小于700 μg·mL-1對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用；丹翹液各劑量組(100、300、600 μg·mL-1)能不同程度地抑制LPS誘導(dǎo)的NO、PGE2、TNF-α和IL-6的分泌；能顯著抑制iNOS、COX-2、TNF-α和IL-6基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞核內(nèi) NF-κB p65蛋白表達(dá)。丹翹液的抗炎作用機(jī)制可能與抑制NF-κB 通路激活，進(jìn)而抑制炎癥介質(zhì)和炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)有關(guān)。

丹翹液；抗炎機(jī)制； RAW264.7；LPS；炎癥模型

炎癥是機(jī)體對(duì)各種致炎因素及損傷所產(chǎn)生的具有防御意義的應(yīng)答性反應(yīng)，其在一定時(shí)期內(nèi)對(duì)機(jī)體是有利的，可以提高機(jī)體抵抗力，但劇烈或持久的炎癥反應(yīng)會(huì)對(duì)機(jī)體造成損失，影響動(dòng)物機(jī)體的健康，炎癥反應(yīng)是一些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)[1-2]。近年來(lái)，中藥制劑對(duì)炎癥有較好的抑制效果，由于其毒副作用小，對(duì)機(jī)體不良反應(yīng)較少，其影響炎癥免疫反應(yīng)作用的機(jī)制受到了廣泛的關(guān)注[3-4]。中藥影響炎癥免疫反應(yīng)的機(jī)制包括影響炎性介質(zhì)和炎性細(xì)胞因子的作用、核因子的功能、活性氧的生成、神經(jīng)內(nèi)分泌激素的生成等[4-6]。

丹翹液是以丹參和連翹等中草藥為主要成分，依據(jù)活血化瘀、縮宮排膿的治療原則研制而成的中藥子宮灌注劑，臨床上主要用于防治奶牛子宮內(nèi)膜炎[7-8]。動(dòng)物藥理學(xué)研究顯示，丹翹液具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛的藥理效應(yīng)[9]，但是丹翹液的抗炎作用機(jī)制尚不清楚。因此，本試驗(yàn)利用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7，建立炎癥模型，并研究了丹翹液對(duì)炎癥細(xì)胞模型的影響，旨在探討丹翹液的體外抗炎作用及其抗炎機(jī)制，為該新藥的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 小鼠單核/巨噬細(xì)胞株 RAW264.7(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)添加含10% 胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于試驗(yàn)。

1.1.2 試劑和儀器 脂多糖(E.coli0111：B4)、噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自Sigma 上海公司；胎牛血清、DMEM、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó) GIBCO 公司；小鼠 TNF-α、IL-6、PGE2的 ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；NO試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；TRIzol購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；RT-PCR 試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；引物由北京六合華大基因合成；HRP羊抗兔IgG購(gòu)自西安壯志；兔多克隆抗體NF-κB p65購(gòu)自Abcam； DMI6000B倒置相差顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；SpectraMaxM2/M2e 多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices 公司)；CFX96 型定量 PCR 儀(美國(guó)Bio Rad公司)； HeaL Force HF90型CO2培養(yǎng)箱(中國(guó)上海力康有限公司)。

1.1.3 中藥丹翹液的制備 稱取丹參1 200 g、連翹800 g，粉碎成粗粉，加乙醇加熱回流提取3次，濾過(guò)，合并濾液，減壓回收乙醇，干燥，加入800 mL聚乙二醇-200，4 000 r·min-1離心20 min，上清液合并后再加入聚乙二醇-200定容至1 000 mL，滅菌，即得每1 mL相當(dāng)于原生藥2 g的藥液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組及處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，細(xì)胞密度為8 ×104·mL-1，預(yù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行分組處理。① 正常對(duì)照組：不做任何處理，正常培養(yǎng) 24 h；② 炎癥模型組(LPS)：1 μg·mL-1LPS 持續(xù)刺激細(xì)胞 6 h；③丹翹組：600 μg·mL-1丹翹液作用細(xì)胞 24 h；④試驗(yàn)組：1 μg·mL-1LPS 持續(xù)刺激RAW264.7細(xì)胞6 h后，加入不同濃度的丹翹液(100、300、600 μg·mL-1)共同作用24 h。

1.2.2 細(xì)胞毒性試驗(yàn) 細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)采用MTT試驗(yàn)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞接種于96 孔板中，細(xì)胞分組及處理方法同1.2.1，培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入20 μL的MTT(5 mg·mL-1)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL的DMSO溶解甲瓚，均勻振蕩溶解完全后在 570 nm 處檢測(cè)各孔的吸光度。試驗(yàn)重復(fù)3次以上。1.2.3 NO含量測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞接種于24 孔板中，細(xì)胞分組及處理方法同1.2.1，培養(yǎng)結(jié)束后，收集各組細(xì)胞上清液，按照NO試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞上清中NO的釋放。酶標(biāo)儀測(cè)定550 nm處的光吸收值，以亞硝酸鈉作為對(duì)照品測(cè)定并計(jì)算NO的濃度。

1.2.4 ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-6、PGE2含量 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞接種于24 孔板中，細(xì)胞分組及處理方法同1.2.1，培養(yǎng)結(jié)束后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，ELISA法檢測(cè)各組TNF-α、IL-6、PGE2含量，操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.5 RT-PCR法檢測(cè)TNF-α、IL-6、COX-2和iNOS基因轉(zhuǎn)錄水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞接種于6 孔板中，細(xì)胞分組及處理方法同1.2.1，培養(yǎng)結(jié)束后，Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，得到的cDNA用于RT-PCR檢測(cè)TNF-α、IL-6、COX-2和iNOS基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。PCR引物見(jiàn)表1。RT-PCR反應(yīng)條件是95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，循環(huán)40次；55～95 ℃循環(huán)81次，mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量采用2-△△Ct方法計(jì)算，并以β-actin為內(nèi)參基因。

表1 RT-PCR引物序列

Table 1 RT-PCR oligo-nucleotide primers

引物primers序列GenesequencePCR產(chǎn)物/bpPCRproduct退火溫度/℃Annealingtemperatureβ?actinForwardReverse5′?GCCACCAGTTCGCCATGGAT?3′5′?GCTTTGCACATGCCGGAGC?3′7058TNF?αForwardReverse5′?TCGAGTGACAAGCCCGTAG?3′5′?CAGCCTTGTCCCTTGAAGAG?3′18058IL?6ForwardReverse5′?CTGATGCTGGTGACAACCAC?3′5′?TCCACGATTTCCCAGAGAAC?3′14359iNOSForwardReverse5′?GGACCCAGTGCCCTGCTTT?3′5′?CACCAAGCTCATGCGGCCT?3′17865COX?2ForwardReverse5′?TGAGTACCGCAAACGCTTCTC?3′5′?TGGACGAGGTTTTTCCACCAG?3′15165

1.2.6 Western blot 檢測(cè) NF-κB 蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞分組及處理方法同1.2.1，培養(yǎng)結(jié)束后，根據(jù)試劑盒說(shuō)明提取總蛋白質(zhì)、細(xì)胞核蛋白，BCA 法測(cè)定各組蛋白質(zhì)濃度，各組取40 μg蛋白質(zhì)樣品與蛋白質(zhì)上樣緩沖液混勻，沸水中變性 10 min后，在10% 分離膠、5% 濃縮膠中100 V恒壓進(jìn)行SDS-PAGE電泳2.5 h，結(jié)束后半干轉(zhuǎn)移法12 V恒壓轉(zhuǎn)印1 h到PVDF膜上，用 5%的BSA封閉 1 h，加入一抗過(guò)夜孵育(4 ℃)，TBST 洗膜4次，每次10 min，加入HRP 標(biāo)記的二抗在室溫緩慢搖動(dòng)孵育 2 h，TBST 洗滌10 min×4次，加ECL，暗室膠片曝光、顯影、定影后顯示各組細(xì)胞中目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 丹翹液對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

圖1A為MTT法檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)不同劑量的丹翹液處理后的細(xì)胞活力變化。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，丹翹液≤700μg·mL-1時(shí)對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用(P>0.05)，當(dāng)?shù)ぢN液大于700μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞活力明顯下降(P<0.01)。圖1B為丹翹液和LPS共同處理后細(xì)胞的活力變化，結(jié)果與丹翹液?jiǎn)为?dú)處理的一致。

2.2 丹翹液對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥介質(zhì)的影響

NO檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，LPS處理組的NO釋放量極顯著升高(P<0.01)，丹翹液處理組的NO釋放量不明顯，與LPS處理組相比，丹翹液各組均能極顯著抑制NO的釋放量(P<0.01)。各劑量丹翹液抑制后NO含量與正常對(duì)照組差異顯著(P<0.01或P<0.05)(圖2A)。ELISA檢測(cè)PGE2結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，LPS處理組的PGE2釋放量極顯著升高(P<0.01)，與LPS處理組相比，丹翹液高、中劑量組能顯著抑制PGE2的釋放量(P<0.05或P<0.01)，低劑量差異不顯著(P>0.05)。高劑量丹翹液抑制后PGE2含量與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，中、低劑量丹翹液抑制后PGE2含量與正常對(duì)照組顯著差異(P<0.01或P<0.05)(圖2B)。

A.不同濃度的丹翹液(0～1 000 μg·mL-1)作用24 h時(shí)細(xì)胞的活力變化；B.1 μg·mL-1LPS 持續(xù)刺激RAW264.7細(xì)胞6 h后，不同濃度的丹翹液(0～1 000 μg·mL-1)作用24 h時(shí)細(xì)胞的活力變化。標(biāo)注不同大寫(xiě)字母表示組間差異極顯著(P<0.01)，標(biāo)相同或未標(biāo)字母表示組間差異不顯著(P>0.05)A.Viabilities of cells that treated with or without Danqiao liquid(0-1 000 μg·mL-1) for 24 h；B.Cells were treated with or without Danqiao liquid for 24 h after exposure to LPS(1 μg·mL-1) for 6 h.Values with different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01)，and with the same letters or without letters mean not significant difference(P>0.05)圖1 丹翹液對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒活性作用Fig.1 The effects of Danqiao liquid on viability in RAW264.7 cells

標(biāo)注不同大寫(xiě)字母表示組間差異極顯著(P<0.01)，標(biāo)注不同小寫(xiě)字母表示組間差異顯著(P<0.05)，標(biāo)相同小寫(xiě)字母表示組間差異不顯著(P>0.05)。下圖同Values with different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01)，with different letters mean significant difference(P<0.05)，and with the same letters mean not significant difference(P>0.05).The same as below圖2 丹翹液對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌NO和PGE2的影響Fig.2 The effects of Danqiao liquid on PGE2 and Nitrite in RAW264.7 macrophage cells induced by LPS

2.3 丹翹液對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子分泌的影響

圖3A、B為 ELISA法檢測(cè)丹翹液對(duì) LPS誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6含量的影響，結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，LPS處理組的TNF-α、IL-6釋放量極顯著升高(P<0.01)，丹翹液組的釋放量變化不明顯(P>0.05)，與LPS處理組相比，高劑量丹翹液能顯著抑制 TNF-α、IL-6的釋放量(P<0.01或P<0.05)，但中、低劑量對(duì)TNF-α、IL-6的抑制無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高劑量丹翹液抑制后TNF-α、IL-6含量與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，低劑量丹翹液抑制后TNF-α、IL-6含量與正常對(duì)照組極顯著差異(P<0.01)。

圖3 丹翹液對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的影響Fig.3 The effects of Danqiao liquid on TNF-α and IL-6 in RAW264.7 macrophage cells induced by LPS

2.4 丹翹液對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響

RT-PCR檢測(cè)各處理組細(xì)胞的TNF-α、IL-6、iNOS和COX-2基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示，與正常組相比，LPS處理組的TNF-α、IL-6、iNOS和COX-2 mRNA轉(zhuǎn)錄均極顯著升高(P<0.01)，與LPS處理組相比，丹翹液各劑量組均能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞iNOS和COX-2 mRNA 轉(zhuǎn)錄的升高(P<0.01或P<0.05)(圖4A、B)，也能夠顯著抑制TNF-α、IL-6 mRNA 轉(zhuǎn)錄的升高(圖4C、D)，且對(duì)TNF-α、iNOS和COX-2具有一定的劑量效應(yīng)。各劑量丹翹液抑制后IL-6、iNOS和COX-2 mRNA轉(zhuǎn)錄與正常對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)，高、中劑量丹翹液抑制后TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄與正常對(duì)照組相比，無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖4 丹翹液對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的炎癥相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響Fig.4 The effects of Danqiao liquid on gene transcription of TNF-α，IL-6， iNOS and COX-2 in RAW264.7 macrophage cells induced by LPS

2.5 核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 蛋白表達(dá)

Western blot對(duì)不同處理組細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65 蛋白表達(dá)檢測(cè)，結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，LPS 刺激 RAW264.7 細(xì)胞活化后，細(xì)胞核內(nèi) NF-κB p65蛋白表達(dá)極顯著升高(P<0.01)，與LPS處理組相比，不同濃度的丹翹液處理后，顯著抑制NF-κB p65 表達(dá)(P<0.05)，并呈現(xiàn)劑量依賴性(圖5)。

圖5 丹翹液對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響Fig.5 The effects of Danqiao liquid on nuclear translocation of NF-κB p65 in RAW264.7 cells by LPS

3 討 論

炎癥是機(jī)體對(duì)于刺激的一種防御反應(yīng)，表現(xiàn)為紅腫熱痛和功能障礙。炎癥反應(yīng)是損傷與抗損傷的過(guò)程，損傷因子一方面可以直接或間接破壞組織和細(xì)胞，另一方面可以通過(guò)炎癥充血和滲出反應(yīng)，殺傷和包圍損傷因子，通過(guò)實(shí)質(zhì)和間質(zhì)細(xì)胞的再生修復(fù)和愈合受損的組織[10-11]。如損傷過(guò)程占優(yōu)勢(shì)，則炎癥加重，并向全身擴(kuò)散；若抗損傷過(guò)程占優(yōu)勢(shì)，則炎癥逐漸趨向痊愈。所以，控制損傷、加強(qiáng)抗損傷過(guò)程是機(jī)體維持正常生理功能的重要環(huán)節(jié)。巨噬細(xì)胞參與吞噬、免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)、新陳代謝和炎癥等多種生理過(guò)程。微生物刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種促炎性細(xì)胞因子和趨化因子，這些促炎因子反過(guò)來(lái)引起細(xì)胞滲出和激活其他類(lèi)型的免疫細(xì)胞(如T細(xì)胞)，這些因素共同介導(dǎo)形成免疫炎癥反應(yīng)[12-13]。因此本研究利用LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型對(duì)丹翹液的體外抗炎作用及機(jī)制進(jìn)行深入的探討。本試驗(yàn)首先檢測(cè)丹翹液對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響，MTT試驗(yàn)結(jié)果表明，藥物濃度在700 μg·mL-1以內(nèi)對(duì)RAW264.7細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用。因此，選擇0～700 μg·mL-1的丹翹液進(jìn)行下一步的抗炎活性研究。

NO既能參與機(jī)體生理過(guò)程的調(diào)節(jié)及免疫應(yīng)答反應(yīng)，其過(guò)度產(chǎn)生又可導(dǎo)致組織損傷和炎性反應(yīng)。體內(nèi)NO產(chǎn)生由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸(L-Arg)產(chǎn)生。NOS可以分為結(jié)構(gòu)型(eNOS)和誘導(dǎo)型(iNOS)。eNOS只產(chǎn)生少量NO，發(fā)揮正常生理作用，病原微生物感染及組織損傷都可誘導(dǎo)iNOS表達(dá)，促進(jìn)NO大量產(chǎn)生。NO具有抗炎和促炎雙重功能[14-15]。少量NO可通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附表現(xiàn)抗炎活性[16]。反之，炎癥性疾病過(guò)程中，過(guò)度的NO通過(guò)激活NF-κB誘導(dǎo)促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6等的產(chǎn)生促進(jìn)炎性反應(yīng)，這些細(xì)胞因子又能激活iNOS，促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生更多的NO，使NO及細(xì)胞因子的分泌得以持續(xù)，從而使炎癥反應(yīng)更持久，更劇烈[17]。環(huán)氧酶(COX)是機(jī)體催化花生四稀酸轉(zhuǎn)變?yōu)榍傲邢偎氐南匏倜福珻OX有三種同工酶，其中COX-2為誘導(dǎo)性表達(dá)，在脂多糖(LPS)等炎癥因子的誘導(dǎo)下，COX-2大量合成，進(jìn)而催化PGs大量合成，參與并放大炎癥反應(yīng)[18-21]。在炎癥過(guò)程中，若能夠抑制炎性介質(zhì)NO和PGE2的釋放及其催化酶的活化，就能有效抑制其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，LPS刺激細(xì)胞后NO 和PGE2的分泌水平極顯著升高，說(shuō)明細(xì)胞發(fā)生了極顯著的炎癥反應(yīng)，不同劑量的丹翹液作用炎性細(xì)胞后均能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NO和PGE2的分泌及iNOS和COX-2 mRNA的轉(zhuǎn)錄，且表現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)，結(jié)果表明丹翹液抑制炎癥限速酶的基因表達(dá)和介質(zhì)分泌是其抗炎機(jī)制之一。但是丹翹液抑制后NO和PGE2的分泌及iNOS和COX-2 mRNA轉(zhuǎn)錄與正常對(duì)照組相比有顯著差異，說(shuō)明丹翹液有抗炎癥作用，但不能完全阻斷細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

細(xì)胞因子是一類(lèi)具有廣泛生物學(xué)活性、且功能復(fù)雜的小分子蛋白質(zhì)。TNF-α主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，被視為促進(jìn)炎癥反應(yīng)最重要的細(xì)胞因子之一，它能引起急性炎癥性疾病并引起組織損傷[22-23]。IL-6也是誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要因素，它能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的分化，和其他炎性細(xì)胞因子協(xié)同作用，級(jí)聯(lián)促進(jìn)和放大炎癥反應(yīng)造成組織損傷[24]。因此，TNF-α和IL-6作為炎癥標(biāo)志物，對(duì)藥物的抗炎作用研究具有指示作用[25]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，高劑量丹翹液能顯著抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)中TNF-α和IL-6的釋放，但中、低劑量對(duì)TNF-α和IL-6的釋放抑制效果不顯著。同時(shí)TNF-α和IL-6基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄結(jié)果顯示，丹翹液各劑量組均能劑量依懶性的抑制TNF-α和IL-6的轉(zhuǎn)錄，以上結(jié)果說(shuō)明丹翹液對(duì)促炎細(xì)胞因子分泌的抑制是抑制其基因轉(zhuǎn)錄的結(jié)果。此外，兩種檢測(cè)結(jié)果間有差異可能與不同方法的靈敏度有關(guān)。

此外，NF-κB是重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)的各階段起重要的調(diào)控作用，其主要的誘導(dǎo)型亞基是p50/p65[26]。 靜息狀態(tài)時(shí)，NF-κB與 IκB 形成復(fù)合體存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)受到特定刺激后，IκB 被活化的激酶復(fù)合體(IκB kinase，IKK)磷酸化，NF-κB與 IκB 解離，游離的 NF-κB p65迅速轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與κB 結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)炎性介質(zhì)及促炎癥細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[27-31]。本試驗(yàn)NF-κB蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，LPS刺激細(xì)胞后，細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達(dá)升高，說(shuō)明NF-κB被激活并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，丹翹液能抑制細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達(dá)升高，說(shuō)明丹翹液可抑制NF-κB的活化與核轉(zhuǎn)移，進(jìn)而抑制炎癥相關(guān)基因的表達(dá)與炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。

4 結(jié) 論

丹翹液能夠抑制LPS刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性介質(zhì)NO和PGE2；也能抑制炎性因子TNF-α和IL-6的分泌及其基因轉(zhuǎn)錄；亦對(duì)炎癥關(guān)鍵酶iNOS、COX-2的基因轉(zhuǎn)錄具有抑制作用。丹翹液能抑制LPS對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路的激活，抑制NF-κB p65活化因子的入核轉(zhuǎn)移，從而抑制炎癥過(guò)程中關(guān)鍵酶和炎癥因子的基因表達(dá)及炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。因此，丹翹液對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)具有抗炎保護(hù)作用。

[1] MATHUR N，PEDERSEN B K.Exercise as a mean to control low-grade systemic inflammation[J/OL].MediatorsInflamm，2008，2008：109502.[2015-10-23].http：//www.hindawi.com/journals/mi/2008/109502/.

[2] RAMOS G C.Inflammation as an animal development phenomenon[J/OL].ClinDevImmunol，2012，2012：983203.[2015-10-23].http：//www.hindawi.com/journals/jir/2012/983203/.

[3] 郭醉元.溶菌酶與中藥治療奶牛子宮內(nèi)膜炎的比較研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008. GUO Z Y.Comparative studies on lysozyme and traditional Chinese medicine treating cow endometritis[D].Harbin：Northeast Agricultural University，2008.(in Chinese)

[4] 岑玉文，譚行華，張堅(jiān)生，等.中西醫(yī)結(jié)合療法改善艾滋病合并肺部感染患者中醫(yī)癥候的隨機(jī)對(duì)照研究[J].中國(guó)中藥雜志，2013，38(15)：2448-2452. CEN Y W，TAN X H，ZHANG J S，et al.Randomized controlled study of integrated treatment of traditional Chinese medicine and western medicine on AIDS with pulmonary inflammation patients[J].ChinaJournalofChineseMateriaMedica，2013，38(15)：2448-2452.(in Chinese)

[5] 周 松，劉永剛，張國(guó)祥，等.中藥影響炎癥免疫反應(yīng)的機(jī)制研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2012，18(2)：183-185. ZHOU S，LIU Y G，ZHANG G X，et al.Research Progress on the Mechanism of the Influences of Traditional Chinese Medicine on Inflammation Immunity[J].MedicineRecapitulate，2012，18(2)：183-185.(in Chinese)

[6] 劉 紅，孫 偉，萬(wàn)毅剛，等.慢性腎臟病腎組織炎癥信號(hào)通路NF-κB的調(diào)節(jié)機(jī)制及中藥的干預(yù)作用[J].中國(guó)中藥雜志，2013，38(24)：4246-4251. LIU H，SUN W，WAN Y G，et al.Regulatory mechanism of NF-κB signaling pathway on renal tissue inflammation in chronic kidney disease and interventional effect of traditional Chinese medicine[J].ChinaJournalofChineseMateriaMedica，2013，38(24)：4246-4251.(in Chinese)

[7] 王洪海，王國(guó)卿，郭夢(mèng)堯，等.中藥治療奶牛子宮內(nèi)膜炎研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2010，46(8)：64-66. WANG H H，WANG G Q，GUO M Y，et al.Progress of Treatment of Traditional Chinese Herb on Dairy Cows With Endometritis[J].ChineseJournalofVeterinaryMedicine，2010，46(8)：64-66.(in Chinese)

[8] SHELDON I M，PRICE S B，CRONIN J，et al.Mechanisms of infertility associated with clinical and subclinical endometritis in high producing dairy cattle[J].ReprodDomestAnim，2009，44(Suppl 3)：1-9.

[9] 魏立琴，王東升，苗小樓，等.丹翹灌注液抗炎鎮(zhèn)痛作用的研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2015，31(2)：75-79. WEI L Q，WANG D S，MIAO X L，et al.Anti-inflammatory and analgesic activities ofDanqiaoperfusate[J].ChineseAgriculturalScienceBulletin，2015，31(2)：75-79.(in Chinese)

[10] ARROYO A G，IRUELA-ARISPE M L.Extracellular matrix，inflammation，and the angiogenic response[J].CardiovascRes，2010，86(2)：226-235.

[11] MCCARTHY N.Inflammation：An innate response[J].NatRevCancer，2015，15(4)：197.

[12] MANTOVANI A，BISWAS S K，GALDIERO M R，et al.Macrophage plasticity and polarization in tissue repair and remodelling[J].JPathol，2013，229(2)：176-185.

[13] BISWAS S K，CHITTEZHATH M，SHALOVA I N，et al.Macrophage polarization and plasticity in health and disease[J].ImmunolRes，2012，53(1-3)：11-24.

[14] 王 強(qiáng)，廖清奎.一氧化氮在炎癥反應(yīng)中的作用[J].醫(yī)學(xué)綜述，2002，8(4)：198-200. WANG Q，LIAO Q Q.The role of nitric oxide in the inflammatory response[J].MedicineRecapitulate，2002，8(4)：198-200.(in Chinese)

[15] ZHOU L，ZHU D Y.Neuronal nitric oxide synthase：structure，subcellular localization，regulation，and clinical implications[J].NitricOxide，2009，20(4)：223-230.

[16] MEDZHITOV R.Toll-like receptors and innate immunity[J].NatRevImmunol，2001，1(2)：135-145.

[17] DEBPRASAD C，HEMANTA M，PAROMITA B，et al.Inhibition of NO2，PGE2，TNF-α，and iNOS expression byShorearobustaL.：An ethnomedicine used for anti-inflammatory and analgesic activity[J/OL].EvidBasedComplementAlternatMed，2012，2012：254849.[2015-10-23].http：//www.hindawi.com/journals/ecam/2012/254849/.

[18] WANG D，DUBOIS R N.The role of COX-2 in intestinal inflammation and colorectal cancer[J].Oncogene，2010，29(6)：781-788.

[19] 徐藝榮.九種黃酮類(lèi)化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞PGE2、COX-2表達(dá)的影響[D].天津：天津科技大學(xué)，2012. XU Y R.Comparison of Inhibitory Effects of nine flavonoids on prostaglandin E2 production and COX-2 expression in LPS-stimulated RAW264.7 macrophages[D].Tianjin：Tianjin University of Science And Technology，2012.(in Chinese)

[20] CHEN J，JIANG X H，CHEN H，et al.CFTR negatively regulates cyclooxygenase-2-PGE2positive feedback loop in inflammation[J].JCellPhysiol，2012，227(6)：2759-2766.

[21] LI H，BRADBURY J A，DACKOR R T，et al.Cyclooxygenase-2 regulates Th17 cell differentiation during allergic lung inflammation[J].AmJRespirCritCareMed，2011，184(1)：37-49.

[22] AHMAD S F，ANSARI M A，ZOHEIR K M，et al.Regulation of TNF-α and NF-κB activation through the JAK/STAT signaling pathway downstream of histamine 4 receptor in a rat model of LPS-induced joint inflammation[J].Immunobiology,2015，220(7)：889-898.

[23] YAMANAKA H.TNF as a target of inflammation in rheumatoid arthritis[J].EndocrMetabImmuneDisordDrugTargets，2015，15(2)：129-134.

[24] HONG S H，ONDREY F G，AVIS I M，et al.Cyclooxygenase regulates human oropharyngeal carcinomas via the proinflammatory cytokine IL-6：a general role for inflammation?[J].FASEBJ，2000，14(11)：1499-1507.

[25] MANJEET K R，GHOSH B.Quercetin inhibits LPS-induced nitric oxide and tumor necrosis factor-alpha production in murine macrophages[J].IntJImmunopharmacol，1999，21(7)：435-443.

[26] 邢飛躍，趙克森，姜 勇.NF-κB的信號(hào)通路與阻斷策略[J].中國(guó)病理生理雜志，2003，19(6)：849-855. XING F Y，ZHAO K S，JIANG Y.Signal transduction pathway and blocking strategies of NF-κB[J].ChineseJournalofPathophysiology，2003，19(6)：849-855.(in Chinese)

[27] 喬 靜.葫蘆素E對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥反應(yīng)的抑制作用及其機(jī)制研究[D].廣州：暨南大學(xué)，2013. QIAO J.The inhibitory effect of cucurbitacin E on the inflammatory response of lipopolysaccharides-induced mouse macrophage RAW264.7 and its mechanism[D].Guangzhou：Jinan University，2013.(in Chinese)

[28] OH Y C，JEONG Y H，HA J H，et al.Oryeongsan inhibits LPS-induced production of inflammatory mediators via blockade of the NF-kappaB，MAPK pathways and leads to HO-1 induction in macrophage cells[J].BMCComplementAlternMed，2014，14：242.

[29] GUGASYAN R，GRUMONT R，GROSSMANN M，et al.Rel/NF-κB transcription factors：key mediators of B-cell activation[J].ImmunolRev，2000，176：134-140.

[30] BAWADEKAR M，DE ANDREA M，LO CIGNO I，et al.The extracellular IFI16 protein propagates inflammation in endothelial cells via p38 MAPK and NF-κB p65 activation[J].JInterferonCytokineRes，2015，35(6)：441-453.

[31] ZHAO W，SUN Z，WANG S，et al.Wnt1 participates in inflammation induced by lipopolysaccharide through upregulating scavenger receptor A and NF-κB[J].Inflammation，2015，38(4)：1700-1706.

(編輯 白永平)

Inhibiting Effect Analysis ofDanqiaoLiquid on Inflammation-related Factors Induced by LPS in RAW264.7 Cells

WEI Li-qin1，2，WANG Dong-sheng1，DONG Shu-wei1，KUANG Xiao-jiao1，ZHANG Shi-dong1*，YAN Zuo-ting1*

(1.LanzhouInstituteofHusbandryandPharmaceuticalScienceofCAAS/KeyLaboratoryofVeterinaryPharmaceuticsDiscovery，MinistryofAgriculture/Engineering&TechnologyResearchCenterofTraditionalChineseVeterinaryMedicineofGansuProvince，Lanzhou730050，China；2.CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China)

The aim of the present study was to study the anti-inflammatory effects and possible underlying mechanisms ofDanqiaoliquid in LPS-stimulated RAW264.7 cells.The cytotoxicity ofDanqiaoliquid was detected by MTT method.The NO kit assay was adopted to detect the effect ofDanqiaoliquid on NO release from LPS-induced RAW264.7 cells.ELISA was used to evaluate the production of TNF-α，IL-6 and PGE2in LPS-induced RAW264.7 cells.Real-time PCR was used to detect the transcription of COX-2，iNOS，TNF-α and IL-6 in LPS-induced RAW264.7 cells.The protein expression of nuclear NF-κB p65 was detected by Western blot.The result showed that the safe medication range ofDanqiaoliquid was less than 700 μg·mL-1.Compared with the LPS model group，Danqiaoliquid(100，300，600 μg·mL-1) could reduce the secretion of NO，PGE2，TNF-α，and IL-6 in cells induced by LPS，and significantly inhibit the mRNA transcription of iNOS，COX-2，TNF-α，IL-6 and the protein expression of NF-κB p65.In conclusion，this study preliminarily proves the protective effect ofDanqiaoliquid on LPS-induced RAW264.7 macrophages.Its action mechanism may be related to inhibit NF-κB signal pathway and the genes expressions and secretion of inflammatory mediators and cytokines.

Danqiaoliquid；anti-inflammatory mechanism；RAW264.7；LPS；inflammatory models

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.023

2015-04-13

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD12B03)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程-奶牛疾病研究

魏立琴(1986-)，女，甘肅蘭州人，碩士，主要從事中獸醫(yī)臨床和奶牛疾病防治的研究，E-mail：24weiliqin@163.com，Tel：0931-2115262

*通信作者：張世棟(1983-)，男，甘肅張掖人，助理研究員，碩士，主要從事藥理毒理學(xué)研究，E-mail：zhangshidong@caas.cn，Tel：0931-2115262；嚴(yán)作廷(1962-)，男，甘肅武威人，研究員，博士，主要從事中獸醫(yī)臨床和奶牛疾病防治的研究，E-mail：yanzuoting@caas.cn，Tel：0931-2115261

S853.9

A

0366-6964(2015)12-2299-08