陳國娟，袁莉剛，李 聰，閆振龍

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070)

高原牦牛隱睪組織結(jié)構(gòu)特征

陳國娟，袁莉剛*，李 聰，閆振龍

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070)

觀察成年牦牛隱睪的組織結(jié)構(gòu)特點，分析高原環(huán)境對其生殖微環(huán)境的影響。應(yīng)用HE、Masson’s、Gomori’s特殊染色以及免疫組織化學(xué)方法和透射電鏡觀察比較成年牦牛隱睪與單側(cè)正常睪丸、正常睪丸組織結(jié)構(gòu)特點，進(jìn)而用IPP圖像分析軟件進(jìn)行定量統(tǒng)計。與正常組睪丸相比，隱睪生精小管管徑極顯著減小(P<0.01)，基膜增厚，腔內(nèi)生殖細(xì)胞丟失，散在少數(shù)幼稚型Sertoli細(xì)胞，胞內(nèi)線粒體變性且含有大小不等的脂褐素顆粒；間質(zhì)內(nèi)膠原纖維增生，間質(zhì)/管腔面積比極顯著增大(P<0.01)，Leydig細(xì)胞數(shù)量減少，胞內(nèi)線粒體腫脹，間質(zhì)血管數(shù)量減少，管壁增厚皺縮，血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)含大量脂褐素顆粒；睪丸實質(zhì)部分鈣化。單側(cè)正常組睪丸生精上皮細(xì)胞為3～4層，Sertoli細(xì)胞發(fā)育成熟，少見初級精母細(xì)胞及精子；間質(zhì)/管腔面積比與正常睪丸無明顯差異(P>0.05)，Leydig細(xì)胞數(shù)量較多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富呈一定擴(kuò)張狀態(tài)，線粒體減少。免疫組織化學(xué)顯示，VEGF及VEGFR2在隱睪組與單側(cè)正常組、正常組睪丸均表達(dá)于Sertoli細(xì)胞、Leydig細(xì)胞及各級生精細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞偶見表達(dá)；隱睪組VEGF表達(dá)量較正常組、單側(cè)正常組睪丸明顯下降(P<0.05)，VEGFR2表達(dá)量明顯高于正常組與單側(cè)正常組(P<0.05)；單側(cè)正常組VEGF及VEGFR2表達(dá)量較正常組均無明顯差異(P>0.05)。高原低氧環(huán)境，牦牛隱睪血管發(fā)育受阻，組織出現(xiàn)不同程度的纖維化和局部鈣化，Sertoli細(xì)胞發(fā)育異常嚴(yán)重影響生精功能；單側(cè)正常睪丸Leydig細(xì)胞數(shù)量增加，而其中線粒體數(shù)量減少，發(fā)育程度較正常組織有所降低，隱睪組織中VEGF與VEGFR2可能參與調(diào)節(jié)雙側(cè)睪丸生精抑制作用。

牦牛；隱睪；組織結(jié)構(gòu)；血管內(nèi)皮生長因子；血管內(nèi)皮生長因子受體2

隱睪是一種常見的生殖系統(tǒng)疾病，是雄性不育的主要原因之一。隱睪引起睪丸缺血缺氧，致使生精環(huán)境改變及生精細(xì)胞凋亡、睪丸纖維化，嚴(yán)重時可引起睪丸鈣化等退行性改變[1-2]。隱睪還可導(dǎo)致睪丸癌發(fā)病率升高，最終影響生育能力[3]。目前關(guān)于隱睪引起不育的研究資料主要集中于人類、嚙齒類實驗動物(如大鼠、小鼠)等，對于高海拔地區(qū)人或動物的研究資料很少。據(jù)報道，隱睪可致睪丸毛細(xì)血管生成或退行性改變，血管內(nèi)皮層增厚，阻礙與間質(zhì)的物質(zhì)交換[4]。高原環(huán)境中藏綿羊等動物睪丸小葉的微血管分布有顯著的高海拔低氧適應(yīng)特征[5]。X.Y.Wu等[6]對牦牛血管內(nèi)皮生長因子基因研究表示，血管內(nèi)皮生長因子作為一種血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器和一個內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂原，在高海拔適應(yīng)性中起著重要作用。研究報道[7]，VEGF及其受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)在人體許多與生殖有關(guān)的細(xì)胞上均有表達(dá)，是體內(nèi)與生殖有關(guān)的重要生長因子之一。高海拔低氧小鼠應(yīng)激模型研究發(fā)現(xiàn)，缺氧條件下血漿VEGF濃度增加[8]；VEGF及VEGFR通過旁分泌或是自分泌的形式與激素等其他因子共同作用于睪丸間質(zhì)毛細(xì)血管，來增加其新生血管形成和通透性，提高機(jī)體耐受缺氧的能力[9]。牦牛長期生活在高海拔地區(qū)，是典型的季節(jié)性發(fā)情動物，其繁殖能力較低。近年來，關(guān)于成年牦牛睪丸形態(tài)及生物學(xué)方面的研究較多，但是對牦牛隱睪的組織學(xué)特征、血管分布變化、VEGF及VEGFR表達(dá)研究尚未見報道。因此，研究高原低氧環(huán)境中牦牛隱睪的組織學(xué)特點，進(jìn)一步分析VEGF及其受體表達(dá)變化，有助于深入了解其生殖生理特點，為高原地區(qū)動物隱睪與生殖生理的研究提供形態(tài)學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

樣品采自青海省大通牧區(qū)，冬季，健康性成熟3～4歲牦牛，隱睪位于腹股溝管或腹腔內(nèi)，外科手術(shù)取出睪丸。共20例，正常睪丸14例，隱睪6例，其中單側(cè)隱睪4例。以4%中性福爾馬林溶液固定3 d后備用。組織樣分正常睪丸組、隱睪組、單側(cè)正常睪丸組進(jìn)行研究。

1.2 主要試劑

VEGF兔抗鼠多克隆抗體(bs-1313R)和VEGFR2兔抗鼠多克隆抗體(bs-0565R)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；免疫組化染色試劑盒(sp-0023，由美國ZYMED公司生產(chǎn))購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒(ZLI-9018)和APES防脫玻片(ZLI-9502)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 普通切片制備

新鮮組織樣品稱重測量，記錄解剖數(shù)據(jù)，甲醛溶液(福爾馬林)固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片(片厚 5 μm)，相鄰切片分為6套，其中2套分別用于VEGF和VEGFR2免疫組織化學(xué)SP法染色，剩下4套用于組織化學(xué)HE、Masson’s、Gomori’s染色及陰性對照。

1.4 組織化學(xué)染色法

切片脫水、脫蠟后分別進(jìn)行HE、Masson’s、Gomori’s組織化學(xué)染色，之后繼續(xù)進(jìn)行脫水、透明，然后封片、觀察、拍照。HE染色，細(xì)胞核為藍(lán)紫色，其余均為紅色；Masson’s三色染色(亮綠)，膠原纖維呈現(xiàn)藍(lán)綠色，細(xì)胞核呈現(xiàn)灰黑或灰藍(lán)色，紅細(xì)胞呈紅色；Gomori’s銀染顯示網(wǎng)狀纖維為灰色，蘇木素-伊紅復(fù)染后呈棕紅色。

1.5 透射電鏡觀察

2.5%戊二醛、2%多聚甲醛磷酸緩沖液與1%鋨酸磷酸緩沖液雙重固定組織，梯度酒精脫水，氧化丙烯置換，Epon812樹脂包埋，超薄切片，醋酸、檸檬酸鉛雙重染色，進(jìn)行觀察。

1.6 免疫組織化學(xué)SP法檢測VEGF和VEGFR2分布及圖像分析

2 結(jié) 果

2.1 牦牛隱睪、單側(cè)正常睪丸與正常睪丸解剖特征的比較

隱睪位于腹股溝管或腹腔內(nèi)，睪丸大小及重量均較正常睪丸極顯著降低(P<0.01)，質(zhì)地較硬，眼觀發(fā)黃，切面有黃白色黏液流出，嚴(yán)重者鈣化明顯；單側(cè)隱睪，正常下降側(cè)睪丸重量及大小指數(shù)較正常組均略小(P>0.05)，但質(zhì)地柔軟、飽滿(表1)。

表1 牦牛隱睪、單側(cè)正常睪丸與正常睪丸解剖特征指數(shù)比較Table 1 The comparison of the anatomical characteristic index of cryptorchidism，unilateral normal testicles，normal testicles in yak

組別Group長徑/cmOlicho?diameter橫徑/cmBrachy?diameter厚徑/cmHadro?diameter重量/gWeight正常組Thenormalgroup5．967±0．168a4．067±0．069a3．267±0．077a95．425±1．814a隱睪組Thecryptorchidismgroup2．911±0．208b?2．307±0．115b1．867±0．038b14．301±1．278b?單側(cè)正常組Theunilateralnormalgroup5．553±0．416a3．724±0．240a3．033±0．117a89．425±2．305a

同列標(biāo)有不同字母的差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有相同字母的差異不顯著(P>0.05)，標(biāo)有*的差異極顯著(P<0.01)。下表同

Different letters in the column means difference between the groups(P<0.05)，same letters mean no difference between groups(P>0.05)，*means significant difference between groups(P<0.01).The same as below

2.2 牦牛隱睪、單側(cè)正常睪丸及正常睪丸的組織結(jié)構(gòu)特點

光鏡下觀察，正常睪丸被膜結(jié)構(gòu)致密，富含膠原纖維、血管(圖1a)；基膜平整，生精小管發(fā)育良好，小管平均直徑(263.880±3.560)μm，6～7層生精細(xì)胞，精子數(shù)量較多(圖1b)；間質(zhì)內(nèi)膠原及網(wǎng)狀纖維、血管均豐富(圖1c、圖1d)。隱睪內(nèi)膠原纖維增生，被膜內(nèi)少見小血管，血管減少，管壁皺縮，管腔縮小，僅可見微血管(圖1e)；生精小管平均直徑較正常組極顯著減小(P<0.01，表2)，基膜增厚內(nèi)陷，僅見少數(shù)Sertoli細(xì)胞散在于小管內(nèi)，生精細(xì)胞缺失(圖1f)； Leydig細(xì)胞減少，間質(zhì)/管腔面積比較正常組極顯著增大(P<0.01，表2)，網(wǎng)狀纖維無明顯變化(圖1g、圖1h)；靠近被膜處尚有間質(zhì)和生精小管結(jié)構(gòu)存在，實質(zhì)深部近縱隔處明顯鈣化，組織結(jié)構(gòu)不清晰。單側(cè)正常睪丸被膜發(fā)育完整(圖1i)，生精小管發(fā)育不良，小管平均直徑較正常組顯著減小(P<0.05，表2)，生精上皮細(xì)胞3～4層，生精細(xì)胞數(shù)目減少，精原細(xì)胞層排列有序，初級精母細(xì)胞散在，部分生精細(xì)胞脫落到管腔，偶見精子(圖1j)；間質(zhì)緊密，膠原纖維與血管豐富，間質(zhì)/管腔面積比與正常睪丸無明顯差異(P>0.05，表2，圖1k、圖1l)，但略高于正常組。

a.牦牛正常組睪丸被膜，Masson’s染色，標(biāo)尺示100 μm；b.牦牛正常組睪丸實質(zhì)，HE染色，標(biāo)尺示20 μm；c.牦牛正常組睪丸實質(zhì)，Masson’s染色，標(biāo)尺示100 μm；d.牦牛正常組睪丸實質(zhì)，Gomori’s染色，標(biāo)尺示20 μm；e.牦牛隱睪組睪丸被膜，Masson’s染色，標(biāo)尺示100 μm；f.牦牛隱睪組睪丸實質(zhì)，HE染色，標(biāo)尺示20 μm；g.牦牛隱睪組睪丸實質(zhì)，Masson’s染色，標(biāo)尺示20 μm；h.牦牛隱睪組睪丸實質(zhì)，Gomori’s染色，標(biāo)尺示20 μm；i.牦牛單側(cè)正常組睪丸被膜，Masson’s染色，標(biāo)尺示100 μm；j.牦牛單側(cè)正常組睪丸實質(zhì)，HE染色，標(biāo)尺示20 μm；k.牦牛單側(cè)正常組睪丸實質(zhì)，Masson’s染色，標(biāo)尺示100 μm；l.牦牛單側(cè)正常組睪丸實質(zhì)，Gomori’s染色，標(biāo)尺示20 μm；m.VEGF在牦牛正常組睪丸中的表達(dá)，免疫組化染色，標(biāo)尺示20 μm；n.VEGFR2牦牛正常組睪丸中的表達(dá)，免疫組化染色，標(biāo)尺示20 μm；o.VEGF牦牛隱睪組睪丸中的表達(dá)，免疫組化染色，標(biāo)尺示20 μm；p.VEGFR2牦牛隱睪組睪丸中的表達(dá)，免疫組化染色，標(biāo)尺示20 μm；q.牦牛隱睪組睪丸，陰性對照，標(biāo)尺示20 μm；r.VEGF牦牛單側(cè)正常組睪丸中的表達(dá)，免疫組化染色，標(biāo)尺示20 μm；s.VEGFR2牦牛單側(cè)正常組睪丸中的表達(dá)，免疫組化染色，標(biāo)尺示20 μm；t.牦牛單側(cè)正常組睪丸，陰性對照，標(biāo)尺示20 μm；ST.生精小管；TA.被膜；A.動脈；CV.微血管；CF.膠原纖維；RF.網(wǎng)狀纖維；MC.肌樣細(xì)胞；LC.間質(zhì)細(xì)胞；SC.Sertoli細(xì)胞；S.精原細(xì)胞；PS.初級精母細(xì)胞

a．Thestructureofcapsuleinnormalyaktestis，Masson’sstaining，bar=100μm；b．Thestructureofparenchymainnormalyaktestis，HEstaining，bar=20μm；c．Thestructureofparenchymainnormalyaktestis，Masson’sstaining，bar=100μm；d．Thestructureofparenchymainnormalyaktestis，Gomori’sstaining，bar=20μm；e．Thestructureofcapsuleincryptorchid?ismyaktestis，Masson’sstaining，bar=100μm；f．Thestructureofparenchymaincryptorchidismyaktestis，HEstaining，bar=20μm；g．Thestructureofparenchymaincryptorchidismyaktestis，Masson’sstaining，bar=20μm；h．Thestructureofpa?renchymaincryptorchidismyaktestis，Gomori’sstaining，bar=20μm；i．Thestructureofcapsuleinunilateralnormalyaktestis，Masson’sstaining，bar=100μm；j．Thestructureofparenchymainunilateralnormalyaktestis，HEstaining，bar=20μm；k．Thestructureofparenchymainunilateralnormalyaktestis，Masson’sstaining，bar=100μm；l．Thestructureofparen?chymainunilateralnormalyaktestis，Gomori’sstaining，bar=20μm；m．TheexpressionofVEGFinnormalyaktestis，im?munohistochemicalstaining，bar=20μm；n．TheexpressionofVEGFR2innormalyaktestis，immunohistochemicalstaining，bar=20μm；o．TheexpressionofVEGFincryptorchidismyaktestis，immunohistochemicalstaining，bar=20μm；p．Theex?pressionofVEGFR2incryptorchidismyaktestis，immunohistochemicalstaining，bar=20μm；q．ThecontrolofVEGF/VEG?FR2incryptorchidismyaktestis，bar=20μm；r．TheexpressionofVEGFinunilateralnormalyaktestis，immunohistochemi?calstaining，bar=20μm；s．TheexpressionofVEGFR2inunilateralnormalyaktestis，immunohistochemicalstaining，bar=20μm；t．ThecontrolofVEGF/VEGFR2inunilateralnormalyaktestis，bar=20μm；ST．Seminiferoustubule；TA．Testicularalbuginea；A．Artery；CV．Capillaryvascular；CF．Collagenfiber；RF．Reticularfiber；MC．Muscle?likecell；LC．Leydigcell；SC．Sertolicell；S．Spermatogonia；PS．Primaryspermatocyte圖1 牦牛隱睪、單側(cè)正常睪丸與正常睪丸的組織結(jié)構(gòu)比較Fig．1 Thecomparisonresultsoftheorganizationalstructureofcryptorchidism，unilateralnormaltesticles，normaltesticlesinyak

表2 牦牛隱睪、單側(cè)正常睪丸與正常睪丸生精小管特征指數(shù)比較

Table 2 The comparison of the seminiferous tubule characteristic index of cryptorchidism，unilateral normal testicles，normal testicles in yak

組別Group管腔平均直徑/μmTheaveragediameteroftheseminiferoustubules管腔面積/μm2Bureaucraticarea間質(zhì)面積/μm2Interstitialarea間質(zhì)面積/管腔面積Theratioofinterstitialareaandbureaucraticarea正常組Thenormalgroup263．880±3．560a29796．091±912．670a6202．871±1075．104c0．214±0．039b隱睪組Thecryptorchidismgroup149．519±2．682c?15514．791±969．705c?20484．170±897．278a?1．557±0．376a?單側(cè)正常組Theunilateralnormalgroup205．225±4．799b27862．731±455．800b8136．228±428．837b0．294±0．021b

2.3 VEGF及其受體免疫組織化學(xué)分布特征

正常組睪丸中，VEGF表達(dá)于各級生精細(xì)胞(圖1m)以及Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞，強表達(dá)于長形精子，小血管內(nèi)皮偶見陽性表達(dá)，微血管及肌樣細(xì)胞未見表達(dá)；其受體VEGFR2，同樣表達(dá)于各級生精細(xì)胞(圖1n)，長形精子及Sertoli細(xì)胞，Leydig細(xì)胞強表達(dá)。隱睪組中，VEGF及其受體VEGFR2均表達(dá)于殘存的各級生精細(xì)胞及少數(shù)Sertoli細(xì)胞、Leydig細(xì)胞中(圖1o、圖1p)；且VEGFR2在Leydig細(xì)胞同樣強表達(dá)，在萎縮的生精小管中廣泛強表達(dá)。單側(cè)正常組睪丸表達(dá)與正常組相同(圖1r、圖1s)。

2.4 VEGF及其受體免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果對比分析

免疫組織化學(xué)圖像分析結(jié)果(表3，圖2)顯示，隱睪組VEGF表達(dá)定位與正常組相同，表達(dá)量顯著低于正常組(P<0.05)；VEGFR2表達(dá)顯著高于正常組及單側(cè)正常組(P<0.05)。單側(cè)正常睪丸組，VEGF及VEGFR2表達(dá)情況與正常組無明顯差異，VEGF表達(dá)顯著高于隱睪組(P<0.05)，VEGFR2表達(dá)顯著低于隱睪組(P<0.05)。

表3 牦牛隱睪、單側(cè)正常睪丸及正常睪丸VEGF及其受體VEGFR2平均光密度統(tǒng)計

Table 3 The statistical result of the average optical density of VEGF and VEGFR2 in cryptorchidism，unilateral normal testicles，normal testicles of yak

組別GroupVEGF平均光密度TheaverageopticaldensityofVEGFVEGFR2平均光密度TheaverageopticaldensityofVEGFR2正常組Thenormalgroup0．102±0．002a0．073±0．002b隱睪組Thecryptorchidismgroup0．056±0．012b0．142±0．006a單側(cè)正常組Theunilateralnormalgroup0．096±0．009a0．076±0．007b

標(biāo)有“﹡”的組間差異顯著(P<0.05)“﹡” mean difference between the groups(P<0.05)圖2 VEGF及VEGFR2在牦牛隱睪、單側(cè)正常睪丸及正常睪丸中免疫組織化學(xué)表達(dá)Fig 2 The Immunohistochemistry expression of VEGF and VEGFR2 in cryptorchidism，unilateral normal testicles，normal testicles of yak

2.5 牦牛隱睪、單側(cè)正常睪丸及正常睪丸組織的超微結(jié)構(gòu)特點

正常組睪丸生精小管基膜平整，膠原纖維分布均勻，細(xì)胞發(fā)育良好，細(xì)胞間連接緊密(圖3a)，Sertoli細(xì)胞胞漿內(nèi)有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體(圖3b)，Leydig細(xì)胞發(fā)育成熟，染色質(zhì)顆粒勻細(xì)，核仁致密明顯；血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育良好，管壁平整(圖3c)。隱睪生精小管基膜增厚，上皮細(xì)胞不完整，管腔內(nèi)陷，無生殖細(xì)胞，少數(shù)幼稚型Sertoli細(xì)胞核為多邊形，有一個或多個核仁，異染色質(zhì)集合于核膜不同部分，細(xì)胞內(nèi)變性線粒體和脂褐素含量較多或內(nèi)有大小不等的空泡(圖3d)；間質(zhì)內(nèi)膠原纖維大量增生，Leydig細(xì)胞數(shù)量減少且胞質(zhì)較少，細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹及大小不等的空泡(圖3e)；血管管壁不平整，內(nèi)皮細(xì)胞腫大，內(nèi)含大量脂褐素，血管周圍環(huán)繞大量膠原纖維(圖3f)。單側(cè)正常組睪丸與正常組大致相似，但其Leydig細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞質(zhì)中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富呈一定擴(kuò)張狀態(tài)，線粒體數(shù)量較少，但是個體嚴(yán)重腫脹(圖3g-i)。

3 討 論

隱睪是雄性生殖系統(tǒng)常見的先天性畸形，雙側(cè)或單側(cè)隱睪時睪丸處于高溫、缺血、缺氧等非正常狀態(tài)，進(jìn)而影響生精功能[9]。A.García Guerra等[11]研究表明睪丸重量的增加與生精上皮發(fā)育有直接關(guān)系，其大小可直接或間接反映患畜的生育能力。本研究中同年齡段牦牛隱睪體積及重量均顯著低于正常組，生精細(xì)胞嚴(yán)重缺失；單側(cè)正常組睪丸體積也有所減小，生精細(xì)胞發(fā)育遲緩或處于停滯狀態(tài)，提示隱睪及單側(cè)正常睪丸發(fā)育程度均有所降低。A.Suskind等[12]發(fā)現(xiàn)睪丸纖維化程度與其功能呈負(fù)相關(guān)。本研究隱睪生精小管基膜增厚內(nèi)陷且管徑明顯減??；間質(zhì)組織膠原纖維異常增生，間質(zhì)/管腔面積比較正常組顯著增加，表明隱睪局部有纖維化趨勢。研究報道[13]，缺氧時有機(jī)體局部氧化與抗氧化作用失衡，引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致組織損傷。M.Ott等[14]研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激介導(dǎo)線粒體變性，使其功能受損，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。研究表明[15]，隱睪內(nèi)細(xì)胞增殖/凋亡率降低，生殖細(xì)胞缺失。本研究中隱睪僅存有少數(shù)幼稚型Sertoli細(xì)胞，且細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在大量變性線粒體和脂褐素，表明Sertoli細(xì)胞發(fā)育受阻，可能是誘導(dǎo)生殖細(xì)胞減少的主要原因之一。

a.牦牛正常組睪丸實質(zhì)超微結(jié)構(gòu)，標(biāo)尺示1 μm；b.牦牛正常組睪丸間質(zhì)超微結(jié)構(gòu)，標(biāo)尺示5 μm；c.牦牛正常組睪丸間質(zhì)血管超微結(jié)構(gòu)，標(biāo)尺示1 μm；d.牦牛隱睪組睪丸實質(zhì)超微結(jié)構(gòu)，標(biāo)尺示1 μm；e.牦牛隱睪組睪丸間質(zhì)超微結(jié)構(gòu)，標(biāo)尺示1 μm；f.牦牛隱睪組睪丸間質(zhì)血管超微結(jié)構(gòu)，標(biāo)尺示1 μm；g.牦牛單側(cè)正常組睪丸實質(zhì)超微結(jié)構(gòu)，標(biāo)尺示2 μm；h.牦牛單側(cè)正常組睪丸間質(zhì)超微結(jié)構(gòu)，標(biāo)尺示5 μm；i.牦牛單側(cè)正常組睪丸間質(zhì)血管超微結(jié)構(gòu)，標(biāo)尺示1 μm；F.成纖維細(xì)胞；L.脂褐素；LC.間質(zhì)細(xì)胞；MC.肌樣細(xì)胞；SC.Sertoli細(xì)胞；V.血管；VEC.血管內(nèi)皮細(xì)胞a.The ultrastructure of parenchyma in normal yak testis；bar=1 μm；b.The ultrastructure of leydig in normal yak testis；bar=5 μm；c.The ultrastructure of vascular in normal yak testis；bar=1 μm；d.The ultrastructure of parenchyma in cryptorchidism yak testis，bar=1 μm；e.The ultrastructure of leydig in cryptorchidism yak testis，bar=1 μm；f.The ultrastructure of vascular in cryptorchidism yak testis，bar=1 μm；g.The ultrastructure of parenchyma in unilateral normal yak testis，bar=2 μm；h.The ultrastructure of leydig in unilateral normal yak testis，bar=5 μm；i.The ultrastructure of vascular in unilateral normal yak testis，bar=1 μm；F.Fibroblast；L.Lipofuscin；LC.Leydig cell；MC.Muscle-like cell；SC.Sertoli cell；V.Vascular；VEC.Vascular endothelial cell圖3 牦牛隱睪、正常睪丸及單側(cè)正常睪丸組織的超微結(jié)構(gòu)比較Fig.3 The comparison results of the ultrastructure of cryptorchidism，unilateral normal testicles，normal testicles in yak

研究表明[13]，缺氧引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致組織損傷。此外，氧化應(yīng)激介導(dǎo)并參與血管鈣化，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損[16]。研究顯示[4]，豬隱睪可致睪丸毛細(xì)血管生成或退行性改變，血管內(nèi)皮層增厚進(jìn)而阻礙與間質(zhì)之間的物質(zhì)交換。M.Chihara等[17]發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激能引起小鼠睪丸的鈣化現(xiàn)象，但是耐熱性小鼠睪丸比實驗性小鼠隱睪鈣化程度輕，認(rèn)為睪丸組織鈣化主要與不同品種小鼠機(jī)體內(nèi)鈣化抑制蛋白mRNA水平不同有關(guān)。本研究中隱睪實質(zhì)深部有鈣化現(xiàn)象，生精小管基膜增厚，血管內(nèi)皮細(xì)胞腫大，細(xì)胞內(nèi)脂褐素較多，表明細(xì)胞物質(zhì)交換受阻，且血管明顯減少，造成組織局部嚴(yán)重缺氧、缺血，最終引起營養(yǎng)不良性鈣化，在其他高原動物隱睪是否也存在鈣化現(xiàn)象，或者與高原動物鈣化相關(guān)基因表達(dá)差異有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。

睪丸局部微環(huán)境受到各類細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，VEGF作為內(nèi)皮細(xì)胞特異性強效有絲分裂原，被公認(rèn)為是作用最強的血管通透因子，在體內(nèi)VEGF只有通過與其受體相結(jié)合才能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，VEGFR2是其最主要的受體之一，VEGF以旁分泌形式作用于間質(zhì)血管的VEGFR2，調(diào)節(jié)毛細(xì)血管的通透性，從而參與維持微環(huán)境的穩(wěn)定[7]。本研究中牦牛正常組睪丸各級生精細(xì)胞、Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞均有VEGF及VEGFR2表達(dá)，這與VEGF、VEGFR2在大鼠睪丸中的表達(dá)結(jié)果基本一致[7]，提示VEGF可通過與VEGFR2相結(jié)合，調(diào)節(jié)睪丸內(nèi)分泌活動，為生精細(xì)胞的增殖和分化創(chuàng)造條件。研究發(fā)現(xiàn)[18]，VEGF及其受體可通過刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，血管生成及其內(nèi)皮細(xì)胞遷移，增加血管通透性等在雄性生殖系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果隱睪內(nèi)VEGFR表達(dá)的升高，可能是一種代償性增加，以便充分有效地利用VEGF，其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

大鼠隱睪試驗顯示[9]，單側(cè)隱睪與其對側(cè)正常睪丸存在相似損害，認(rèn)為是隱睪異位的持續(xù)刺激通過生殖股神經(jīng)傳入到對側(cè)交感神經(jīng)中樞，反射性地影響對側(cè)睪丸，進(jìn)而導(dǎo)致其發(fā)生退行性變化，引起雙側(cè)睪丸生精抑制。本研究中單側(cè)正常睪丸發(fā)育遲緩，可能受到對側(cè)隱睪的影響。研究報道[19]，在一些高海拔低氧環(huán)境土著生物中，細(xì)胞線粒體數(shù)目反而減少，長期低氧環(huán)境選擇下機(jī)體會通過提高能量利用效率等措施減少機(jī)體能量消耗。S.Dutta等[20]研究發(fā)現(xiàn)小鼠單側(cè)正常睪丸存在雄激素代償性生理作用；研究表明[21]，雙峰駝隱睪中肽能神經(jīng)對間質(zhì)細(xì)胞的分泌調(diào)控并未明顯改變，有助于維持正常的雄激素分泌。本研究中，單側(cè)正常睪丸Leydig細(xì)胞中線粒體數(shù)量減少，可能是有助于降低Leydig細(xì)胞本身的能量消耗，而Leydig細(xì)胞數(shù)量增加，胞質(zhì)中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富呈一定擴(kuò)張狀態(tài)，可能有增加睪酮分泌進(jìn)而維持睪丸功能的趨勢。超微結(jié)構(gòu)顯示單側(cè)正常組睪丸血管內(nèi)皮細(xì)胞正常發(fā)育，提示血管結(jié)構(gòu)未受明顯影響。M.Tek等[22]發(fā)現(xiàn)VEGF在改善睪丸損傷，減少細(xì)胞凋亡中發(fā)揮顯著作用。本研究單側(cè)正常睪丸生殖細(xì)胞發(fā)育停滯，VEGF及VEGFR2表達(dá)與正常組均無明顯差異，而VEGF明顯高于隱睪組，這與朱保平等[9]發(fā)現(xiàn)在大鼠單側(cè)正常睪丸中VEGF 表達(dá)量增加一致，表明VEGF及其受體可能通過拮抗雙側(cè)睪丸生精抑制作用，對維持一定的生殖機(jī)能具有重要意義。

4 結(jié) 論

高原低氧環(huán)境，牦牛隱睪血管發(fā)育受阻，組織出現(xiàn)不同程度的纖維化和局部鈣化，Sertoli細(xì)胞發(fā)育異常嚴(yán)重影響生精功能；單側(cè)正常睪丸Leydig細(xì)胞數(shù)量增加，而其中線粒體數(shù)量減少，發(fā)育程度較正常組織有所降低，隱睪組織中VEGF與VEGFR2可能通過拮抗雙側(cè)睪丸生精抑制作用，對維持一定的生殖機(jī)能具有重要意義。

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(編輯 白永平)

The Histologic Characteristics of Yak Cryptorchidism

CHEN Guo-juan，YUAN Li-gang*，LI Cong，YAN Zhen-long

(CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China)

The aim of this study was to observe the histologic characteristics of adult yaks cryptorchidism and analyze the influence of plateau environment on the cryptorchidism reproductive microenvironment.Masson’s and Gomori’s staining，histochemistry and transmission electron methods was used to characterize the microstructure and ultrastructure of cryptorchidism，normal testis and unilateral normal testis in yak，and IPP(Image-Pro Plus) statistics method was used to quantitative statistics.The volume and weight of yak cryptorchidism were lesser than the normal testis and companied with depression of the lumen，the basement membrane was thickened，as well as the diameter of seminiferous tubule was significantly reduced(P<0.01).The spermatogenic cells desquamated and immature Sertoli cells were scattered in the tubule.Obviously，there were mitochondria degeneration and many lipofuscin granules with different sizes in the Sertoli cells.Besides，the area ratio of interstitial to lumen was significantly increased(P<0.01)，the numbers of Leydig cells were decreased，and the mitochondria in it was swelling.There were partly calcification was observed in parenchyma and not only the quantity of interstitial vascular was reduced but the vessel wall was thicken and shrunken.The seminiferous epithelium of unilateral normal testis were 3-4 layers with matured Sertoli cells，the primary spermatocytes and spermatozoa were rarely seen，and there was no difference with the normal testis in interstitial/lumen area ratios(P>0.05).The number of Leydig cells increased and the endoplasmic reticulum in it were represented as an loose and vesiculated network and the number of mitochondria were decreased.VEGF and its receptor(VEGFR2) immunoreactivities were abundantly distributed in the gonads of cryptorchidism，normal testis and unilateral normal testis，mainly associated with Sertoli cells，Leydig cells and spermatogenic cells，and weakly present throughout the vascular endothelial cells.Immunostaining analysis appeared that the relative expression of VEGF in cryptorchidism was significantly decreased than in normal testis and unilateral normal testis(P<0.05)，by contrast，the expression of VEGFR2 in cryptorchidism was stronger than the other two groups.But the expression of VEGF and VEGFR2 had no significant difference between the normal and unilateral normal testis(P>0.05).Taken together，in plateau environment，the cryptorchidism vascular of Yak was suffocated，the seminiferous function was seriously affected by the different degree of fibrosis and calcification in parenchyma and the dysplasia of the Sertoli cell；but in unilateral normal testis，companying the number of Leydig cells increased，the number of mitochondria decreased and also growth degree was decreased compared with the normal tissue.Our results suggest that the VEGF and VEGFR2 may serve as regulators to participate in the bilateral testicular spermatogenic suppression effect.

yak；cryptorchidism；immunohistochemistry；VEGF；VEGFR2

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.021

2015-04-02

國家自然科學(xué)基金項目(31160488)；甘肅省自然科學(xué)研究基金(145RJZA223)

陳國娟(1990-)，女，青海湟中人，碩士，主要從事動物解剖與組織胚胎學(xué)研究，E-mail：hopeissnow@163.com，Tel：0931-7631229

*通信作者：袁莉剛，教授，E-mail：yuan2918@126.com

S852.16

A

0366-6964(2015)12-2282-09