耿士忠，陳曉娟，潘志明，焦新安

(揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009)

SG97A平衡致死系統(tǒng)的構(gòu)建及其初步應(yīng)用

耿士忠#，陳曉娟#，潘志明，焦新安*

(揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009)

敲除雞傷寒沙門菌(SG)減毒疫苗株97Aasd基因，構(gòu)建宿主載體平衡致死系統(tǒng)并表達(dá)新城疫病毒(NDV)F蛋白，構(gòu)建二價(jià)活菌苗。PCR擴(kuò)增兩段位于asd基因外側(cè)的序列作為等位基因，以氯霉素抗性(CmR)基因替代asd基因，構(gòu)建自殺質(zhì)粒pGMB151Δasd：：CmR，通過E.coliχ7213與SG97A固相雜交，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入SG97A，反向篩選獲得SG97AΔasd：：CmR，利用質(zhì)粒pCP20去除CmR后，DAP的依賴菌株命名為SG97AΔasd。將含asd基因的質(zhì)粒pYA3334轉(zhuǎn)入SG97AΔasd中構(gòu)建宿主載體平衡致死系統(tǒng)，并表達(dá)NDV-F蛋白。結(jié)果表明，通過等位基因重組方法，成功構(gòu)建SG97AΔasd及宿主載體平衡致死系統(tǒng)，重組菌能夠表達(dá)NDV-F蛋白，并能在雞體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體。本研究成功構(gòu)建SG97AΔasd宿主載體平衡致死系統(tǒng)，并表達(dá)NDV-F蛋白及其誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗體，為應(yīng)用該系統(tǒng)構(gòu)建二價(jià)活菌苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

雞傷寒沙門菌；asd基因； 宿主載體平衡致死系統(tǒng)；NDV-F蛋白

雞傷寒(fowl typhoid)是由雞傷寒沙門菌引起的雞的常見多發(fā)性傳染病，呈急性或慢性敗血癥狀，以肝、脾等實(shí)質(zhì)器官的病變和下痢為特征，主要發(fā)生于成年雞和青年雞，產(chǎn)蛋期母雞對本病最為敏感，蛋雞一旦暴發(fā)雞傷寒，其死亡率急劇上升。該菌除了水平傳播外，也能經(jīng)卵垂直傳遞，帶菌種雞所產(chǎn)種蛋的帶菌率可達(dá)20%～30%，不僅孵化率低，并有死雛病雛，還可污染孵化器、出雛器和育雛室，造成水平傳播擴(kuò)散，使整個(gè)養(yǎng)雞周期呈惡性循環(huán)，給養(yǎng)雞業(yè)帶來的直接和間接損失巨大。減毒雞沙門菌97A是經(jīng)轉(zhuǎn)座突變及粗糙變異方法篩選所獲得，研究結(jié)果表明該減毒株具有較好的安全性和免疫效力，也能顯著地限制強(qiáng)毒株在雞體內(nèi)的定居和增殖[1]。

多價(jià)疫苗和黏膜免疫是未來免疫預(yù)防傳染病的主要方向。利用宿主載體平衡致死系統(tǒng)使沙門菌作為疫苗載體已在醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引起廣泛重視，但目前研究沙門菌載體多為鼠傷寒沙門菌[2-3]，其他沙門菌較為少見。作者以減毒雞沙門菌疫苗株97A為親本菌，敲除asd基因后，構(gòu)建以減毒雞沙門菌疫苗株97AΔasd基因缺失株為宿主和含asd基因的pYA3334質(zhì)粒為載體的宿主載體平衡致死系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)表達(dá)NDV-F蛋白，為構(gòu)建二價(jià)活疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

試驗(yàn)所用的細(xì)菌和質(zhì)粒，見表1。

表1 試驗(yàn)所用的細(xì)菌和質(zhì)粒

Table 1 Bacteria and plasmids used in this study

材料Material名稱Name用途Use來源Source細(xì)菌BacteriaSG97ARecipientOurlabE．coliDH5αHostforpMD18OurlabE．coliχ7213(KmRΔasd)HostforpGMB151OurlabE．coliSpy372(λ?pir)HostforpGMB151Ourlabχ4550(S．typhimurium)STΔasdOurlabE．coliχ6216HostforpGMB151OurlabE．coliχ3730HostforpGMB151tomethylateOurlab質(zhì)粒PlasmidpUC18(AmpR)CloningvectorOurlabpMD18?TCloningvectorTaKaRapKD3IncludingCmRgeneOurlabpGMB151(AmpRSmR)SuicidevectorOurlabpYA3334(asd+)PlasmidofexpressingDAPOurlabpYA3334?dsRED(asd+)PlasmidofexpressingDAPanddsREDOurlab

1.2 主要試劑

用于分子克隆的 Primer STAR HS聚合酶、限制性內(nèi)切酶、連接酶、產(chǎn)物純化試劑盒和膠回收試劑盒均購自TaKaRa公司，羊抗雞HRP-IgG和羊抗鼠HRP-IgG購自Sigma公司，GST-F蛋白及其小鼠抗血清自備。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的沙門菌基因組序列，以軟件Primer5.0設(shè)計(jì)出特異性的引物，如表2所示。引物由南京金思瑞生物有限公司合成。

表2 PCR擴(kuò)增所用的引物序列

Table 2 The primer sets for PCR in this study

目的基因Geneamplified引物名稱Primers引物序列(5′?3′)Primesequences擴(kuò)增片段長度/bpAmpliconsize備注Noteasd12asdp1asdp2TTGGATCCCCGTTGAATGATGATGACCGTTCTCGAGTGCGTTAGGAAGGGAATC1959BamHⅠXhoⅠasd34asdp3asdp4TTCTCGAGGTAGCTTAATCCCGCGGGTATTGGATCCGAGCGTTCATTGTCATCGAC2079XhoⅠBamHⅠasd56asdp5asdp6TTGCTTTCCAACTGCTGAGCTCCTATCTGCGTCGTCCTAC1796(wt)1360(Δasd+CmR)CmRCmFCmRACTCGAGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCACTCGAGATGGGAATTAGCCATGGTCC1032XhoⅠXhoⅠHtohtoFhtoRACTGGCGTTATCCCTTTCTCTGCTGATGTTGTCCTGCCCCTGGTAAGAGA495SalmonellaNDV?FFp1Fp2AACCATGGGAAATGCTGCCAACATCCTCAAGGATCCATCCAAATCGGTCTCTAC594NcoⅠBamHⅠ

1.4 雞傷寒沙門菌減毒株SG97AΔasd缺失株的構(gòu)建

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室所建立的沙門菌基因敲除方法[4-5]，通過擴(kuò)增asd基因上下游1 959和2 079 bp兩個(gè)片段作為同源臂，以便等位基因交換。以CmR替代asd基因，構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒，固相雜交法轉(zhuǎn)移重組自殺質(zhì)粒到雞傷寒沙門菌減毒株97A中獲得單同源臂交叉互換重組菌后，運(yùn)用10%蔗糖和無NaCl培養(yǎng)基及氯霉素篩選DAP生長依賴細(xì)菌，即可以獲得asd基因缺失株，命名為SG97AΔasd。

1.5 宿主載體平衡致死系統(tǒng)的構(gòu)建

將含有asd基因的pYA3334質(zhì)粒及含有紅色熒光蛋白基因(dsRED)的pYA3334-dsRED質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到χ4550和SG97AΔasd中，構(gòu)建宿主載體平衡致死系統(tǒng)，觀察重組菌對DAP的生長依賴性及外源紅色熒光蛋白基因表達(dá)。

1.6 宿主載體平衡致死系統(tǒng)表達(dá)NDV-F基因

1.6.1 構(gòu)建表達(dá)NDV-F基因宿主載體平衡致死系統(tǒng) PCR擴(kuò)增含NDV-F基因，克隆測序后，亞克隆到pYA3334(asd+)質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)NcoⅠ和BamHⅠ間，形成重組質(zhì)粒pYA3334-F。經(jīng)宿主菌E.coliχ6212及中間宿主E.coliχ3730(甲基化重組質(zhì)粒)后，再轉(zhuǎn)化至終末宿主減毒雞傷寒沙門菌SG97AΔasd缺失株及χ4550，形成重組菌SG97A(pYA3334-F)和χ4550(pYA3334-F)。1.6.2 重組質(zhì)粒pYA3334-F在SG97AΔasd和χ4550中的表達(dá) 分別取OD600 nm=1.0的重組沙門菌χ4550(pYA3334-F)、SG97A(pYA3334-F)及空載體菌χ4550(pYA33340)和SG97AΔasd(pYA3334)各1 mL，12 000 r·min-1離心2 min，棄上清，沉淀用PBS洗滌3次后，加50 μL的ddH2O重懸，加等體積的2 ×上樣緩沖液，煮沸5 min，各取20 μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳；并以χ4550表達(dá)的F蛋白割膠免疫法制備小鼠抗血清作Western blotting分析。

1.6.3 重組菌免疫接種雛雞 以重組菌SG97AΔasd(pYA3334-F) 免疫接種10日齡雛雞，3組，10羽·組-1，1×109CFU·羽-1，肌肉注射免疫3次，中間間隔2周。各免疫組免疫后第12 天采血，制備血清，-20 ℃保存。同時(shí)設(shè)SG97AΔasd(pYA3334)陰性對照組和PBS空白對照組。

1.6.4 抗體效價(jià)的測定 GST-F蛋白經(jīng)純化后包被ELISA板，20 μg·孔-1，4 ℃包被過夜，PBST洗滌3次；加入含10% BSA的封閉液，200 μL·孔-1，4 ℃封閉過夜后，PBST洗滌5次；加入各免疫組血清，同時(shí)設(shè)立陰性血清對照和PBS空白對照，37 ℃作用3 h后，PBST洗滌3次；加入HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG抗體(工作濃度1∶10 000)，37 ℃作用1 h后，PBST洗滌4次；加入底物OPD，37 ℃避光顯色15 min，用2 mol·L-1H2SO4終止后測OD492 nm值。

2 結(jié) 果

2.1 雞傷寒沙門菌減毒株SG97AΔasd的構(gòu)建

asdp1/p2擴(kuò)增出約2 kb基因片段asd12，asdp3/p4擴(kuò)增出約2 kb基因片段asd34，asdp5/p6能擴(kuò)增出SG97AΔasd約1.4 kb基因片段，而野生菌(wt)則擴(kuò)增出1.84 kb基因片段；CmF/CmR能擴(kuò)增出1.0 kbCmR基因，親本株SG97A則不能被擴(kuò)增(圖1)。結(jié)果顯示通過多對引物PCR鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物都與預(yù)期的大小一致，表明雞傷寒沙門菌減毒株SG97AΔasd被成功構(gòu)建，且通過特異性引物htoF/htoR PCR證實(shí)該菌為雞傷寒沙門菌(圖2)。

M.DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1,3,5,7.SG97AΔasd;2,4,6,8.SG97A;1,2.asdP1/P2 PCR;3,4.asdP3/P4 PCR;5,6. asdP5/P6 PCR;7,8.CmF/CmR PCRM.DL2000 DNA marker;1,3,5,7.SG97AΔasd;2,4,6,8.SG97A;1,2.asdP1/P2 PCR;3,4.asdP3/P4 PCR;5,6.asdP5/P6 PCR;7,8.CmF/CmR PCR圖1 SG97AΔasd缺失株的PCR鑒定Fig.1 PCR identification of SG97AΔasd

M. DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1. 野生菌; 2、3. SG97AΔasd; 4. ddH2O對照M. DL2000 DNA marker; 1. wt; 2, 3. SG97AΔasd; 4. ddH2O control圖2 SG97A沙門菌屬特異性鑒定Fig.2 PCR identification of Salmonella

2.2 宿主載體平衡致死系統(tǒng)的構(gòu)建

根據(jù)asd基因表達(dá)產(chǎn)物特性，SG97AΔasd對二氨基庚二酸(DAP)生長依賴，圖3中顯示SG97AΔasd在含DAP培養(yǎng)基上能生長(A)，而在無DAP培養(yǎng)基上則不能生長(B)。同樣，轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒pYA3334的SG97AΔasd在無DAP的培養(yǎng)基上則能生長，而沒有轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pYA3334的SG97AΔasd則不能在無DAP的培養(yǎng)基上生長。兩個(gè)結(jié)果都說明SG97AΔasd對DAP具有生長依賴性。通過將能夠表達(dá)紅色熒光蛋白的pYA3334-dsRED質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入SG97AΔasd，互補(bǔ)細(xì)菌中能夠表達(dá)外源基因(A)，顯現(xiàn)紅色熒光；而僅轉(zhuǎn)化pYA3334的質(zhì)粒則無熒光出現(xiàn)(B)(圖4)。

圖3 SG97AΔasd在LB+DAP平板(A)和LB平板(B)上的生長情況Fig.3 The growth of SG97A Δasd on LB with DAP (A) or without DAP (B)

2.3 宿主載體平衡致死系統(tǒng)的生長特性及其穩(wěn)定性

如圖5所示，轉(zhuǎn)化pYA3334質(zhì)粒的SG97AΔasd缺失株形成載體宿主互補(bǔ)的平衡致死系統(tǒng)后，互補(bǔ)菌生長速度與SG97AΔasd缺失株相當(dāng)，與野生菌的生長速度有顯著的差別。通過FACS測定轉(zhuǎn)化了pYA3334-dsRED質(zhì)粒的SG97AΔasd能觀察紅色熒光蛋白的表達(dá)，第100代載體宿主互補(bǔ)菌與第50代和第1代的細(xì)菌差異不大(圖6)，說明載體宿主之間能夠形成的平衡致死系統(tǒng)有良好的穩(wěn)定性。

A. SG97AΔasd (pYA3334-dsRED)；B. SG97AΔasd (pYA3334)圖4 SG97AΔasd互補(bǔ)細(xì)菌表達(dá)紅色熒光Fig.4 Red fluorescence expressed by SG97AΔasd(pYA3334-dsRED)

圖5 SG97AΔasd缺失株生長曲線Fig.5 The growth curves of SG97A and SG97AΔasd

圖6 FACS測定不同代次SG97A Δasd (pYA3334-dsRED)中dsRED的穩(wěn)定性Fig.6 The stability of SG97A Δasd (pYA3334-dsRED) by FACS analysis

2.4 利用SG97AΔasd宿主載體平衡致死系統(tǒng)表達(dá)新城疫病毒F基因

2.4.1 表達(dá)質(zhì)粒重組菌的構(gòu)建 PCR擴(kuò)增新城疫病毒(NDV)F基因，克隆測序正確后，亞克隆入pYA3334載體限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)NcoⅠ和BamHⅠ間，構(gòu)建宿主平衡致死系統(tǒng)表達(dá)質(zhì)粒pYA3334-F，經(jīng)感受態(tài)E.coliχ6212擴(kuò)增，及中間宿主E.coliχ3730完成重組質(zhì)粒的甲基化過程后，重組質(zhì)粒pYA3334-F轉(zhuǎn)化χ4550和SG97AΔasd，分別命名為χ4550(pYA3334-F)和SG97AΔasd(pYA3334-F)。

2.4.2 重組菌χ4550(pYA3334-F)和SG97AΔasd(pYA3334-F)的Western blotting鑒定 新城疫病毒F蛋白能夠在重組菌χ4550(pYA3334-F)中正確表達(dá)，約20 kd(圖7)。但是在重組菌SG97AΔasd(pYA3334-F)表達(dá)產(chǎn)物約40 ku，為理論值的2倍(圖8A)，Western blotting分析顯示該表達(dá)產(chǎn)物能與小鼠F蛋白抗血清特異性反應(yīng)(圖8B)。

2.4.3 重組沙門菌SG97AΔasd(pYA3334-F)誘導(dǎo)的F蛋白抗體測定結(jié)果 SG97AΔasd(pYA3334-F)以1×109CFU·羽-1的劑量肌注免疫雛雞，SG97AΔasd(pYA3334)作為陰性對照，分別在二免及三免后第12天采血，制備血清。間接ELISA結(jié)果顯示在雞二免后血清內(nèi)檢測到抗NDV-F蛋白的抗體，平均抗體效價(jià)為1∶200；三免后平均抗體效價(jià)為1∶400(圖9)。

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1.χ4550 (pYA3334-F); 2. χ4550 (pYA3334)M.Protein marker;1.χ4550 (pYA3334-F);2.χ4550 (pYA3334)圖7 χ4550 (pYA3334-F)的SDS-PAGE鑒定Fig.7 SDS-PAGE identification of χ4550 (pYA3334-F)

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.SG97AΔasd (pYA3334-F);2.SG97AΔasd (pYA3334)M.Protein marker;1.SG97AΔasd (pYA3334-F);2.SG97AΔasd (pYA3334)圖8 SG97AΔasd (pYA3334-F)的SDS-PAGE(A)及Western blotting(B)鑒定Fig.8 SDS-PAGE(A) and Western blotting(B) identification of SG97AΔasd (pYA3334-F)

圖9 間接ELISA檢測雞血清中抗NDV-F抗體滴度Fig.9 The titers of anti-NDV-F antibody in chicken sera by indirect ELISA

3 討 論

多價(jià)苗由于免疫后同時(shí)獲得對多種病原的免疫保護(hù)，減少對動(dòng)物的應(yīng)激，省時(shí)省力而備受青睞。1988年，宿主載體平衡致死系統(tǒng)首次被報(bào)道應(yīng)用于重組減毒沙門菌疫苗(recombinant attaunatedSalmonellavaccines，RASVs)。此系統(tǒng)能夠確保編碼外源基因的重組質(zhì)粒在重組菌免疫宿主后的穩(wěn)定性，避免抗生素耐藥基因的使用[6]。以減毒沙門菌作為載體構(gòu)建雙價(jià)或多價(jià)活疫苗，是目前研制新型疫苗的重要途徑之一。所構(gòu)建的重組減毒沙門菌可經(jīng)口服免疫、鼻內(nèi)免疫[7-8]和直腸免疫[9]等多種途徑免疫，在機(jī)體內(nèi)表達(dá)特異抗原[10]誘導(dǎo)獲得體液免疫、細(xì)胞免疫及黏膜免疫[11-12]，提供對細(xì)菌[13]、寄生蟲[14]和病毒[15]感染的保護(hù)作用。

當(dāng)前減毒鼠傷寒沙門菌χ4550(Δasd)是宿主載體平衡致死系統(tǒng)研究較多的工程菌，有學(xué)者應(yīng)用攜帶能編碼乙肝病毒核心抗原質(zhì)粒的χ4550菌株經(jīng)胃腸道免疫小鼠后，誘導(dǎo)出了較長久的黏膜保護(hù)性抗體[16-17]，表明減毒鼠傷寒沙門菌χ4550作為口服疫苗載體具有應(yīng)用價(jià)值。以其他血清型沙門菌為疫苗載體的研究也在研究嘗試中，如豬霍亂沙門菌[18]、雞白痢沙門菌[2]、遲鈍愛德華菌[19]。本研究則利用已有的減毒雞傷寒沙門菌97A，通過缺失其asd基因成功構(gòu)建宿主載體平衡致死系統(tǒng)，并表達(dá)外源蛋白，誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫。

在研究中，作者發(fā)現(xiàn)pYA3334-F 質(zhì)粒在χ4550內(nèi)表達(dá)F蛋白與理論值一樣，但在SG97AΔasd中體外表達(dá)蛋白質(zhì)大小是理論值的2倍，Western blotting分析顯示其能夠與鼠源F蛋白抗血清特異反應(yīng)，SG97A(pYA3334-F)以1×109CFU·羽-1的劑量肌注免疫雛雞，陽性血清二免平均抗F抗體效價(jià)為1∶200，三免平均抗F抗體效價(jià)為1∶400，該結(jié)果說明pYA3334-F在減毒雞傷寒沙門菌SG97AΔasd中表達(dá)了外源F蛋白，但2倍于理論值大小的原因不詳，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

成功構(gòu)建SG97AΔasd宿主載體平衡致死系統(tǒng)，能夠表達(dá)NDV-F蛋白并誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗體，為應(yīng)用該系統(tǒng)構(gòu)建沙門菌二價(jià)活菌苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

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(編輯 白永平)

Construction and Preliminary Application of Balanced Lethal System Based on AttenuatedSalmonellaSG97A

GENG Shi-zhong#，CHEN Xiao-juan#，PAN Zhi-ming，JIAO Xin-an*

(JiangsuKeyLaboratoryofZoonoses，JiangsuCo-InnovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China)

The aim of this study was to deleteasdgene ofSalmonellagallinarum(SG) attenuated vaccine strain 97A and construct bivalent live vaccine based on host-vector balanced lethal system to express F protein of Newcastle disease virus(NDV).Two DNA fragments flankingasdgene as allele were amplificated by PCR andasdgene was replaced by chloramphenicol resistance(CmR) gene to construct the suicide plasmid pGMB151Δasd：：CmR.After conjugation，the recombiant plasmid was transformed into SG97A fromE.coliχ7213，SG97AΔasd：：CmRwas reversely screened out under the selectable pressure of chloramphenicol，DAP-dependent strain was named SG97AΔasd.Vector-host balanced lethal system was construct by pYA3334 containingasdgene being transferred into SG97AΔasdand to expressed F protein of NDV.SG97AΔasdwas successfully constructed by allelic exchanges，its growth was DAP-dependent.Vector-host balanced lethal system was constructed by pYA3334 being transferred to SG97AΔasd and could express F protein of NDV and also induce specific antibodies in infected chickens.Vector-host balanced lethal system was constructed successfully based on attenuatedSalmonellaSG97AΔasdin this study and could expressFgene of NDV as foreign gene to induce special antibodies in animal model，it laid a foundation for bivalent live vaccine based on attenuatedSalmonella.

Salmonellagallinarum(SG)；asdgene；vector-host balanced lethal system；NDV-F protein

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.016

2015-04-13

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))項(xiàng)目(201403054)；“863”項(xiàng)目(2011AA10A212)；中國博士后基金(2014M551670)；江蘇省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(0273896034819)；江蘇省博士后基金(1302067C)；揚(yáng)州大學(xué)創(chuàng)新培育基金(2013CXJ070)

耿士忠(1972-)，男，江蘇高郵人，副教授，博士，主要從事沙門菌致病機(jī)制研究及疫苗開發(fā)，Tel：0514-87971136，E-mail：gszzsg115@163.com。耿士忠、陳曉娟對本文貢獻(xiàn)相同

*通信作者：焦新安，教授，E-mail：jiao@yzu.edu.cn

S852.612

A

0366-6964(2015)12-2243-08