滑 翔，胡中凱，黃小波，文心田，曹三杰*，文翼平，伍 銳，鄧 靜，趙 松，尹人杰，常曉霞，歐陽達，張 仙

(1.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，豬病研究中心/動物傳染病與基因芯片室，成都 611130；2.崇州市農(nóng)村發(fā)展局，崇州 611200)

檢測豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬輪狀病毒的cDNA芯片的構建

滑 翔1，胡中凱1，黃小波1，文心田1，曹三杰1*，文翼平1，伍 銳1，鄧 靜1，趙 松1，尹人杰2，常曉霞1，歐陽達1，張 仙1

(1.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，豬病研究中心/動物傳染病與基因芯片室，成都 611130；2.崇州市農(nóng)村發(fā)展局，崇州 611200)

豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬輪狀病毒(PoRV)是三種常見的仔豬病毒性腹瀉病原，作者擬構建可同時檢測三種病原的cDNA基因芯片。分別根據(jù)PEDV基因(S、M)、TGEV基因(S、N)、PoRV基因(VP7、NSP4)的保守區(qū)設計引物擴增靶基因，進行PEDV-TGEV-PoRV的cDNA陣列設計，建立了擴增標記探針的多重PCR方法，并對所構建cDNA芯片的特異性、靈敏性、重復性進行了評價。確定了該cDNA芯片的陽性判斷標準：SNR大于或等于2.0(或信號強度中位值大于等于1 500)。PEDV-TGEV-PoRV診斷cDNA芯片具有良好的特異性，該芯片不與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬乙型腦炎病毒、豬偽狂犬病病毒發(fā)生交叉反應；芯片的最低檢測質(zhì)量濃度為20 pg·μL-1；同一張芯片可重復使用至少7次。本研究為鑒別三種仔豬病毒性病的鑒別診斷提供了新的高通量檢測技術。

豬流行性腹瀉病毒；豬傳染性胃腸炎病毒；豬輪狀病毒；cDNA芯片；構建

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis of swine，TGEV)和豬輪狀病毒(porcine rotavirus，PoRV)是三種最常見的可引起仔豬腹瀉的病毒，自2010年以來，以PEDV感染為主的仔豬病毒性腹瀉已成為引起我國養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟損失的最主要原因之一[1]，同時豬傳染性胃腸炎病毒和輪狀病毒也是經(jīng)常檢出的病原。這三種仔豬病毒性腹瀉病經(jīng)常存在混合感染，臨床鑒別診斷較困難，因為其發(fā)病癥狀比較相似[2]，主要癥狀均表現(xiàn)為嘔吐、水樣噴射腹瀉和脫水等，特別是哺乳仔豬發(fā)病嚴重且死亡率高[3-4]。因此，臨床上對這三種仔豬腹瀉病進行鑒別診斷非常重要。目前檢測這三種仔豬病毒性腹瀉的方法有病毒分離鑒定、環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、免疫熒光法(IFA)、病毒中和試驗(VNT)、RT-PCR、實時熒光PCR等。然而，這些診斷方法都有一定的局限性，例如病毒分離不易成功且費時費力，血清學檢測靈敏性低，檢測過程中容易出現(xiàn)交叉反應。RT-PCR技術檢測的樣本數(shù)量有限，無法實現(xiàn)高通量樣品的快速檢測[5]。這些檢測技術的共同缺陷是無法同時對大量臨床樣品進行快速鑒別診斷，因此急需一種高通量診斷技術來鑒別診斷三種仔豬病毒性腹瀉病。

基因芯片技術是近年來迅速發(fā)展起來的一門新技術。在基片上點陣排列一系列靶基因，與熒光素等標記的探針分子在同一條件下進行核酸雜交，經(jīng)過共聚焦激光掃描儀掃描、利用數(shù)據(jù)分析軟件獲得雜交結果。芯片技術具有自動化、平行性和高通量等潛在優(yōu)勢，能同時對多種疾病進行檢測，因此它廣泛應用于生命科學各領域[6-9]，在動物疫病研究方面(如病毒檢測)也有大量報道[10-12]。針對當前我國仔豬病毒性腹瀉發(fā)病嚴重的現(xiàn)狀，作者選取PEDV、TGEV和PoRV的保守基因，設計了可同時檢測三種病毒的cDNA芯片，擬建立聯(lián)合檢測這三種病毒的cDNA芯片技術，為仔豬病毒性腹瀉的高通量快速檢測提供了新的技術。

1 材料與方法

1.1 病毒株與重組質(zhì)粒

TGEV、PEDV、PoRV均由四川農(nóng)業(yè)大學豬病研究中心分離并保存。pMD-TS重組質(zhì)粒、pMD-TN重組質(zhì)粒、pMD-PS重組質(zhì)粒、pMD-PM重組質(zhì)粒、pMD-VP7重組質(zhì)粒、pMD-NSP4重組質(zhì)粒，均由四川農(nóng)業(yè)大學豬病研究中心構建并保存。

1.2 主要試劑和儀器

反轉錄試劑盒、λDNA均購自寶生物(大連)生物科技有限公司；氯仿、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純試劑；質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒均為OMEGA公司產(chǎn)品；總RNA提取試劑盒均購自天根科技(北京)有限公司；Baio? 氨基載玻片、Baio? 2×點樣緩沖液、Baio?預雜交緩沖液、Baio?雜交緩沖液均購自上海百傲科技有限公司；Cy3-dCTP，PA53 021，Lot300 989，Amersham Biosciences，UK；芯片點樣系統(tǒng)：Capitalbio Corporation，芯片掃描儀：Capitalbio Corporation購自北京博奧生物公司。

1.3 引物設計

利用DNAMAN軟件對GenBank上的TGEV、PEDV、PoRV毒株基因序列進行分析，分別針對TGEV的S、N基因，PEDV的S、M基因和PoRV的VP7、NSP4基因的保守序列，利用Primer5.0軟件設計引物，擴增的探針大小在200～500 bp(引物序列參見表1)。定位基因則參照曹三杰的方法[12]，以PCR擴增，獲得長度約為500 bp的λDNA目的片段。

1.4 重組探針質(zhì)粒菌的復蘇與鑒定

將含靶基因的重組質(zhì)粒菌在LB液體培養(yǎng)基(含100 μg·mL-1的Amp)中復蘇培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，質(zhì)粒50倍稀釋后取2 μL作為PCR模板，擴增體系：10×PCR Buffer(Mg2+free)5.0 μL、MgCl2(25 mmol·L-1) 4.0 μL、dNTP Mixture(各2.5 mmol·L-1) 4.0 μL、特異性引物2.0 μL、質(zhì)粒DNA 2.0 μL、TaqDNA酶0.5 μL、去離子水補足50.0 μL，反應程序：94 ℃2 min；94 ℃30 s；54 ℃30 s；72 ℃30 s，共37個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

表1 探針引物及擴增相關信息

Table 1 Information of primers for probe and length of fragment

基因名稱Genename引物序列Sequencesofprimers擴增片段長度/bpThelengthoffragmentPEDV?M上游：5′?CTTATGGCTTGCATCACT?3′下游：5′?GCACTTTCTCGCTATCTG?3′421PEDV?S上游：5′?CGCTAGGCTTGAGTCTGTTG?3′下游：5′?AATTGCTGGTTCCGCTGTAG?3′474TGEV?N上游：5′?TTCCTGAAAGGTGGTTCTTCTACTA?3′下游：5′?TTTTCTGTGTCAACACCTAACTTT?3′362TGEV?S上游：5′?AGGCTTGACGAATTGAGTGCTGATG?3′下游：5′?AGTTTCATAAGCCGTTGGTAATAGC?3′276PoRV?NSP4上游：5′?GAACAGGTTACTACTAAGGATG?3′下游：5′?TCACATAGACGCAGTTACTTCC?3′270PoRV?VP7上游：5′?TTGAATGAATGGCTATGTAATCC?3′下游：5′?ACGCATCATTCTTTCAGTTTGT?3′381λDNA(AY319651)上游：5′?AAAGCGACGCAATGAGGCACT?3′下游：5′?GTTCCACGACCGCAACTGC?3′500

1.5 cDNA芯片的制備

利用接觸式點樣系統(tǒng)點制芯片，芯片的基片為氨基玻片。將制備的探針和定位基因稀釋至200～300 μg·mL-1，加入等體積點樣緩沖液。根據(jù)芯片設計的陣列，按順序向96孔載樣板孔內(nèi)加入探針和定位基因，第一排及最后一排點為定位基因，其余各排點為相應的探針和空白對照，每排9個樣點，各樣點的中心距設置為500 μm，樣點的直徑設置為220 μm，點樣環(huán)境的濕度設置在35%以上，溫度為25～30 ℃。將點制好的芯片靜置于點樣儀上徹底干燥后，于60 ℃水合處理10 s，紫外交聯(lián)30 min，預熱0.2% SDS溶液洗滌5 min，蒸餾水快速洗滌后，1 500 r·min-1離心徹底干燥，真空密封后置4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 cDNA芯片雜交

將制備好的cDNA芯片于100 ℃水浴變性5 min，立即置預冷的95%乙醇，上下抽提10次，1 500 r·min-1離心干燥。放入雜交盒中并蓋上蓋片，于蓋片上點樣孔向各個點樣區(qū)緩慢加入50 μL的預雜交緩沖液，將雜交盒置于濕盒中，雜交儀中46 ℃下預雜交1.5 h。將制備好的靶基因95 ℃變性5 min，置于冰中冷卻5 min，加入等倍體積預冷雜交緩沖液，混勻后，吸棄芯片上預雜交液，吸取60 μL混勻靶基因溶液，加于芯片點樣區(qū)，蓋片并避光，濕盒中48 ℃下雜交6 h。雜交結束后，在暗室分別用預熱的洗滌液1、洗滌液2和洗滌液3中各浸泡4～5 min，裝于塑料玻片盒，以1 000 r·min-1離心干燥。

1.7 cDNA芯片的掃描分析

利用掃描儀對雜交后的芯片進行結果掃描。掃描參數(shù)設置為PMT Gain 650，Laserpower 65%，分辨率為20 μm。掃描結束后，使用數(shù)據(jù)分析軟件(LuxScan3.0)分析掃描結果。本研究選取每個基因的9個樣點信號強度中位值的平均值和信噪比(雜交斑點信號中位值與斑點背景信號中位值之比)對雜交結果進行數(shù)據(jù)分析。

1.8 cDNA芯片的質(zhì)量檢測

隨機挑選構建的cDNA芯片利用定位基因λDNA進行芯片質(zhì)量檢測。按程序依次進行預雜交、雜交、洗滌，結果掃描和數(shù)據(jù)分析。

1.9 探針的多重PCR標記方法的建立與優(yōu)化

以病毒cDNA為模板，建立多重PCR方法，并對引物濃度及比例、Tm值、TaqE濃度、MgCl2濃度、dNTP Mixture與Cy3-dCTP的濃度以及循環(huán)數(shù)等條件進行優(yōu)化。反應體系中依次加入10×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl21.5 μL，dNTP Mixture 2.0 μL，引物對混合物3.0 μL，cDNA模板2.0 μL，TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)0.25 μL，去離子水加至25 μL。反應條件：95 ℃4 min；93 ℃1 min；52 ℃1 min；72 ℃2 min；72 ℃延伸10 min，產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.10 cDNA芯片的特異性試驗

用cDNA芯片探針引物擴增并標記PRRSV、CSFV、JEV、PoRV、PEDV、TGEV的模板來制備靶基因，分別利用制備好的芯片進行檢測并進行數(shù)據(jù)的分析與處理。

1.11 cDNA芯片的靈敏性試驗

選擇PEDVM基因測定芯片的靈敏性：用雜交緩沖液將M靶基因稀釋成3×100～3×104pg·μL-1，各取60 μL分別加于芯片的雜交區(qū)，在46 ℃下雜交6 h，掃描信號，進行數(shù)據(jù)分析。

1.12 同張檢測cDNA芯片的重復使用試驗

以PEDV-M作為靶基因與同一張芯片進行7次雜交，雜交后進行試驗結果的掃描分析，變性除去雜交熒光，再以PEDV-M基因探針與其雜交，共雜交7次，觀察該芯片的重復使用效果。

2 結 果

2.1 探針基因多重PCR標記條件優(yōu)化結果

最終優(yōu)化后的反應體系如下：Tm54 ℃，dNTP(10 μmol·μL-1)3.5 μL，MgCl2(25 μmol·μL-1)3.0 μL，TaqE(2.5 U·μL-1)0.55 μL，三對引物按2∶1∶1(NSP4∶TN∶PM)和1∶2∶1(PS∶TS∶VP7)的比例混勻后加入3.0 μL，加水補齊25 μL。反應程序94 ℃2 min；95 ℃30 s；54 ℃30 s；72 ℃30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應完畢后，取6.0 μL產(chǎn)物進行電泳分析，結果如圖1。多重PCR標記條件優(yōu)化后，雜交結果如圖2。

2.2 cDNA芯片的特異性試驗

分別用PRRSV、CSFV、JEV、PRV、PoRV、PEDV、TGEV等病毒檢測PEDV-TGEV-PoRV cDNA芯片的雜交特異性。PRRSV、PRV、CSFV和JEV的雜交檢測結果顯示除定位基因(圖3第一、九排)雜交斑點清晰可見外，無雜交熒光斑點，結果顯示陰性。PEDV、TGEV、PoRV則在除定位基因(圖3第一、九排)雜交斑點清晰可見外，在相應的診斷位置出現(xiàn)明顯的雜交熒光斑點，結果顯示陽性，結果如圖3。

M.100 bp DNA相對分子質(zhì)量標準；1.PM；2.PS；3.TN；4.TS；5.NSP4；6.VP72；7.陰性對照M.100 bp marker；1.PM；2.PS；3.TN；4.TS；5.NSP4；6.VP72；7.Negative control圖1 多重PCR標記條件優(yōu)化結果Fig.1 Multiple PCR marker conditions optimization results

圖2 多重PCR標記條件優(yōu)化雜交結果Fig.2 Multiple PCR conditions optimization hybridization results

2.3 cDNA芯片的靈敏性試驗

用核酸蛋白儀測得靶基因的OD260 nm，換算成DNA濃度。按操作步驟進行梯度稀釋，稀釋后的質(zhì)量濃度分別為3、10、20、50、100、200、500、1 000、10 000 pg·μL-1。探針DNA質(zhì)量濃度在20 pg·μL-1時，基因雜交信號的中位值均大于1 500，且SNR大于1.5，可知cDNA芯片最低檢測質(zhì)量濃度為20 pg·μL-1，結果如圖4。

2.4 cDNA芯片重復性試驗結果

以PEDVM基因為例作為靶基因，進行單張芯片的重復使用試驗。取一張芯片雜交后，掃描獲取雜交結果，將該芯片變性消除雜交斑點，再將變性后的芯片用相同的探針進行第二次雜交，同樣掃描獲取雜交結果，如此重復七次。同一張芯片重復使用結果見圖5。從圖5可看出，該張芯片可重復使用至少七次，但是隨著使用次數(shù)的不斷增加，結果雖然仍呈陽性，但雜交信號值以及SNR值卻不斷減弱，背景值也隨雜交次數(shù)的增加而不斷增強。

a.PoRV檢測結果；b.PEDV檢測結果；c.TGEV檢測結果；d.PRRSV檢測結果；e.CSFV檢測結果；f.JEV檢測結果；g.PRV檢測結果a.PoRV detection result；b.PEDV detection result；c.TGEV detection result；d.PRRSV detection result；e.CSFV detection result；f.JEV detection result；g.PRV detection result圖3 特異性試驗結果Fig.3 The specificity of the cDNA microarray assay

圖4 靈敏性試驗結果Fig.4 The sensitivity of the cDNA microarray assay

圖5 單張芯片重復使用結果Fig.5 The repeated use of a single chip

2.5 樣本檢測結果

收集來自綿陽、阿壩茂縣、彭州、資陽安岳、眉山、廣安、攀枝花、巴中通江50份有腹瀉癥狀且30 d以下的仔豬小腸。以及檢測出有PEDV、TGEV、PoRV感染的41份相應仔豬小腸內(nèi)容物作為芯片臨床應用研究。RNA提取步驟按照總RNA提取試劑盒說明書完成，反轉錄后將得到的cDNA產(chǎn)物通過多重PCR標記進行靶基因擴增后，與芯片雜交，掃描分析數(shù)據(jù)。同時將cDNA產(chǎn)物按照常規(guī)PCR擴增，凝膠電泳分析結果。

表2 50份小腸樣品的檢測結果

Table 2 The detection rusult of 50 samples

感染類型Infectiontype常規(guī)RT?PCRRoutineRT?PCRcDNA芯片cDNAchip陽性數(shù)/樣品數(shù)Positivenumber/samplenumber感染率/%Infectionrate陽性數(shù)/樣品數(shù)Positivenumber/samplenumber感染率/%InfectionratePEDV36/507237/5074TGEV3/5063/506PEDV+PoRV2/5042/504PEDV、TGEV、PEDV+PoRV41/508242/5084

3 討 論

基因芯片的載體主要包括玻璃片、硅片、尼龍膜片等多種材料[13]，其中玻璃基片價格便宜、制作簡單、應用方便、熒光背景值較低、耐高溫以及高離子強度的洗滌，而且玻片少孔，疏水性較強，大大減少了雜交液的使用量，同時又能夠提高芯片的雜交效率[14]。本研究中制備得到的PEDV-TGEV-PoRV cDNA芯片是采用了氨基硅化處理過的氨基化玻片作為芯片的載體基片，制得了雜交信號穩(wěn)定，能夠長期保存使用的基因芯片。

核酸熒光標記分為間接標記和直接摻入法、Klenow聚合酶法及一些非熒光標記法[15-16]。其中間接標記法靈敏度高，但步驟較多，且標記后需要對標記產(chǎn)物進行純化，增加了成本。Klenow聚合酶隨機引物標記法中隨機PCR存在非特異擴增，其靈敏度和特異性將會受到影響[17]。本研究中的標記物為熒光素是由本實驗室采用的cDNA芯片掃描設備所決定的，探針是采用PCR擴增標記方法是因為在酶促反應中完成樣品靶基因的特異性PCR擴增的同時，完成熒光標記，從而能夠提高了芯片檢測的特異性與靈敏度。文思遠等[18]比較了三種基于PCR擴增的熒光標記方法：一種標記方法是采用了熒光分子標記引物進行標記，即熒光分子化學合成在引物的5′端；第二種則是在PCR反應體系中加入熒光分子修飾過的核苷酸，通過PCR反應將其摻入到DNA片段當中；而第三種方法則是利用非模板依賴性的酶促加尾反應，在DNA片段的3′末端隨機加入經(jīng)熒光素修飾過的核苷酸[18]。發(fā)現(xiàn)三種方法的標記效率基本一致，但是熒光標記引物的合成與保存則較為繁瑣，而采用不對稱PCR擴增方法進行標記的方法時，則需要不斷摸索上下游引物的最佳比例，而酶促加尾反應則需要較為嚴格的反應條件[19]。本研究最終參照曹三杰等[11]在PCR反應過程中加入Cy3-dCTP取代dCTP，從而將熒光素Cy3摻入到PCR產(chǎn)物中。這主要是因為Cy3的分子量和空間位阻較大，所以只能使用Cy3-dCTP部分取代dCTP，才能夠使PCR反應順利完成。

靶基因的連接與探針的固定是構建基因芯片的首要條件。基于Northern印跡法中的探針和靶基因的特點，M.Schena等[20]在1995年用cDNA芯片檢測基因表達一文中將連接在固體介質(zhì)上的DNA稱為靶標(靶基因)，用熒光素標記的樣品稱為探針。本研究采用PCR擴增的探針基因雙鏈DNA片段，大小在200～500 bp。本研究采用的晶芯? LuxScanTM10K掃面儀結果分析軟件具有多種數(shù)據(jù)輸出方式，較常用的信號強度平均值、信號強度中位值、背景噪音中位值和背景噪音平均值等[21]。以信噪比(SNR)作為雜交陽性判斷的標準相對較多，SNR是指雜交結果中的信號強度中位值與背景噪音中位值之間的比值，多以SNR≥1.5或者2.0為陽性標準，同時結合芯片雜交信號清晰程度，如雜交信號的中位值大于1 000或者1 500來作為陽性判斷的標準。本研究中SNR是9個樣點的信號中位值與背景信號中位值之間的比值，即以SNR≥2.0和雜交樣點清晰，或者信號強度中位值大于1 500來為陽性判定的標準。

特異性與敏感性是衡量檢測方法的兩個重要技術指標，cDNA基因芯片檢測特異性的必要前提是探針的特異性[21]，本研究制備的探針基因之間的一致性均低于50%，從而保證了cDNA基因芯片雜交檢測的特異性。利用不同的病原對cDNA基因芯片進行了雜交檢測，TGEV、PEDV、PoRV三種病原之間沒有非特異性雜交，與PRRSV、PRV、JEV、CSFV之間雜交無非特異性雜交結果出現(xiàn)，證明本研究制備的PEDV-TGEV-PoRVcDNA基因芯片具有良好的特異性。靈敏性對檢測方法同樣重要，本研究構建的PEDV-TGEV-PoRVcDNA芯片的敏感性為20 pg·μL-1探針，與國內(nèi)外有關報道稍有差異，這是由于所用芯片基片、所選探針基因以及制作的程序稍有差異而造成的。但是靈敏度仍明顯高于某些報道中的多重PCR擴增檢測三種病毒性腹瀉疾病。cDNA基因芯片能否重復使用以及重復使用的結果關系到檢測成本，本研究發(fā)現(xiàn)，若連續(xù)使用同一進行雜交檢測同一探針，雜交信號的強度會隨著雜交次數(shù)的增加呈減弱趨勢，背景值則會不斷增強。但是，連續(xù)使用7次，雜交信號的強度仍遠遠高于1 500，SNR也大于2.0，因而表明連續(xù)使用7次并不會影響到雜交檢測的結果。本試驗中背景效果并不是很好可能是由于在芯片的變性和洗滌的過程中，某些化學或者物理因素導致芯片上探針的脫落以及基片氧化，從而造成雜交信號的下降趨勢以及背景值的增強。應用該基因芯片對四川地區(qū)的50份臨床樣品進行初步檢測，結果與常規(guī)RT-PCR方法的吻合度高。試驗結果說明建立的基因芯片方法可行且具有良好的特異性、靈敏性和重復性，具有良好的應用前景。

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(編輯 白永平)

Construction of cDNA Microarray for Detecting Porcine Epidemic Diarrhea Virus，Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus and Porcine Rotavirus

HUA Xiang1，HU Zhong-kai1，HUANG Xiao-bo1，WEN Xin-tian1，CAO San-jie1*，WEN Yi-ping1，WU Rui1，DENG Jing1，ZHAO Song1，YIN Ren-jie2，CHANG Xiao-xia1，OUYANG Da1，ZHANG Xian1

(1.ResearchCenterofSwineDisease/LaboratoryofAnimalInfectiousDiseaseandMicroarray，CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China；2.InstitutionofRuralDevelopmentofChongzhou，Chongzhou611200，China)

Porcine Epidemic Diarrhea Virus(PEDV)，Transmissible Gastroenteritis Virus(TGEV) and Porcine Rotavirus(PoRV) are three common pathogenies causing piglets diarrhea.A novel cDNA microarray was necessary to be developed to simultaneous detection of three diarrheal viruses successfully.To make this possible，primers and probes were designed to amplification of target genes according to the conserved sequences of PEDV-S，PEDV-M，TGEV-S，TGEV-N，PoRV-VP7 and PoRV-NSP4.Mutiplex PCR was established for labeling target genes after designing the microarray matrix and finally evaluated the specificity，sensitivity and repeatability of microarray.The positive judgement standard of microarray was determined：SNR(Signal to Noise Ratio) ≥2.0 or median signal ≥1 500.The result showed that PRRSV，CSFV，JEV and PRV could not be detected by six probes and as few as 20 pg·μL-1of target plasminds were detected successfully.One microarray could be tested at least 7 times.This assay provided a novel and high throughput detecting technology to identification and detection of three diarrheal viruses.

porcine epidemic diarrhea virus；transmissible gastroenteritis virus of swine；porcine rotavirus；cDNA chip；establish

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.015

2015-04-27

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項項目(201203056)

滑 翔(1993-)，男，新疆哈密人，碩士生，主要從事動物疫病分子生物學研究，E-mail：huaxiang722@126.com。胡中凱，男，碩士生，從事動物傳染病工作，在本研究設計和實施中做了重要貢獻，為本文共同第一作者，E-mail：huzk1986@163.com

*通信作者：曹三杰(1971-)，男，山西鄉(xiāng)寧人，教授，博士生導師，E-mail：csanjie@sicau.edu.cn

S858.285.3；S854.43

A

0366-6964(2015)12-2235-08