滑 翔，胡中凱，黃小波，文心田，曹三杰*，文翼平，伍 銳，鄧 靜，趙 松，尹人杰，常曉霞，歐陽(yáng)達(dá)，張 仙

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，豬病研究中心/動(dòng)物傳染病與基因芯片室，成都 611130；2.崇州市農(nóng)村發(fā)展局，崇州 611200)

檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬輪狀病毒的cDNA芯片的構(gòu)建

滑 翔1，胡中凱1，黃小波1，文心田1，曹三杰1*，文翼平1，伍 銳1，鄧 靜1，趙 松1，尹人杰2，常曉霞1，歐陽(yáng)達(dá)1，張 仙1

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，豬病研究中心/動(dòng)物傳染病與基因芯片室，成都 611130；2.崇州市農(nóng)村發(fā)展局，崇州 611200)

豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬輪狀病毒(PoRV)是三種常見(jiàn)的仔豬病毒性腹瀉病原，作者擬構(gòu)建可同時(shí)檢測(cè)三種病原的cDNA基因芯片。分別根據(jù)PEDV基因(S、M)、TGEV基因(S、N)、PoRV基因(VP7、NSP4)的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增靶基因，進(jìn)行PEDV-TGEV-PoRV的cDNA陣列設(shè)計(jì)，建立了擴(kuò)增標(biāo)記探針的多重PCR方法，并對(duì)所構(gòu)建cDNA芯片的特異性、靈敏性、重復(fù)性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。確定了該cDNA芯片的陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：SNR大于或等于2.0(或信號(hào)強(qiáng)度中位值大于等于1 500)。PEDV-TGEV-PoRV診斷cDNA芯片具有良好的特異性，該芯片不與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬乙型腦炎病毒、豬偽狂犬病病毒發(fā)生交叉反應(yīng)；芯片的最低檢測(cè)質(zhì)量濃度為20 pg·μL-1；同一張芯片可重復(fù)使用至少7次。本研究為鑒別三種仔豬病毒性病的鑒別診斷提供了新的高通量檢測(cè)技術(shù)。

豬流行性腹瀉病毒；豬傳染性胃腸炎病毒；豬輪狀病毒；cDNA芯片；構(gòu)建

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis of swine，TGEV)和豬輪狀病毒(porcine rotavirus，PoRV)是三種最常見(jiàn)的可引起仔豬腹瀉的病毒，自2010年以來(lái)，以PEDV感染為主的仔豬病毒性腹瀉已成為引起我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的最主要原因之一[1]，同時(shí)豬傳染性胃腸炎病毒和輪狀病毒也是經(jīng)常檢出的病原。這三種仔豬病毒性腹瀉病經(jīng)常存在混合感染，臨床鑒別診斷較困難，因?yàn)槠浒l(fā)病癥狀比較相似[2]，主要癥狀均表現(xiàn)為嘔吐、水樣噴射腹瀉和脫水等，特別是哺乳仔豬發(fā)病嚴(yán)重且死亡率高[3-4]。因此，臨床上對(duì)這三種仔豬腹瀉病進(jìn)行鑒別診斷非常重要。目前檢測(cè)這三種仔豬病毒性腹瀉的方法有病毒分離鑒定、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫熒光法(IFA)、病毒中和試驗(yàn)(VNT)、RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR等。然而，這些診斷方法都有一定的局限性，例如病毒分離不易成功且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，血清學(xué)檢測(cè)靈敏性低，檢測(cè)過(guò)程中容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)。RT-PCR技術(shù)檢測(cè)的樣本數(shù)量有限，無(wú)法實(shí)現(xiàn)高通量樣品的快速檢測(cè)[5]。這些檢測(cè)技術(shù)的共同缺陷是無(wú)法同時(shí)對(duì)大量臨床樣品進(jìn)行快速鑒別診斷，因此急需一種高通量診斷技術(shù)來(lái)鑒別診斷三種仔豬病毒性腹瀉病。

基因芯片技術(shù)是近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一門新技術(shù)。在基片上點(diǎn)陣排列一系列靶基因，與熒光素等標(biāo)記的探針?lè)肿釉谕粭l件下進(jìn)行核酸雜交，經(jīng)過(guò)共聚焦激光掃描儀掃描、利用數(shù)據(jù)分析軟件獲得雜交結(jié)果。芯片技術(shù)具有自動(dòng)化、平行性和高通量等潛在優(yōu)勢(shì)，能同時(shí)對(duì)多種疾病進(jìn)行檢測(cè)，因此它廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)各領(lǐng)域[6-9]，在動(dòng)物疫病研究方面(如病毒檢測(cè))也有大量報(bào)道[10-12]。針對(duì)當(dāng)前我國(guó)仔豬病毒性腹瀉發(fā)病嚴(yán)重的現(xiàn)狀，作者選取PEDV、TGEV和PoRV的保守基因，設(shè)計(jì)了可同時(shí)檢測(cè)三種病毒的cDNA芯片，擬建立聯(lián)合檢測(cè)這三種病毒的cDNA芯片技術(shù)，為仔豬病毒性腹瀉的高通量快速檢測(cè)提供了新的技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 病毒株與重組質(zhì)粒

TGEV、PEDV、PoRV均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)豬病研究中心分離并保存。pMD-TS重組質(zhì)粒、pMD-TN重組質(zhì)粒、pMD-PS重組質(zhì)粒、pMD-PM重組質(zhì)粒、pMD-VP7重組質(zhì)粒、pMD-NSP4重組質(zhì)粒，均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)豬病研究中心構(gòu)建并保存。

1.2 主要試劑和儀器

反轉(zhuǎn)錄試劑盒、λDNA均購(gòu)自寶生物(大連)生物科技有限公司；氯仿、無(wú)水乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒均為OMEGA公司產(chǎn)品；總RNA提取試劑盒均購(gòu)自天根科技(北京)有限公司；Baio? 氨基載玻片、Baio? 2×點(diǎn)樣緩沖液、Baio?預(yù)雜交緩沖液、Baio?雜交緩沖液均購(gòu)自上海百傲科技有限公司；Cy3-dCTP，PA53 021，Lot300 989，Amersham Biosciences，UK；芯片點(diǎn)樣系統(tǒng)：Capitalbio Corporation，芯片掃描儀：Capitalbio Corporation購(gòu)自北京博奧生物公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

利用DNAMAN軟件對(duì)GenBank上的TGEV、PEDV、PoRV毒株基因序列進(jìn)行分析，分別針對(duì)TGEV的S、N基因，PEDV的S、M基因和PoRV的VP7、NSP4基因的保守序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增的探針大小在200～500 bp(引物序列參見(jiàn)表1)。定位基因則參照曹三杰的方法[12]，以PCR擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度約為500 bp的λDNA目的片段。

1.4 重組探針質(zhì)粒菌的復(fù)蘇與鑒定

將含靶基因的重組質(zhì)粒菌在LB液體培養(yǎng)基(含100 μg·mL-1的Amp)中復(fù)蘇培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，質(zhì)粒50倍稀釋后取2 μL作為PCR模板，擴(kuò)增體系：10×PCR Buffer(Mg2+free)5.0 μL、MgCl2(25 mmol·L-1) 4.0 μL、dNTP Mixture(各2.5 mmol·L-1) 4.0 μL、特異性引物2.0 μL、質(zhì)粒DNA 2.0 μL、TaqDNA酶0.5 μL、去離子水補(bǔ)足50.0 μL，反應(yīng)程序：94 ℃2 min；94 ℃30 s；54 ℃30 s；72 ℃30 s，共37個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

表1 探針引物及擴(kuò)增相關(guān)信息

Table 1 Information of primers for probe and length of fragment

基因名稱Genename引物序列Sequencesofprimers擴(kuò)增片段長(zhǎng)度/bpThelengthoffragmentPEDV?M上游：5′?CTTATGGCTTGCATCACT?3′下游：5′?GCACTTTCTCGCTATCTG?3′421PEDV?S上游：5′?CGCTAGGCTTGAGTCTGTTG?3′下游：5′?AATTGCTGGTTCCGCTGTAG?3′474TGEV?N上游：5′?TTCCTGAAAGGTGGTTCTTCTACTA?3′下游：5′?TTTTCTGTGTCAACACCTAACTTT?3′362TGEV?S上游：5′?AGGCTTGACGAATTGAGTGCTGATG?3′下游：5′?AGTTTCATAAGCCGTTGGTAATAGC?3′276PoRV?NSP4上游：5′?GAACAGGTTACTACTAAGGATG?3′下游：5′?TCACATAGACGCAGTTACTTCC?3′270PoRV?VP7上游：5′?TTGAATGAATGGCTATGTAATCC?3′下游：5′?ACGCATCATTCTTTCAGTTTGT?3′381λDNA(AY319651)上游：5′?AAAGCGACGCAATGAGGCACT?3′下游：5′?GTTCCACGACCGCAACTGC?3′500

1.5 cDNA芯片的制備

利用接觸式點(diǎn)樣系統(tǒng)點(diǎn)制芯片，芯片的基片為氨基玻片。將制備的探針和定位基因稀釋至200～300 μg·mL-1，加入等體積點(diǎn)樣緩沖液。根據(jù)芯片設(shè)計(jì)的陣列，按順序向96孔載樣板孔內(nèi)加入探針和定位基因，第一排及最后一排點(diǎn)為定位基因，其余各排點(diǎn)為相應(yīng)的探針和空白對(duì)照，每排9個(gè)樣點(diǎn)，各樣點(diǎn)的中心距設(shè)置為500 μm，樣點(diǎn)的直徑設(shè)置為220 μm，點(diǎn)樣環(huán)境的濕度設(shè)置在35%以上，溫度為25～30 ℃。將點(diǎn)制好的芯片靜置于點(diǎn)樣儀上徹底干燥后，于60 ℃水合處理10 s，紫外交聯(lián)30 min，預(yù)熱0.2% SDS溶液洗滌5 min，蒸餾水快速洗滌后，1 500 r·min-1離心徹底干燥，真空密封后置4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 cDNA芯片雜交

將制備好的cDNA芯片于100 ℃水浴變性5 min，立即置預(yù)冷的95%乙醇，上下抽提10次，1 500 r·min-1離心干燥。放入雜交盒中并蓋上蓋片，于蓋片上點(diǎn)樣孔向各個(gè)點(diǎn)樣區(qū)緩慢加入50 μL的預(yù)雜交緩沖液，將雜交盒置于濕盒中，雜交儀中46 ℃下預(yù)雜交1.5 h。將制備好的靶基因95 ℃變性5 min，置于冰中冷卻5 min，加入等倍體積預(yù)冷雜交緩沖液，混勻后，吸棄芯片上預(yù)雜交液，吸取60 μL混勻靶基因溶液，加于芯片點(diǎn)樣區(qū)，蓋片并避光，濕盒中48 ℃下雜交6 h。雜交結(jié)束后，在暗室分別用預(yù)熱的洗滌液1、洗滌液2和洗滌液3中各浸泡4～5 min，裝于塑料玻片盒，以1 000 r·min-1離心干燥。

1.7 cDNA芯片的掃描分析

利用掃描儀對(duì)雜交后的芯片進(jìn)行結(jié)果掃描。掃描參數(shù)設(shè)置為PMT Gain 650，Laserpower 65%，分辨率為20 μm。掃描結(jié)束后，使用數(shù)據(jù)分析軟件(LuxScan3.0)分析掃描結(jié)果。本研究選取每個(gè)基因的9個(gè)樣點(diǎn)信號(hào)強(qiáng)度中位值的平均值和信噪比(雜交斑點(diǎn)信號(hào)中位值與斑點(diǎn)背景信號(hào)中位值之比)對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.8 cDNA芯片的質(zhì)量檢測(cè)

隨機(jī)挑選構(gòu)建的cDNA芯片利用定位基因λDNA進(jìn)行芯片質(zhì)量檢測(cè)。按程序依次進(jìn)行預(yù)雜交、雜交、洗滌，結(jié)果掃描和數(shù)據(jù)分析。

1.9 探針的多重PCR標(biāo)記方法的建立與優(yōu)化

以病毒cDNA為模板，建立多重PCR方法，并對(duì)引物濃度及比例、Tm值、TaqE濃度、MgCl2濃度、dNTP Mixture與Cy3-dCTP的濃度以及循環(huán)數(shù)等條件進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)體系中依次加入10×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl21.5 μL，dNTP Mixture 2.0 μL，引物對(duì)混合物3.0 μL，cDNA模板2.0 μL，TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)0.25 μL，去離子水加至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃4 min；93 ℃1 min；52 ℃1 min；72 ℃2 min；72 ℃延伸10 min，產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.10 cDNA芯片的特異性試驗(yàn)

用cDNA芯片探針引物擴(kuò)增并標(biāo)記PRRSV、CSFV、JEV、PoRV、PEDV、TGEV的模板來(lái)制備靶基因，分別利用制備好的芯片進(jìn)行檢測(cè)并進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析與處理。

1.11 cDNA芯片的靈敏性試驗(yàn)

選擇PEDVM基因測(cè)定芯片的靈敏性：用雜交緩沖液將M靶基因稀釋成3×100～3×104pg·μL-1，各取60 μL分別加于芯片的雜交區(qū)，在46 ℃下雜交6 h，掃描信號(hào)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.12 同張檢測(cè)cDNA芯片的重復(fù)使用試驗(yàn)

以PEDV-M作為靶基因與同一張芯片進(jìn)行7次雜交，雜交后進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果的掃描分析，變性除去雜交熒光，再以PEDV-M基因探針與其雜交，共雜交7次，觀察該芯片的重復(fù)使用效果。

2 結(jié) 果

2.1 探針基因多重PCR標(biāo)記條件優(yōu)化結(jié)果

最終優(yōu)化后的反應(yīng)體系如下：Tm54 ℃，dNTP(10 μmol·μL-1)3.5 μL，MgCl2(25 μmol·μL-1)3.0 μL，TaqE(2.5 U·μL-1)0.55 μL，三對(duì)引物按2∶1∶1(NSP4∶TN∶PM)和1∶2∶1(PS∶TS∶VP7)的比例混勻后加入3.0 μL，加水補(bǔ)齊25 μL。反應(yīng)程序94 ℃2 min；95 ℃30 s；54 ℃30 s；72 ℃30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)完畢后，取6.0 μL產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，結(jié)果如圖1。多重PCR標(biāo)記條件優(yōu)化后，雜交結(jié)果如圖2。

2.2 cDNA芯片的特異性試驗(yàn)

分別用PRRSV、CSFV、JEV、PRV、PoRV、PEDV、TGEV等病毒檢測(cè)PEDV-TGEV-PoRV cDNA芯片的雜交特異性。PRRSV、PRV、CSFV和JEV的雜交檢測(cè)結(jié)果顯示除定位基因(圖3第一、九排)雜交斑點(diǎn)清晰可見(jiàn)外，無(wú)雜交熒光斑點(diǎn)，結(jié)果顯示陰性。PEDV、TGEV、PoRV則在除定位基因(圖3第一、九排)雜交斑點(diǎn)清晰可見(jiàn)外，在相應(yīng)的診斷位置出現(xiàn)明顯的雜交熒光斑點(diǎn)，結(jié)果顯示陽(yáng)性，結(jié)果如圖3。

M.100 bp DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.PM；2.PS；3.TN；4.TS；5.NSP4；6.VP72；7.陰性對(duì)照M.100 bp marker；1.PM；2.PS；3.TN；4.TS；5.NSP4；6.VP72；7.Negative control圖1 多重PCR標(biāo)記條件優(yōu)化結(jié)果Fig.1 Multiple PCR marker conditions optimization results

圖2 多重PCR標(biāo)記條件優(yōu)化雜交結(jié)果Fig.2 Multiple PCR conditions optimization hybridization results

2.3 cDNA芯片的靈敏性試驗(yàn)

用核酸蛋白儀測(cè)得靶基因的OD260 nm，換算成DNA濃度。按操作步驟進(jìn)行梯度稀釋，稀釋后的質(zhì)量濃度分別為3、10、20、50、100、200、500、1 000、10 000 pg·μL-1。探針DNA質(zhì)量濃度在20 pg·μL-1時(shí)，基因雜交信號(hào)的中位值均大于1 500，且SNR大于1.5，可知cDNA芯片最低檢測(cè)質(zhì)量濃度為20 pg·μL-1，結(jié)果如圖4。

2.4 cDNA芯片重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

以PEDVM基因?yàn)槔鳛榘谢?，進(jìn)行單張芯片的重復(fù)使用試驗(yàn)。取一張芯片雜交后，掃描獲取雜交結(jié)果，將該芯片變性消除雜交斑點(diǎn)，再將變性后的芯片用相同的探針進(jìn)行第二次雜交，同樣掃描獲取雜交結(jié)果，如此重復(fù)七次。同一張芯片重復(fù)使用結(jié)果見(jiàn)圖5。從圖5可看出，該張芯片可重復(fù)使用至少七次，但是隨著使用次數(shù)的不斷增加，結(jié)果雖然仍呈陽(yáng)性，但雜交信號(hào)值以及SNR值卻不斷減弱，背景值也隨雜交次數(shù)的增加而不斷增強(qiáng)。

a.PoRV檢測(cè)結(jié)果；b.PEDV檢測(cè)結(jié)果；c.TGEV檢測(cè)結(jié)果；d.PRRSV檢測(cè)結(jié)果；e.CSFV檢測(cè)結(jié)果；f.JEV檢測(cè)結(jié)果；g.PRV檢測(cè)結(jié)果a.PoRV detection result；b.PEDV detection result；c.TGEV detection result；d.PRRSV detection result；e.CSFV detection result；f.JEV detection result；g.PRV detection result圖3 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The specificity of the cDNA microarray assay

圖4 靈敏性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 The sensitivity of the cDNA microarray assay

圖5 單張芯片重復(fù)使用結(jié)果Fig.5 The repeated use of a single chip

2.5 樣本檢測(cè)結(jié)果

收集來(lái)自綿陽(yáng)、阿壩茂縣、彭州、資陽(yáng)安岳、眉山、廣安、攀枝花、巴中通江50份有腹瀉癥狀且30 d以下的仔豬小腸。以及檢測(cè)出有PEDV、TGEV、PoRV感染的41份相應(yīng)仔豬小腸內(nèi)容物作為芯片臨床應(yīng)用研究。RNA提取步驟按照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)完成，反轉(zhuǎn)錄后將得到的cDNA產(chǎn)物通過(guò)多重PCR標(biāo)記進(jìn)行靶基因擴(kuò)增后，與芯片雜交，掃描分析數(shù)據(jù)。同時(shí)將cDNA產(chǎn)物按照常規(guī)PCR擴(kuò)增，凝膠電泳分析結(jié)果。

表2 50份小腸樣品的檢測(cè)結(jié)果

Table 2 The detection rusult of 50 samples

感染類型Infectiontype常規(guī)RT?PCRRoutineRT?PCRcDNA芯片cDNAchip陽(yáng)性數(shù)/樣品數(shù)Positivenumber/samplenumber感染率/%Infectionrate陽(yáng)性數(shù)/樣品數(shù)Positivenumber/samplenumber感染率/%InfectionratePEDV36/507237/5074TGEV3/5063/506PEDV+PoRV2/5042/504PEDV、TGEV、PEDV+PoRV41/508242/5084

3 討 論

基因芯片的載體主要包括玻璃片、硅片、尼龍膜片等多種材料[13]，其中玻璃基片價(jià)格便宜、制作簡(jiǎn)單、應(yīng)用方便、熒光背景值較低、耐高溫以及高離子強(qiáng)度的洗滌，而且玻片少孔，疏水性較強(qiáng)，大大減少了雜交液的使用量，同時(shí)又能夠提高芯片的雜交效率[14]。本研究中制備得到的PEDV-TGEV-PoRV cDNA芯片是采用了氨基硅化處理過(guò)的氨基化玻片作為芯片的載體基片，制得了雜交信號(hào)穩(wěn)定，能夠長(zhǎng)期保存使用的基因芯片。

核酸熒光標(biāo)記分為間接標(biāo)記和直接摻入法、Klenow聚合酶法及一些非熒光標(biāo)記法[15-16]。其中間接標(biāo)記法靈敏度高，但步驟較多，且標(biāo)記后需要對(duì)標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行純化，增加了成本。Klenow聚合酶隨機(jī)引物標(biāo)記法中隨機(jī)PCR存在非特異擴(kuò)增，其靈敏度和特異性將會(huì)受到影響[17]。本研究中的標(biāo)記物為熒光素是由本實(shí)驗(yàn)室采用的cDNA芯片掃描設(shè)備所決定的，探針是采用PCR擴(kuò)增標(biāo)記方法是因?yàn)樵诿复俜磻?yīng)中完成樣品靶基因的特異性PCR擴(kuò)增的同時(shí)，完成熒光標(biāo)記，從而能夠提高了芯片檢測(cè)的特異性與靈敏度。文思遠(yuǎn)等[18]比較了三種基于PCR擴(kuò)增的熒光標(biāo)記方法：一種標(biāo)記方法是采用了熒光分子標(biāo)記引物進(jìn)行標(biāo)記，即熒光分子化學(xué)合成在引物的5′端；第二種則是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光分子修飾過(guò)的核苷酸，通過(guò)PCR反應(yīng)將其摻入到DNA片段當(dāng)中；而第三種方法則是利用非模板依賴性的酶促加尾反應(yīng)，在DNA片段的3′末端隨機(jī)加入經(jīng)熒光素修飾過(guò)的核苷酸[18]。發(fā)現(xiàn)三種方法的標(biāo)記效率基本一致，但是熒光標(biāo)記引物的合成與保存則較為繁瑣，而采用不對(duì)稱PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行標(biāo)記的方法時(shí)，則需要不斷摸索上下游引物的最佳比例，而酶促加尾反應(yīng)則需要較為嚴(yán)格的反應(yīng)條件[19]。本研究最終參照曹三杰等[11]在PCR反應(yīng)過(guò)程中加入Cy3-dCTP取代dCTP，從而將熒光素Cy3摻入到PCR產(chǎn)物中。這主要是因?yàn)镃y3的分子量和空間位阻較大，所以只能使用Cy3-dCTP部分取代dCTP，才能夠使PCR反應(yīng)順利完成。

靶基因的連接與探針的固定是構(gòu)建基因芯片的首要條件?；贜orthern印跡法中的探針和靶基因的特點(diǎn)，M.Schena等[20]在1995年用cDNA芯片檢測(cè)基因表達(dá)一文中將連接在固體介質(zhì)上的DNA稱為靶標(biāo)(靶基因)，用熒光素標(biāo)記的樣品稱為探針。本研究采用PCR擴(kuò)增的探針基因雙鏈DNA片段，大小在200～500 bp。本研究采用的晶芯? LuxScanTM10K掃面儀結(jié)果分析軟件具有多種數(shù)據(jù)輸出方式，較常用的信號(hào)強(qiáng)度平均值、信號(hào)強(qiáng)度中位值、背景噪音中位值和背景噪音平均值等[21]。以信噪比(SNR)作為雜交陽(yáng)性判斷的標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)較多，SNR是指雜交結(jié)果中的信號(hào)強(qiáng)度中位值與背景噪音中位值之間的比值，多以SNR≥1.5或者2.0為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)結(jié)合芯片雜交信號(hào)清晰程度，如雜交信號(hào)的中位值大于1 000或者1 500來(lái)作為陽(yáng)性判斷的標(biāo)準(zhǔn)。本研究中SNR是9個(gè)樣點(diǎn)的信號(hào)中位值與背景信號(hào)中位值之間的比值，即以SNR≥2.0和雜交樣點(diǎn)清晰，或者信號(hào)強(qiáng)度中位值大于1 500來(lái)為陽(yáng)性判定的標(biāo)準(zhǔn)。

特異性與敏感性是衡量檢測(cè)方法的兩個(gè)重要技術(shù)指標(biāo)，cDNA基因芯片檢測(cè)特異性的必要前提是探針的特異性[21]，本研究制備的探針基因之間的一致性均低于50%，從而保證了cDNA基因芯片雜交檢測(cè)的特異性。利用不同的病原對(duì)cDNA基因芯片進(jìn)行了雜交檢測(cè)，TGEV、PEDV、PoRV三種病原之間沒(méi)有非特異性雜交，與PRRSV、PRV、JEV、CSFV之間雜交無(wú)非特異性雜交結(jié)果出現(xiàn)，證明本研究制備的PEDV-TGEV-PoRVcDNA基因芯片具有良好的特異性。靈敏性對(duì)檢測(cè)方法同樣重要，本研究構(gòu)建的PEDV-TGEV-PoRVcDNA芯片的敏感性為20 pg·μL-1探針，與國(guó)內(nèi)外有關(guān)報(bào)道稍有差異，這是由于所用芯片基片、所選探針基因以及制作的程序稍有差異而造成的。但是靈敏度仍明顯高于某些報(bào)道中的多重PCR擴(kuò)增檢測(cè)三種病毒性腹瀉疾病。cDNA基因芯片能否重復(fù)使用以及重復(fù)使用的結(jié)果關(guān)系到檢測(cè)成本，本研究發(fā)現(xiàn)，若連續(xù)使用同一進(jìn)行雜交檢測(cè)同一探針，雜交信號(hào)的強(qiáng)度會(huì)隨著雜交次數(shù)的增加呈減弱趨勢(shì)，背景值則會(huì)不斷增強(qiáng)。但是，連續(xù)使用7次，雜交信號(hào)的強(qiáng)度仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于1 500，SNR也大于2.0，因而表明連續(xù)使用7次并不會(huì)影響到雜交檢測(cè)的結(jié)果。本試驗(yàn)中背景效果并不是很好可能是由于在芯片的變性和洗滌的過(guò)程中，某些化學(xué)或者物理因素導(dǎo)致芯片上探針的脫落以及基片氧化，從而造成雜交信號(hào)的下降趨勢(shì)以及背景值的增強(qiáng)。應(yīng)用該基因芯片對(duì)四川地區(qū)的50份臨床樣品進(jìn)行初步檢測(cè)，結(jié)果與常規(guī)RT-PCR方法的吻合度高。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明建立的基因芯片方法可行且具有良好的特異性、靈敏性和重復(fù)性，具有良好的應(yīng)用前景。

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(編輯 白永平)

Construction of cDNA Microarray for Detecting Porcine Epidemic Diarrhea Virus，Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus and Porcine Rotavirus

HUA Xiang1，HU Zhong-kai1，HUANG Xiao-bo1，WEN Xin-tian1，CAO San-jie1*，WEN Yi-ping1，WU Rui1，DENG Jing1，ZHAO Song1，YIN Ren-jie2，CHANG Xiao-xia1，OUYANG Da1，ZHANG Xian1

(1.ResearchCenterofSwineDisease/LaboratoryofAnimalInfectiousDiseaseandMicroarray，CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China；2.InstitutionofRuralDevelopmentofChongzhou，Chongzhou611200，China)

Porcine Epidemic Diarrhea Virus(PEDV)，Transmissible Gastroenteritis Virus(TGEV) and Porcine Rotavirus(PoRV) are three common pathogenies causing piglets diarrhea.A novel cDNA microarray was necessary to be developed to simultaneous detection of three diarrheal viruses successfully.To make this possible，primers and probes were designed to amplification of target genes according to the conserved sequences of PEDV-S，PEDV-M，TGEV-S，TGEV-N，PoRV-VP7 and PoRV-NSP4.Mutiplex PCR was established for labeling target genes after designing the microarray matrix and finally evaluated the specificity，sensitivity and repeatability of microarray.The positive judgement standard of microarray was determined：SNR(Signal to Noise Ratio) ≥2.0 or median signal ≥1 500.The result showed that PRRSV，CSFV，JEV and PRV could not be detected by six probes and as few as 20 pg·μL-1of target plasminds were detected successfully.One microarray could be tested at least 7 times.This assay provided a novel and high throughput detecting technology to identification and detection of three diarrheal viruses.

porcine epidemic diarrhea virus；transmissible gastroenteritis virus of swine；porcine rotavirus；cDNA chip；establish

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.015

2015-04-27

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)項(xiàng)目(201203056)

滑 翔(1993-)，男，新疆哈密人，碩士生，主要從事動(dòng)物疫病分子生物學(xué)研究，E-mail：huaxiang722@126.com。胡中凱，男，碩士生，從事動(dòng)物傳染病工作，在本研究設(shè)計(jì)和實(shí)施中做了重要貢獻(xiàn)，為本文共同第一作者，E-mail：huzk1986@163.com

*通信作者：曹三杰(1971-)，男，山西鄉(xiāng)寧人，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：csanjie@sicau.edu.cn

S858.285.3；S854.43

A

0366-6964(2015)12-2235-08