安清聰，徐娜娜，張春勇，潘洪彬，李美荃，陳克嶙，郭榮富

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南省動物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201)

不同水平乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬生產(chǎn)性能、小腸形態(tài)學(xué)和機(jī)體抗病能力的影響

安清聰#，徐娜娜#，張春勇，潘洪彬，李美荃，陳克嶙，郭榮富*

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南省動物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201)

本試驗(yàn)旨在研究不同水平乳鐵蛋白(LF)對滇撒配套系斷奶仔豬生產(chǎn)性能、腸道保護(hù)和機(jī)體抗病能力的影響。選用日齡為(28±2)d，平均體重為(6.56±0.75)kg的健康滇撒配套系斷奶仔豬240頭，隨機(jī)分為5個處理，每個處理48頭，6個重復(fù)，每個重復(fù)8頭豬，分別飼喂基礎(chǔ)飼糧(對照組)，基礎(chǔ)飼糧+125 mg·kg-1乳鐵蛋白，基礎(chǔ)飼糧+250 mg·kg-1乳鐵蛋白，基礎(chǔ)飼糧+500 mg·kg-1乳鐵蛋白和抗生素組(50 mg·kg-1土霉素)，試驗(yàn)期42 d。試驗(yàn)結(jié)束時，每個處理中每個重復(fù)隨機(jī)選4頭，每個處理共24頭仔豬，經(jīng)前腔靜脈采血，分離血清，檢測血清免疫球蛋白G( IgG )、一氧化氮(NO)含量，乳酸脫氫酶(LDH)、一氧化氮合酶(NOS)和溶菌酶(LSZ)活性及總鐵結(jié)合力(TIBC)。每個處理中每個重復(fù)屠宰1頭仔豬，共6頭，收集心、肝、脾以檢測鐵調(diào)素(Hepcidin)、β防御素1(pBD-1)、β防御素2(pBD-2)和β防御素3(pBD-3)基因mRNA相對表達(dá)量。結(jié)果表明：1)250 mg·kg-1乳鐵蛋白組斷奶仔豬的末重、日增重、日采食量顯著高于對照組和抗生素組(P<0.05)，料重比和腹瀉率則顯著低于對照組和抗生素組(P<0.05)；2) 250 mg·kg-1組的IgG和NO顯著高于對照組(P<0.05)，TIBC極顯著高于抗生素組和對照組(P<0.01)；250 mg·kg-1乳鐵蛋白組十二指腸V/C，空腸絨毛長度、V/C，回腸絨毛長度、V/C極顯著高于抗生素組和對照組(P<0.01)，250 mg·kg-1乳鐵蛋白組回腸隱窩深度極顯著低于對照組(P<0.01)；腹瀉率、IgG、NO、LSZ、十二指腸隱窩深度、十二指腸絨毛長度/隱窩深度、空腸絨毛長度、空腸隱窩深度和空腸絨毛長度/隱窩深度隨乳鐵蛋白添加水平呈二次曲線變化(P<0.05)；3)250 mg·kg-1乳鐵蛋白組極顯著高于對照組和抗生素組斷奶仔豬心、肝中的HepcidinmRNA的表達(dá)量(P<0.01)，125 mg·kg-1乳鐵蛋白組顯著高于對照組和抗生素組斷奶仔豬肝中HepcidinmRNA的表達(dá)量(P<0.05)，肝HepcidinmRNA表達(dá)量極顯著的高于心和脾(P<0.01)；250 mg·kg-1乳鐵蛋白組心、脾的pBD-1 mRNA的表達(dá)量極顯著高于其他組(P<0.01)；肝的pBD-2 mRNA表達(dá)量顯著或極顯著的高于心或脾(P<0.05，P<0.01)；添加量為250 mg·kg-1時，心和脾的pBD-3 mRNA的表達(dá)量極顯著高于其他組(P<0.01)。結(jié)果提示，飼糧中添加乳鐵蛋白可明顯改善滇撒配套系仔豬的生產(chǎn)性能；改善血清免疫學(xué)參數(shù)和小腸形態(tài)學(xué)；能夠通過誘導(dǎo)滇撒配套系仔豬的心、肝和脾Hepcidin和pBD-1，pBD-2，pBD-3基因表達(dá)上調(diào)方式增強(qiáng)仔豬抗病能力；在本試驗(yàn)條件下，綜合生產(chǎn)性能、血清免疫學(xué)和小腸形態(tài)學(xué)參數(shù)二次曲線結(jié)果，滇撒配套系仔豬日糧中乳鐵蛋白的適宜添加量為250～300 mg·kg-1。

滇撒配套系仔豬；乳鐵蛋白；免疫學(xué)參數(shù)；小腸形態(tài)學(xué)；鐵調(diào)素；β防御素

仔豬斷奶后，無論是心理還是機(jī)體都會產(chǎn)生強(qiáng)烈應(yīng)激，免疫力下降，最終影響?zhàn)B豬生產(chǎn)效益。近年來，應(yīng)用抗生素改善仔豬健康和生產(chǎn)性能所引起的抗生素耐藥性和動物體內(nèi)的藥物殘留已引起了人們的高度重視。研發(fā)和應(yīng)用具有安全綠色特點(diǎn)的抗生素替代品，不僅能夠提高動物免疫力，而且可以避免抗生素引起的弊端。乳鐵蛋白是一種多功能糖蛋白，具有防止微生物感染，調(diào)節(jié)免疫力，促進(jìn)細(xì)胞生長等作用[1]。王燕等在日糧中添加0.125%和0.25%的乳鐵蛋白能顯著或極顯著提高杜長大斷奶仔豬抗菌肽PMAP-37基因的表達(dá)[2]。Y.Wang等發(fā)現(xiàn)，仔豬日糧中添加乳鐵蛋白可以極顯著提高內(nèi)源性抗微生物多肽PR-39基因的表達(dá)[3]。先天免疫和適應(yīng)性免疫是宿主防御的兩個基本要素。先天免疫機(jī)制之一是廣譜抗菌性的分泌物質(zhì)，如cathelicidins和小陽離子多肽，命名為defensins，其中β-defensin構(gòu)成一組新發(fā)現(xiàn)的富含胱氨酸的抗菌肽，有3個分子內(nèi)的二硫鍵，許多的β-defensin已經(jīng)在哺乳動物和鳥類的上皮組織和白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[4-5]。Hepcidin是一種具有廣譜殺菌抑菌作用的抗菌肽，具有25個氨基酸，主要在肝細(xì)胞合成[6]，在體內(nèi)和其他抗菌肽一樣參與宿主的先天防御。目前國內(nèi)外關(guān)于乳鐵蛋白對斷奶仔豬的生長性能和腸道健康雖有研究，但是關(guān)于乳鐵蛋白對滇撒豬配套系仔豬生產(chǎn)性能和抗病能力的研究鮮見報(bào)道。滇撒豬是云南省地方優(yōu)良品種資源，形成歷史悠久，品種特征突出，具有抗病力強(qiáng)、耐粗飼、繁殖率高、肉質(zhì)好等特點(diǎn)，已被列入國家級畜禽資源保護(hù)名錄。

本試驗(yàn)旨在探究不同水平乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬生長性能，血清免疫學(xué)參數(shù)，心、肝、脾組織Hepcidin與β-defensinmRNA表達(dá)量的影響，旨在為乳鐵蛋白作為早期斷奶仔豬抗生素替代品的研究和應(yīng)用提供思路和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用日齡為(28±2)d，平均體重為(6.56±0.75)kg的健康滇撒配套系斷奶仔豬240頭，試驗(yàn)隨機(jī)分為5個處理，每個處理48頭，6個重復(fù)，每個重復(fù)8頭，斷奶后分別飼喂基礎(chǔ)飼糧(對照組)，基礎(chǔ)飼糧+125 mg·kg-1乳鐵蛋白，基礎(chǔ)飼糧+250 mg·kg-1乳鐵蛋白，基礎(chǔ)飼糧+500 mg·kg-1乳鐵蛋白和抗生素陽性組(50 mg·kg-1土霉素)，試驗(yàn)期為42 d。

1.2 飼糧配制和飼養(yǎng)管理

參照NRC(2012)豬營養(yǎng)需要推薦量配制基礎(chǔ)飼糧。LF來源：進(jìn)口LF(DMV international Co.)，以乳牛初乳為原料，利用超濾法從牛乳中分離純化乳鐵蛋白。乳鐵蛋白參數(shù)：純度為95%。其乳鐵蛋白水平的添加量分別為125、250和500 mg·kg-1?；A(chǔ)飼糧組成和營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

Table1 Composition and nutrient levels of basal diets(air-dry basis) %

1).預(yù)混料為每千克飼糧提供：VA 18 000 IU，VD33 400 IU，VE 32 mg，VK 4 mg，生物素0.32 mg，葉酸1.6 mg，VC 304 mg，膽堿0.5 mg，Cu 7 mg，F(xiàn)e 102 mg，Zn 103.5 mg，Mn 6.36 mg，I 0.144 mg，Co 0.32 mg，Se 0.32 mg。2).DE為計(jì)算值，其余均為實(shí)測值

1).The premix provided the following per kg of diets：VA 18 000 IU，VD33 400 IU，VE 32 mg，VK 4 mg，biotin 0.32 mg，folic acid 1.6 mg，VC 304 mg，choline 0.5 mg，Cu 7 mg，F(xiàn)e 102 mg，Zn 103.5 mg，Mn 6.36 mg，I 0.144 mg，Co 0.32 mg，Se 0.32 mg.2).DE was a calculated value and others were measured values

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 生長性能的測定 試驗(yàn)結(jié)束時，對試驗(yàn)仔豬空腹稱重，計(jì)算仔豬的平均日增重、平均日采食量、料重比和腹瀉率。

1.3.2 血清免疫參數(shù)的測定 試驗(yàn)結(jié)束時，仔豬空腹稱重，每個處理中每個重復(fù)隨機(jī)取4頭，每個處理共24頭仔豬，經(jīng)前腔靜脈采血10 mL，制備血清備用。測定免疫球蛋白G、NO含量、乳酸脫氫酶(LDH)、一氧化氮合酶、溶菌酶(LZM)活性和總鐵結(jié)合力(TIBC)。免疫球蛋白G含量采用免疫濁度法測定，一氧化氮含量、一氧化氮合酶活性、LDH活性和TIBC。采用比色法測定，LZM活性使用試管比濁法，試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供，參照說明書進(jìn)行測定。

1.3.3 小腸形態(tài)學(xué)的觀察 仔豬屠宰后，在十二指腸、空腸和回腸中段剪取約1 cm組織樣，然后將樣品按照常規(guī)組織切片要求進(jìn)行處理，制作完成后，然后在100倍光鏡下用測微尺測量20根最長絨毛的高度和相應(yīng)的隱窩深度，參照陳恒燦等[7]的方法進(jìn)行處理和觀察小腸形態(tài)學(xué)變化。1.3.4 仔豬組織Hepcidin、pBD-1、pBD-2、pBD-3 mRNA相對表達(dá)量檢測 每個處理中每個重復(fù)屠宰1頭仔豬，每個處理共6頭，迅速采集心、肝、脾3種組織，-80 ℃速凍，用于檢測Hepcidin、pBD-1、pBD-2、pBD-3 mRNA的相對表達(dá)量。

1.3.5 實(shí)時熒光定量PCR 本試驗(yàn)Real-Time qPCR采用Eva GreenⅠ染料法，反應(yīng)在Bio-Rad CFX96TMReal-Time PCR Systems上進(jìn)行。按照預(yù)先篩選好的qRT-PCR反應(yīng)條件和體系將上述標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行擴(kuò)增。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL：SsoFastTMEvaGreen?Supermix 10 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，cDNA模板2 μL，加滅菌去離子水至20 μL。

基因引物設(shè)計(jì)采用Primer Express Software(PE Applied Biosystems，CA)。各引物序列見表2。

表2 實(shí)時熒光定量PCR引物

Table 2 Primers for real-time PCR

目的基因Targetgene引物序列(5′?3′)Primersequence產(chǎn)物大小/bpProductsize退火溫度/℃Annealingtemperature肌動蛋白β?actinF：TCTGGCACCACACCTTCTR：TGATCTGGGTCATCTTCTCAC11457鐵調(diào)素HepcidinF：TCCGTTCTCCCATCCCAGACR：GCAGCACATCCCACAGATTG17154豬β?防御素1pBD?1F：ACCGCCTCCTCCTTGTATR：GGTGCCGATCTGTTTCAT14654豬β?防御素2pBD?2F：CCTGCTTACGGGTCTTGR：TCTGCTGTGGCTTCTGG16659豬β?防御素3pBD?3F：GAAGTCTACAGAAGCCAAATR：GGTAACAAATAGCACCATAA10255

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有組織的Hepcidin、pBD-1、pBD-2、pBD-3 mRNA表達(dá)量均是以β-actin為內(nèi)參基因，最終設(shè)pBD-3在肝中對照組的相對表達(dá)量為1，相對熒光定量計(jì)算方法采用M.W.Pfaffl[8]的方法計(jì)算。所有數(shù)據(jù)均采用Excel進(jìn)行整理，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，單因子方差分析檢驗(yàn)組間顯著性，然后進(jìn)行鄧肯氏多重比較，結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。對生產(chǎn)性能、血液參數(shù)、小腸形態(tài)學(xué)參數(shù)與日糧中乳鐵蛋白的添加量進(jìn)行二次回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬生產(chǎn)性能的影響

乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬生產(chǎn)性能影響的試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可見，抗生素組和乳鐵蛋白組仔豬末重高于對照組，其中250 mg·kg-1組的末重最高，顯著高于其他組(P<0.05)；日增重250 mg·kg-1組的顯著高于其他組(P<0.05)；乳鐵蛋白組的日采食量均高于抗生素組和對照組，其中250 mg·kg-1組的最高；250 mg·kg-1組的料重比顯著低于其他組(P<0.05)；250 mg·kg-1組的腹瀉率最低，差異顯著(P<0.05) 。

2.2 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬血清免疫參數(shù)和生化指標(biāo)的影響

由表4可以看出，乳鐵蛋白組的斷奶仔豬血清中IgG含量、NO含量、LZM活性和TIBC均高于對照組，其中乳鐵蛋白組的LZM活性和TIBC均極顯著高于對照組(P<0.01)，250和500 mg·kg-1組血清中IgG含量顯著高于對照組(P<0.05)，其中250 mg·kg-1組的IgG 含量最高，而125和250 mg·kg-1組的NO含量均極顯著高于對照組(P<0.01)。乳鐵蛋白組、對照組與抗生素組的血清LDH無顯著差異(P>0.05)，其中125與500 mg·kg-1乳鐵蛋白組都高于對照組，而250 mg·kg-1乳鐵蛋白組和抗生素組的血清LDH都低于對照組。乳鐵蛋白組、對照組和抗生素組之間的NOS均無顯著性差異(P>0.05)。

表3 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬生產(chǎn)性能的影響

Table 3 Effects of LF on growth performance of Diansa weaning piglets

項(xiàng)目Item對照組Controlgroup乳鐵蛋白添加水平/(mg·kg-1)LFsupplementallevel土霉素/(mg·kg-1)Terramycin12525050050初重/kgInitialweight6．43±0．75a6．45±0．80a6．82±0．69a6．64±0．66a6．48±0．89a末重/kgFinalweight19．65±1．11c19．98±0．97bc22．42±0．95a20．83±1．19b20．47±0．92b日增重/(g·d-1)ADG314．76±17．18c322．14±14．28bc371．42±21．26a337．85±22．14b330．10±19．85b日采食量/(g·d-1)ADFI569．72±26．41c576．63±25．32bc623．98±19．26a591．24±27．15ab574．37±13．14b料重比G∶F1．81±0．06c1．79±0．02bc1．68±0．03a1．75±0．02b1．74±0．04b腹瀉率/%Diarrhearate8．02±0．97a5．41±1．02b3．65±0．61c5．18±0．64b5．18±0．64b

同行數(shù)據(jù)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同

In the same raw，values with different small letters mean significant difference(P<0.05)，and with different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01).The same as below

表4 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬血清免疫參數(shù)和血清生化指標(biāo)的影響

Table 4 Effects of LF on serum immunological parameters and biochemical indice of Diansa weaning piglets

項(xiàng)目Item對照組Controlgroup乳鐵蛋白添加水平/(mg·kg-1)LFsupplementallevel土霉素/(mg·kg-1)Terramycin12525050050免疫球蛋白G/(g·L-1)IgG13．51±0．49Ab13．69±0．17Aab14．17±0．19Aa14．01±0．21Aa13．97±0．26Aab溶菌酶/(U·mL-1)LZM386．67±16．26Bb592．00±10．95Aa620．00±26．51Aa600．00±20．91Aa665．00±27．25Aa乳酸脫氫酶/(U·L-1)LDH8151．29±70．33Aa8156．83±67．20Aa8096．12±62．09Aa8289．97±80．51Aa8117．16±89．56Aa一氧化氮/(μmol·L-1)NO33．50±2．59Cc47．05±2．55Aa46．20±3．00ABa40．00±1．00BCb44．09±1．13ABab一氧化氮合酶/(U·mL-1)NOS36．95±2．58Aa35．18±1．60Aa36．38±2．47Aa34．97±3．36Aa37．09±2．49Aa總鐵結(jié)合力/(μmol·L-1)TIBC100．66±0．58Cc115．67±3．21Bb124．59±1．56Aa126．57±1．40Aa99．50±1．29Cc

2.3 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬小腸形態(tài)學(xué)的影響

由表5可知，十二指腸的絨毛長度250 mg·kg-1組最高，而隱窩深度250 mg·kg-1組的最低，且絨毛長度/隱窩深度極顯著高于其他組(P<0.01)；空腸的絨毛長度250 mg·kg-1組極顯著高于其他組(P<0.01)，各組之間的隱窩深度無顯著性差異，且250 mg·kg-1組最低，絨毛長度/隱窩深度250 mg·kg-1組極顯著高于其他組(P<0.01)；回腸的絨毛長度250和500 mg·kg-1組極顯著高于其他組(P<0.01)，隱窩深度250 mg·kg-1組最低，絨毛長度/隱窩深度250 mg·kg-1組極顯著高于其他組(P<0.01)。

表5 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬小腸形態(tài)學(xué)的影響

Table 5 Effects of LF on small intestinal morphology of Diansa weaning piglets

項(xiàng)目Item對照組Controlgroup乳鐵蛋白添加水平/(mg·kg-1)LFsupplementallevel土霉素/(mg·kg-1)Terramycin12525050050十二指腸Duodenum絨毛長度/μmVillusheight223．33±26．03230．33±24．13253．00±22．06227．00±28．21235．60±23．81隱窩深度/μmCryptdepth118．33±13．65109．33±18．72102．25±16．34107．25±11．27106．20±12．40絨毛長度/隱窩深度V/C1．89±0．14Cc2．09±0．16BbC2．47±0．10Aa2．11±0．09BbC2．22±0．07Bb空腸Jejunum絨毛長度/μmVillusheight172．67±2．31Cd202．80±6．22Bb230．00±2．00Aa180．67±4．62Cd192．67±5．03Bc隱窩深度/μmCryptdepth138．67±14．05133．00±10．89127．33±10．07145．55±6．25127．33±3．06絨毛長度/隱窩深度V/C1．21±0．03Cd1．54±0．02Bb1．85±0．05Aa1．27±0．03Cc1．49±0．02Bb回腸Ileum絨毛長度/μmVillusheight185．33±10．07Bb184．00±17．78Bb223．33±7．57Aa208．80±5．76Aa180．00±4．32Bb隱窩深度/μmCryptdepth122．67±11．02Aa120．50±7．00ABab104．67±4．16Bc108．80±4．82ABbc112．00±8．7ABabc絨毛長度/隱窩深度V/C1．49±0．02Cd1．51±0．03Cd2．16±0．05Aa1．87±0．07Bb1．59±0．01Cc

2.4 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬生產(chǎn)性能、血清免疫參數(shù)、小腸形態(tài)學(xué)的二次方程與求解結(jié)果

由表6可知，斷奶仔豬腹瀉率、血清中免疫球蛋白G、一氧化氮含量，LZM活性、TIBC、十二指腸隱窩深度、十二指腸絨毛長度/隱窩深度、空腸絨毛長度、空腸隱窩深度和空腸絨毛長度/隱窩深度隨LF添加水平的提高呈二次曲線變化(P<0.05)。

2.5 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬組織HepcidinmRNA表達(dá)量的影響

乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬心、肝和脾的HepcidinmRNA 表達(dá)的影響結(jié)果見圖1。在心中，添加量為250 mg·kg-1時表達(dá)量最高，差異極顯著(P<0.01)，125和500 mg·kg-1組表達(dá)量極顯著低于對照組(P<0.01)。在肝中，3個添加水平的表達(dá)量均極顯著高于對照組和抗生素組(P<0.01)，隨乳鐵蛋白添加量的增加，Hepcidin表達(dá)呈上升趨勢，當(dāng)添加量為250 mg·kg-1時，Hepcidin表達(dá)量最高，差異極顯著(P<0.01)，隨后降低。在脾中，隨乳鐵蛋白添加量的增加，Hepcidin表達(dá)呈上升趨勢，當(dāng)添加量為125 mg·kg-1時，Hepcidin的表達(dá)量最高，差異極顯著(P<0.01)，隨后降低，抗生素組高于對照組，差異不顯著(P>0.05)。

抗生素組心組織的表達(dá)量極顯著低于對照組(P<0.01)，而在肝和脾中無顯著性差異(P>0.05)。所有組的肝組織的表達(dá)量極顯著的高于心和脾(P<0.01)，而心組織的表達(dá)量與脾均無顯著性差異(P>0.05)。

表6 乳鐵蛋白水平與仔豬生產(chǎn)性能、血清免疫學(xué)參數(shù)和小腸形態(tài)學(xué)的二次方程與求解結(jié)果

Table 6 Quadratice equations and results of LF on growth performance，serum immunological parameters and small intestinal morphology of piglets

項(xiàng)目Item二次方程Quadraticequation乳鐵蛋白/(mg·kg-1)LF腹瀉率Diarrhearatey=0．00004x2-0．0283x+8．0841(R2=0．9950，r=0．9975)353．75免疫球蛋白IgGy=-0．000005x2+0．0037x+13．455(R2=0．8622，r=0．9285)370．00溶菌酶LSZy=-0．0024x2+1．5726x+399．11(R2=0．9473，r=0．9732)327．63一氧化氮NOy=-0．0002x2+0．0999x+34．555(R2=0．8856，r=0．9411)249．75十二指腸隱窩深度Duodenumcryptdepthy=0．0002x2-0．1026x+118．7(R2=0．9879，r=0．9939)256．50十二指腸絨毛長度/隱窩深度DuodenumV/Cy=-0．000006x2±0．0037x+1．8447(R2=0．8567，r=0．9256)308．33空腸絨毛長度Jejunumvillusheighty=-0．0008x2±0．415x+170．08(R2=0．9586，r=0．9790)259．38空腸隱窩深度Jejunumcryptdepthy=0．0002x2-0．0959x+139．48(R2=0．9565，r=0．9780)239．75空腸絨毛長度/隱窩深度JejunumV/Cy=-0．00001x2±0．0073x+0．83(R2=0．9999，r=0．9999)365．00

不同小、大寫字母表示同一組織不同處理的差異顯著或極顯著 (P<0.05， P<0.01)。**.表示同一處理組織間差異極顯著(P<0.01)；*.表示同一處理組織間差異顯著(P<0.05)。下圖同The different upper and lower case letters indicate significant differences or highly significant difference between different groups in the same tissue(P<0.01，P<0.05).**.Indicate extremely significant difference between different tissues in the same group(P<0.01)；*.Indicate significant difference between different tissues in the same group(P<0.05).The same as below圖1 滇撒配套系仔豬組織中Hepcidin基因表達(dá)趨勢Fig.1 Expression trend of Hepcidin in Diansa weaning piglets

2.6 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬組織pBD-1、pBD-2、pBD-3 mRNA表達(dá)量的影響

2.6.1 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬組織pBD-1mRNA表達(dá)量的影響 由圖2可以看出，在心中，添加量為250 mg·kg-1時pBD-1的表達(dá)量最高，差異極顯著(P<0.01)，抗生素組的表達(dá)量最低。在肝中，3個乳鐵蛋白組均極顯著地高于對照組與抗生素組(P<0.01)，當(dāng)添加量為500 mg·kg-1時，pBD-1的表達(dá)量最高，抗生素組的表達(dá)量最低，與對照組無顯著性差異(P>0.05)。在脾中，添加量為250 mg·kg-1時，pBD-1的表達(dá)量最高，差異極顯著(P<0.01)。

組織之間，心的表達(dá)量最高，其中抗生素組和250 mg·kg-1組心組織的表達(dá)量極顯著的高于肝和脾(P<0.01)，其余的組均差異顯著(P<0.05)，脾的表達(dá)量高于肝。

圖2 滇撒配套系仔豬組織中pBD-1基因表達(dá)趨勢Fig.2 Expression trend of pBD-1 in Diansa weaning piglets

2.6.2 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬組織pBD-2mRNA表達(dá)量的影響 由圖3可以看出，在心中，隨著乳鐵蛋白的添加，pBD-2的表達(dá)量呈上升趨勢，當(dāng)添加量為125 mg·kg-1時pBD-2的表達(dá)量最高，隨后降低，500 mg·kg-1組的表達(dá)量最低。在肝中，隨著乳鐵蛋白的添加，pBD-2的表達(dá)量呈上升趨勢，當(dāng)添加量為125 mg·kg-1時，pBD-2的表達(dá)量最高，3個添加量的表達(dá)量均高于對照組，其中當(dāng)添加量為125和250 mg·kg-1時極顯著高于對照組(P<0.01)。在脾中，添加量為250 mg·kg-1時的表達(dá)量最高，差異極顯著(P<0.01)，抗生素組的表達(dá)量最低，差異極顯著(P<0.01)。

組織之間，除了對照組和抗生素組中肝組織的表達(dá)量顯著高于心和脾外(P<0.05)，其余的均極顯著高于心和脾(P<0.01)?？股亟M的心組織的表達(dá)量顯著高于脾(P<0.05)，其余的組中二者均無顯著性差異(P>0.05)。

2.6.3 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬組織pBD-3 mRNA表達(dá)量的影響 由圖4可以看出，在心中，隨著乳鐵蛋白的添加，PBD-3的表達(dá)量呈上升趨勢，添加量為250 mg·kg-1時，pBD-3的表達(dá)量最高。肝組織中，乳鐵蛋白組均極顯著高于對照組(P<0.01)。在脾中，抗生素組的表達(dá)量最低，與對照組差異不顯著(P>0.05)。

組織之間，500 mg·kg-1組中，脾組織pBD-3的表達(dá)量分別顯著或極顯著高于心和肝(P<0.05，P<0.01)，而心的表達(dá)量極顯著高于肝組織(P<0.01)。除了500 mg·kg-1組外，均是心組織的表達(dá)量極顯著高于肝和脾(P<0.01)，且肝和脾無顯著性差異(P>0.05)。

圖3 滇撒配套系仔豬組織中pBD-2基因表達(dá)趨勢Fig.3 Expression trend of pBD-2 in Diansa weaning piglets

圖4 滇撒配套系仔豬組織中pBD-3基因表達(dá)趨勢Fig.4 Expression trend of pBD-3 in Diansa weaning piglets

3 討 論

3.1 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬生產(chǎn)性能的影響

Y.Wang等發(fā)現(xiàn)，日糧中添加乳鐵蛋白能夠改善斷奶仔豬的日增重和料重比[3]；張凱等發(fā)現(xiàn)添加乳鐵蛋白能夠降低斷奶仔豬的腹瀉率[9]。Z.Tang等在早期斷奶仔豬日糧中添加牛乳鐵蛋白衍生肽lactoferampin與lactoferricin，日增重比對照組提高21%，且能夠促進(jìn)仔豬腹瀉恢復(fù)[10]。本試驗(yàn)中，添加250和500 mg·kg-1的乳鐵蛋白能夠提高仔豬的日增重，并且能夠降低這兩個組的腹瀉率，這與以上研究結(jié)果基本一致。

3.2 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬血清免疫參數(shù)的影響

IgG是機(jī)體內(nèi)重要的免疫球蛋白之一，參與體液免疫反應(yīng)。X.S.Tang等在仔豬日糧中添加乳鐵蛋白的重組多肽能夠提高仔豬體內(nèi)的IgG含量[11]，本試驗(yàn)中250和500 mg·kg-1組的IgG含量顯著高于對照組，這與上述研究結(jié)果一致，抗生素組與3個乳鐵蛋白組均無顯著差異，說明乳鐵蛋白可改善斷奶仔豬的免疫力。溶菌酶具有溶菌的作用，是體內(nèi)吞噬細(xì)胞活化的指示因子，本試驗(yàn)中乳鐵蛋白組極顯著的高于對照組，結(jié)果提示，乳鐵蛋白可提高機(jī)體的免疫能力。據(jù)報(bào)道，日糧中添加乳鐵蛋白能夠提高亞洲鯰魚的溶菌酶的活力[12]。本試驗(yàn)中，抗生素組的溶菌酶活力雖然高于3個乳鐵蛋白組，但差異不顯著，這提示，乳鐵蛋白在提高血清溶菌酶活力方面具有類似抗生素的效果。LDH在國際上是用來評價細(xì)胞整體損傷的檢測指標(biāo)，它存在于各個組織器官中，由于細(xì)胞損傷時發(fā)生腸溶作用將其釋放，存在于細(xì)胞外。本試驗(yàn)中幾個組之間的LDH無顯著性差異，結(jié)果顯示，乳鐵蛋白的添加并沒有影響斷奶仔豬的正常細(xì)胞功能。NO是L-Arg在一氧化氮合酶的作用下合成的內(nèi)皮細(xì)胞衍生舒張因子[13]，NO參與調(diào)節(jié)機(jī)體的特異性體液免疫反應(yīng)。本試驗(yàn)中，3個乳鐵蛋白組NO極顯著或顯著的高于對照組，本結(jié)果提示，乳鐵蛋白可提高機(jī)體的免疫力，效果可能優(yōu)于抗生素的效果。NOS有3種類型，包括神經(jīng)型(nNOS)、誘導(dǎo)型(iNOS)和內(nèi)皮型(eNOS)，其中iNOS催化生成的NO較多，且時間長，在正常情況下，iNOS基因并不表達(dá)，但在受到炎癥因子和細(xì)菌毒素誘導(dǎo)下則高度表達(dá)[14-16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，NOS無顯著性差異，可能是由于乳鐵蛋白未誘導(dǎo)iNOS表達(dá)。TIBC表明測定血清中的轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵的最大能力，間接反映血清轉(zhuǎn)鐵蛋白的含量。在日糧中添加不同水平乳鐵蛋白均能夠提高亞洲鯰魚的總鐵結(jié)合力，其中800 mg·kg-1的添加水平顯著高于對照組[12]。本試驗(yàn)中，乳鐵蛋白組TIBC極顯著高于對照組和抗生素組，這與以上結(jié)果基本一致。

3.3 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬小腸形態(tài)學(xué)的影響

腸道是豬最重要的消化器官，豬消化道內(nèi)環(huán)境在促進(jìn)養(yǎng)分吸收及防止飼料或環(huán)境中的病原菌侵入等方面具有重要作用。仔豬小腸絨毛長度和隱窩深度的改變反映小腸形態(tài)學(xué)及其功能的重要變化。大量試驗(yàn)證明，乳鐵蛋白能增加小腸絨毛高度，降低隱窩深度。Y.Wang等發(fā)現(xiàn)，在斷奶仔豬的日糧中添加乳鐵蛋白能夠顯著提高小腸中段的絨毛長度和顯著降低其隱窩深度(15.30%，9.60%，P<0.05)[3]；A.Blais等發(fā)現(xiàn)，添加乳鐵蛋白能夠提高小鼠的空腸絨毛長度[17]。本試驗(yàn)中，250 mg·kg-1乳鐵蛋白組能夠提高十二指腸、空腸、回腸的絨毛長度，并且降低隱窩深度，提高了絨毛長度與隱窩深度的比值。這與以上研究是一致的。

3.4 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬組織Hepcidin基因表達(dá)的影響

2000年分別從人的血漿和尿液分離獲得Hepcidin。Hepcidin是一種主要在肝高效特異表達(dá)的富含半胱氨酸的新型抗菌肽，屬抗菌肽中防御素(Defensin)蛋白家族，與許多富含半胱氨酸的抗菌肽類似，Hepcidin 同樣具有抗多種真菌和細(xì)菌等活性。

T.Ganz研究表明，Hepcidin主要在肝中合成，這與本試驗(yàn)結(jié)果中肝的表達(dá)量極顯著高于心與脾是一致的[18]。Hepcidin受血清和肝中鐵的濃度和紅血球生成中對鐵的需求調(diào)控，G.Nicolas等發(fā)現(xiàn)Hepcidin抑制小腸對鐵的吸收和促進(jìn)鐵在網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞的滯留，當(dāng)鐵超過需求時，Hepcidin被誘導(dǎo)表達(dá)升高進(jìn)而抑制鐵的吸收[19]，后來又發(fā)現(xiàn)Hepcidin組成性表達(dá)能抑制鐵的超負(fù)荷[20]。在本試驗(yàn)中，乳鐵蛋白的添加提高了肝和脾中Hepcidin的表達(dá)，說明乳鐵蛋白作為鐵源誘導(dǎo)了抗菌肽Hepcidin的表達(dá)。本試驗(yàn)中，250 mg·kg-1乳鐵蛋白組斷奶仔豬的血清中IgG和溶菌酶均較高，說明在適宜水平的乳鐵蛋白的調(diào)節(jié)下，斷奶仔豬的免疫力得到了提高，在肝中250 mg·kg-1組的表達(dá)水平最高，這與血清免疫參數(shù)的趨勢是一致的。

3.5 乳鐵蛋白對滇撒配套系仔豬β-defensin基因表達(dá)的影響

Defensin家族的抗菌肽廣泛分布在許多哺乳動物、昆蟲和植物體內(nèi)。Defensins可進(jìn)一步分為組成型和誘導(dǎo)型，組成型的防御素在炎癥和感染期間的表達(dá)量保持不變，而誘導(dǎo)型在炎癥或者感染期間表達(dá)量會增加[21]，pBD-1、pBD-3屬于組成型[22]，而pBD-2是誘導(dǎo)型[23]。pBD-1廣泛地分布在豬組織中，特別是舌黏膜[24]。pBD-1基因在炎癥和感染期間是被組成性的表達(dá)，不受誘導(dǎo)，盡管其與很多誘導(dǎo)性上皮β-defensins的氨基酸序列、基因組結(jié)構(gòu)、表達(dá)和位點(diǎn)相似[25]。本試驗(yàn)中，在心和脾中250 mg·kg-1乳鐵蛋白組的pBD-1表達(dá)量極顯著高于其他組，在肝中乳鐵蛋白組的表達(dá)量均極顯著的高于對照組和抗生素組，表明乳鐵蛋白的添加促進(jìn)了pBD-1基因的表達(dá)，而在心、肝和脾中不同的表達(dá)趨勢可能與pBD-1組成型表達(dá)有關(guān)。信號途徑誘導(dǎo)β-防御素2的表達(dá)，其中AP-1和NF-кB的作用較為突出，該基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)近端的2個NF-кB位點(diǎn)是轉(zhuǎn)錄表達(dá)所必需的[26]。在肝中，3個乳鐵蛋白組的表達(dá)量均高于或顯著高于對照組，說明乳鐵蛋白的添加能夠誘導(dǎo)肝中pBD-2基因的表達(dá)，心中125 mg·kg-1添加水平組和脾中250 mg·kg-1添加水平組均表達(dá)最高，心和脾中的表達(dá)量可能并不直接受乳鐵蛋白的誘導(dǎo)。這種表達(dá)趨勢可能是由于乳鐵蛋白中的某種成分活化了NF-кB因子，NF-кB因子作為多個基因的起始近端的調(diào)控子能夠控制基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)pBD-2基因的表達(dá)。本試驗(yàn)中，除500 mg·kg-1組外，pBD-3均是心的表達(dá)量高于肝和脾。3個添加水平均能極顯著提高肝和脾中pBD-3基因的表達(dá)，說明乳鐵蛋白的添加誘導(dǎo)了肝和脾中pBD-3基因的表達(dá)，而在心中250 mg·kg-1添加水平極顯著高于對照組的表達(dá)量，誘導(dǎo)了基因的表達(dá)。

4 結(jié) 論

4.1 在飼糧中添加適宜水平乳鐵蛋白可明顯改善滇撒配套系仔豬生產(chǎn)性能，顯著降低仔豬腹瀉率。綜合生產(chǎn)性能、血液參數(shù)和小腸形態(tài)學(xué)二次曲線結(jié)果，在本試驗(yàn)條件下乳鐵蛋白的適宜添加量為250～300 mg·kg-1。

4.2 飼糧中添加乳鐵蛋白可提高血清中IgG、NO含量，LZM活性和 TIBC，在一定程度上改善LDH活性；乳鐵蛋白能夠改善仔豬小腸黏膜形態(tài)和生物功能。

4.3 飼糧中添加乳鐵蛋白誘導(dǎo)了滇撒配套系仔豬的心、肝和脾中Hepcidin和pBD-1、pBD-2、pBD-3基因的表達(dá)，從而改善其抗病能力。

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(編輯 郭云雁)

The Effect of Different Levels of Lactoferrin on the Growth Performance，Small Intestinal Morphology and Body Resistance to Disease of Diansa Weaning Piglets

AN Qing-cong#，XU Na-na#，ZHANG Chun-yong，PAN Hong-bin，LI Mei-quan，CHEN Ke-lin，GUO Rong-fu*

(KeyLaboratoryofAnimalNutritionandFeedofYunnanProvince，CollegeofAnimalScienceandTechnology，YunnanAgriculturalUniversity，Kunming650201，China)

This experiment was conducted to investigate the effects of different levels of lactoferrin(LF) on growth performance，intestinal protection and the body resistance to disease of Diansa weaning piglets.Two hundred and forty healthy Diansa weaning piglets，(28±2) days of age with(6.56±0.75) kg of average body weight，were allocated randomly to 5 groups，48 for each group，and each had 6 replicates with 8 piglets per replicate.They were fed with basal diet(control group)，basal diet + 125 mg·kg-1LF，basal diet + 250 mg·kg-1LF，basal diet + 500 mg·kg-1LF and antibiotics positive group(50 mg·kg-1terramycin)，respectively.The trial period lasted 42 d.At the end，24 piglets，with 4 piglets in each replicate per each group，were selected，and the test piglets were collected blood from precava，then serum were separated.The IgG and NO content，LDH，NOS and LSZ activity and TIBC of serum were detected.Six piglets，1 piglet in each replicate per each group，were slaughtered.The heart，liver and spleen were collected to detect Hepcidin and β defense 1(pBD-1)，β defense 2(pBD-2) and β defense 3(pBD-3) genes mRNA expression.The results showed that：1) The final weight，ADG and ADFI of 250 mg·kg-1LF group were significantly higher than those of control group and terramycin group(P<0.05)，feed conversion and diarrhea rate were significantly lower than those of control group and terramycin group(P<0.05).2) IgG levels，NO content of 250 mg·kg-1LF group were significantly higher than those of control group(P<0.05)，TIBC of 250 mg·kg-1LF group were extremely significantly higher than those of control group and terramycin group(P<0.01).V/C of duodenum，villus height and V/C of jejunum，villus height and V/C of ileum in 250 mg·kg-1LF group were extremely significantly higher than those in control group and terramycin group(P<0.01)，crypt depth of ileum in 250 mg·kg-1LF group were extremely significantly lower than those in control group(P<0.01).Results showed that diarrhea rate，IgG，NO，LSZ，crypt depth of duodenum，V/C of duodenum，villus height of jejunum，crypt depth of jejunum，V/C of jejunum increased with a quadratic curve by the LF adding levels(P<0.05)；3)HepcidinmRNA expression in heart and liver of piglets in 250 mg·kg-1LF group were extremely significantly higher than those of control group and terramycin group(P<0.01).HepcidinmRNA expression in liver in 125 mg·kg-1LF group were significantly higher than those of control group and terramycin group(P<0.05).TheHepcidinmRNA expression in liver was extremely significantly higher than that in the heart and spleen(P<0.01).ThepBD-1 mRNA expression in the heart and spleen in 250 mg·kg-1LF group were extremely significantly higher than those of the other groups(P<0.01).ThepBD-2 mRNA expression in liver was significantly or extremely significant higher than those in heart and the spleen(P<0.05，P<0.01).When the adding level was 250 mg·kg-1，thepBD-3 mRNA expression in heart and spleen were extremely significantly higher than the other groups(P<0.01).Results suggest that adding LF in the diet can obviously improve the growth performance，serum immunological parameters and small intestinal morphology of Diansa weaning piglets，and enhance piglets disease resistance through inducing genes expression ofHepcidin，pBD-1，pBD-2，pBD-3 in heart，liver and spleen of Diansa weaning piglets.In this experimental conditions，based on quadratic curve results of growth performance，serum immunological and small intestinal morphology parameters，the adequate amount of LF in Diansa weaning piglets diet was 250-300 mg·kg-1.

Diansa weaning piglets；lactoferrin；immunological parameters；small intestinal morphology；Hepcidin；β defense

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.012

2015-02-05

云南省重大科技專項(xiàng)(2012ZA018)；云南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(云財(cái)教【2013】160號)

安清聰(1968-)，女，甘肅靖遠(yuǎn)人，博士，副教授，主要從事單胃動物營養(yǎng)與免疫分子基礎(chǔ)研究，E-mail：naccynaccy@163.com；徐娜娜(1990-)，女，山東安丘人，碩士，主要從事豬的營養(yǎng)與免疫研究，E-mail：738908970@qq.com。二者并列為第一作者

*通信作者：郭榮富，博士，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：rongfug@163.com

S828；S815.4

A

0366-6964(2015)12-2206-12