張亞妮，王穎潔，左其生，李 東，張 蕾，湯貝貝，連 超，畢瑜林，張文慧，李碧春

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 江蘇省動(dòng)物遺傳繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009)

5-Azadc 和TSA對(duì)雞Nanog基因啟動(dòng)活性及ESC多能性維持的影響

張亞妮，王穎潔，左其生，李 東，張 蕾，湯貝貝，連 超，畢瑜林，張文慧，李碧春*

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 江蘇省動(dòng)物遺傳繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009)

旨在克隆如皋黃雞Nanog基因啟動(dòng)子，并構(gòu)建含有雙熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)載體進(jìn)行啟動(dòng)子活性分析，找出該基因啟動(dòng)子的核心調(diào)控區(qū)；探索甲基化抑制劑5-Azadc (5-Aza-2′-deoxycytidine)或曲古抑菌素 (Trichostatin A，TSA)對(duì)Nanog基因啟動(dòng)活性及其ESC體外培養(yǎng)條件下多能性維持的影響，為初步闡明Nanog基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。PCR擴(kuò)增Nanog基因不同長(zhǎng)度片段的啟動(dòng)子序列，定向克隆至pGL3-basic載體和pEGFP-N1構(gòu)建重組載體；將重組載體轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞后，48 h收集蛋白，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定其轉(zhuǎn)錄活性，確定基本轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)；將重組載體轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞后添加5-Azadc或TSA對(duì)Nanog基因進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，分析其對(duì)Nanog基因啟動(dòng)子活性的影響。選取生長(zhǎng)至第3代的ESC，培養(yǎng)基中添加最適濃度的 5-Azadc和TSA，每隔兩天觀察細(xì)胞，分析其對(duì)ESC體外多能性維持的影響，并對(duì)誘導(dǎo)至第10天的細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)。結(jié)果表明，成功構(gòu)建3個(gè)片段的雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體；雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，pGL3/1967活性最強(qiáng)；分別添加或者聯(lián)合添加5-Azadc和TSA均可使Nanog基因的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)；5-Azadc和TSA誘導(dǎo)對(duì)ESC體外培養(yǎng)條件下多能性維持的影響結(jié)果顯示，誘導(dǎo)6 d 后，對(duì)照組細(xì)胞大量分化，細(xì)胞克隆無(wú)法維持，而5-Azadc和TSA誘導(dǎo)組克隆明顯，5-Azadc+TSA聯(lián)合誘導(dǎo)組細(xì)胞克隆數(shù)量顯著多于對(duì)照組；誘導(dǎo)至第10天，對(duì)照組細(xì)胞完全分化，沒有細(xì)胞克隆，而誘導(dǎo)組存在大量細(xì)胞克隆，聯(lián)合誘導(dǎo)組克隆數(shù)量顯著多于其他兩組；SSEA-1間接免疫熒光結(jié)果顯示，對(duì)照組沒有明顯的ESC克隆，而5-Azadc組和聯(lián)合誘導(dǎo)組細(xì)胞克隆明顯，綜上表明，5-Azadc和TSA可有效地通過提高Nanog基因的表達(dá)而維持雞ESC在體外培養(yǎng)過程中的多能性。

Nanog基因；啟動(dòng)子；5-Azadc；TSA；雙熒光素酶活性檢測(cè)系統(tǒng)

Nanog蛋白是含有同源盒結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子[1]，由305個(gè)氨基酸組成，其中C端有強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域而N端有弱的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，在維持ESC的多能性過程中起著關(guān)鍵性調(diào)控作用[2]。

過表達(dá)Nanog的ESC在沒有LIF的培養(yǎng)條件下經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后，仍具有很強(qiáng)的自我復(fù)制能力，而且體外誘導(dǎo)試驗(yàn)均證明這些ESC具有多能性[3-4]。Nanog過表達(dá)時(shí)ESC可在無(wú)飼養(yǎng)層的條件下分裂并保持多能性[5-6]；I.Chambers等[4]將成年小鼠神經(jīng)細(xì)胞與高表達(dá)Nanog的ESC混合培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，成年小鼠神經(jīng)細(xì)胞也表現(xiàn)出ESC的特征。J.Zhang 等[7]用Nanog基因轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，Nanog的表達(dá)使高度分化的成纖維細(xì)胞重新進(jìn)入S期；J.Yu等[8]利用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的Nanog基因轉(zhuǎn)染人成纖維細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，人成纖維細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為多能細(xì)胞；J.Silva等[9]發(fā)現(xiàn)Nanog基因在成體細(xì)胞重獲多能性的過程中起著關(guān)鍵的作用；在骨骼和成纖維細(xì)胞等已分化的成體組織中沒有檢測(cè)到Nanog基因的表達(dá)[10]； T.Nishii等[11]研究表明，CIBZ(a BTB domain zinc finger transcriptional factor)依賴Nanog基因的表達(dá)來(lái)維持ESC的多能性；A.H.Hart等[12]研究表明，Nanog基因在ESC中高表達(dá)，而在ESC分化過程中其表達(dá)水平下調(diào)；由此推測(cè)，Nanog基因的表達(dá)激活有利于維持ESC的多能性，而其表達(dá)抑制則導(dǎo)致ESC分化發(fā)生。在分化的細(xì)胞中Nanog表達(dá)受到限制，說(shuō)明在分化細(xì)胞中有抑制Nanog基因表達(dá)的信號(hào)途徑，因此在維持干細(xì)胞多能性的過程中如何解除這種抑制作用是提高維持干細(xì)胞多能性的有效措施之一。目前人們對(duì)雞Nanog基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及其調(diào)控基因的作用方式尚屬空白，研究雞Nanog基因的表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)于闡明禽類胚胎干細(xì)胞多能性維持和分化的分子機(jī)理具有重要意義。本研究擬克隆如皋黃雞Nanog基因啟動(dòng)子5′側(cè)翼區(qū)不同長(zhǎng)度片段的啟動(dòng)子序列，插入到pGL3-Basic構(gòu)建重組載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)尋找Nanog基因核心啟動(dòng)子區(qū)，檢測(cè)Nanog基因啟動(dòng)子活性的變化，尋找Nanog基因的核心啟動(dòng)子區(qū)，并初步探索5-Azadc和TSA對(duì)Nanog基因啟動(dòng)活性的影響，以期在體外培養(yǎng)條件下提高Nanog基因的表達(dá)量，維持雞ESC在體外培養(yǎng)過程中的多能性，以幫助人們更好地對(duì)雞ESC進(jìn)行體外遺傳修飾和定向誘導(dǎo)分化研究，為生產(chǎn)抗病轉(zhuǎn)基因雞和具有特殊治療功能的蛋白質(zhì)提供技術(shù)支持，并為ESC在再生醫(yī)學(xué)、細(xì)胞工程和藥物研制等領(lǐng)域的應(yīng)用提供相關(guān)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試劑

如皋黃雞來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所。大腸桿菌DH5α感受態(tài)、膠回收試劑盒及小提質(zhì)粒試劑盒均購(gòu)自北京天根公司，DL 5000 DNA Marker Prime、STAR?Max DNA Polymerase、T4 DNA連接酶及限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自大連寶生物公司，表達(dá)載體pGL3.0-Basic、pRL-SV40 及雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒 Dual-Luciferase?Reporter Assay System 均購(gòu)自Promega 公司，LipofectamineTM2000 購(gòu)自 Invitrogen公司，5-Azadc和TSA購(gòu)自SIGMA公司，雞胚胎成纖維細(xì)胞系(DF-1)購(gòu)自ATCC。其余試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。引物合成及測(cè)序由上海英濰捷基公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法1.2.1 生物信息學(xué)分析 利用在線軟件TFsearch(http：//www.cbrc.jp/research/db/Tfsearch.html)和AliBaba 2.1(http：//www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html)對(duì)Nanog基因啟動(dòng)子區(qū)及其潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。利用軟件(http：//www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer_results.cgi)對(duì)Nanog基因的甲基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.2 基因組DNA的提取 酚氯仿法(參考《分子克隆試驗(yàn)指南》(第2版))提取成年如皋黃雞基因組DNA。測(cè)定260 nm/280 nm的OD比值及DNA濃度，-20 ℃保存、備用。

1.2.3 如皋黃雞Nanog基因啟動(dòng)子區(qū)不同片段的擴(kuò)增 根據(jù)GenBank 上原雞Nanog基因序列(GeneID：NC_006088))翻譯起始位點(diǎn)(ATG)上游3 000 bp 區(qū)域的序列特征分析結(jié)果，在上下游引物的5′端分別引入XhoⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)和相應(yīng)的保護(hù)堿基，設(shè)計(jì)不同片段長(zhǎng)度的上游引物及共同下游引物。引物序列見表1。

表1Nanog基因啟動(dòng)子不同長(zhǎng)度片段引物序列

Table 1 The sequence of primers for constructing the vector ofNanoggene

引物名稱Name片段長(zhǎng)度/bpFragment上游引物序列(5′→3′)Forwardprimer下游引物序列(5′→3′)ReverseprimerpGL3?30493049(-3049～+1)CGGGGTACCAAGGGGGCTTAACGTAACACATGGGpGL3?19671967(-1967～+1)CGGGGTACCCCAGCAGTACAAGCTCCGAAGCpGL3?988988(-988～+1)CGGGGTACCACAAGTGAGATGAGAAAATCAAAAGCCGCTCGAGGTCCGCA?CCTAACAGAGCCGTA

以雞基因組DNA為模板，通過PrimeSTAR?Max DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增不同長(zhǎng)度片段，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后進(jìn)行膠回收，將純化、加A后的PCR產(chǎn)物與pMDTM-19T Vector連接，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，經(jīng)雙酶切鑒定及測(cè)序正確后，構(gòu)建正確的TA克隆載體。

1.2.4Nanog基因啟動(dòng)子不同片段重組載體的構(gòu)建 用KpnⅠ和XhoⅠ分別雙酶切克隆載體和pGL3.0-basic載體，酶切片段回收純化后，連接。轉(zhuǎn)化后，經(jīng)雙酶切鑒定及測(cè)序正確后，分別命名pGL3/3049、pGL3/1967、pGL3/988。

1.2.5Nanog基因啟動(dòng)子定性分析 將細(xì)胞接種于12孔板，細(xì)胞濃度約5×105孔-1，待細(xì)胞完全貼壁生長(zhǎng)至80%左右時(shí)，參照LipofectamineTM2000使用說(shuō)明書，將重組質(zhì)粒pEGFP-N1/3049轉(zhuǎn)染至DF-1細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組(pEGFP-N1轉(zhuǎn)染細(xì)胞)和陰性對(duì)照組(pEGFP-N1-CMV-轉(zhuǎn)染細(xì)胞)，轉(zhuǎn)染24 h 后于熒光倒置顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況。

1.2.6 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及其5-Azadc 和TSA誘導(dǎo)對(duì)Nanog基因啟動(dòng)子活性的影響 轉(zhuǎn)染前，將細(xì)胞接種于24孔板，細(xì)胞數(shù)2.5×105孔-1，待細(xì)胞完全貼壁生長(zhǎng)至80%左右時(shí)，參照LipofectamineTM2000使用說(shuō)明書，分別將重組質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-SV40以35∶1的比例共轉(zhuǎn)染至DF-1細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組(pGL3-basic質(zhì)粒與pRL-SV40質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染)，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測(cè)。每組3次重復(fù)。

轉(zhuǎn)染后12 h 換液時(shí)，添加不同濃度的5-Azadc 和TSA對(duì)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的DF-1細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，36 h后進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測(cè)，找到最適宜的誘導(dǎo)濃度。然后以最適濃度設(shè)立5-Azadc 和TSA單獨(dú)誘導(dǎo)組或聯(lián)合添加誘導(dǎo)組，通過檢測(cè)雙熒光素酶活性檢測(cè)二者的誘導(dǎo)效果。

1.2.7 雙熒光素酶活性檢測(cè) 將收集后的細(xì)胞用70 μL的PBS重懸后，加入到96孔酶標(biāo)板中，參照Dual-Luciferase?Reporter Assay System試劑盒說(shuō)明書步驟，檢測(cè)雙熒光素酶活性。啟動(dòng)子活性值為熒光素酶相對(duì)活性值(Relative luciferase activity)即螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。

1.2.8 5-Azadc 和TSA誘導(dǎo)對(duì)ESC體外培養(yǎng)條件下多能性的影響 為了驗(yàn)證5-Azadc 和TSA對(duì)ESC體外多能性的影響，選擇第3代生長(zhǎng)良好的ESC接種到24孔板中，接種密度為105孔-1，培養(yǎng)基中添加最適濃度的5-Azadc 和TSA進(jìn)行誘導(dǎo)。接種后每隔2 d在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，并對(duì)誘導(dǎo)至第10 天 的細(xì)胞進(jìn)行SSEA-1間接免疫熒光檢測(cè)。

推薦理由:憲法上的基本權(quán)利，是有效力的法規(guī)范。建構(gòu)基于憲法文本的解釋方案，厘清基本權(quán)利條款的規(guī)范結(jié)構(gòu)和規(guī)范內(nèi)涵，使之在技術(shù)層面上成為可以適用的規(guī)范，是憲法學(xué)的基本任務(wù)?！痘緳?quán)利的規(guī)范建構(gòu)（增訂版）》是基本權(quán)利總論領(lǐng)域的體系性著作，圍繞基本權(quán)利的功能，基本權(quán)利的國(guó)家義務(wù)，基本權(quán)利的保護(hù)范圍、限制、競(jìng)合、沖突等問題進(jìn)行了教義學(xué)建構(gòu)，并回應(yīng)了中國(guó)法治實(shí)踐中的眾多基本權(quán)利問題。

2 結(jié) 果

2.1 雞Nanog基因啟動(dòng)子區(qū)生物信息學(xué)分析和甲基化水平檢測(cè)

對(duì)Nanog啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域預(yù)測(cè)后發(fā)現(xiàn)，在Nanog基因啟動(dòng)子的-3 049 ～-1 967 bp存在GCNF、Tcf3和P53等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，而在-1 967 ～-988 bp存在p300和SP1/SP3等調(diào)控元件。甲基化預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，在-1 387～-1 285 bp 和-157 ～+56 bp分別存在101 和103 bp的CpG島。

2.2 雞Nanog基因啟動(dòng)子區(qū)不同長(zhǎng)度片段的PCR擴(kuò)增

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明，所獲得的不同長(zhǎng)度片段的PCR產(chǎn)物大小分別與預(yù)期設(shè)計(jì)的長(zhǎng)度相一致(圖1)，表明成功獲得了目的DNA片段。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～3. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M.1 kb DNA marker;1-3. PCR products圖1 Nanog基因不同長(zhǎng)度片段啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR products of different length promoters

2.3 雞Nanog基因啟動(dòng)子不同長(zhǎng)度片段載體的構(gòu)建

用KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切3個(gè)不同長(zhǎng)度片段載體，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖2)，分別獲得相應(yīng)啟動(dòng)子片段和載體片段兩條清晰的條帶，大小與預(yù)期結(jié)果相符合，且測(cè)序結(jié)果經(jīng)對(duì)比后也一致，說(shuō)明載體構(gòu)建正確，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、3、5.pGL3/3049、pGL3/1967和pGL3/988重組質(zhì)粒雙酶切；2、4、6.pGL3/3049、pGL3/1967和pGL3/988重組質(zhì)粒單酶切M.DL5 000 DNA marker；1，3，5.Double restriction enzyme digestion products of pGL3/3049，pGL3/1967 and pGL3/988；2，4，6.Single restriction enzyme digestion products of pGL3/3049，pGL3/1967 and pGL3/988圖2 pGL3/3049、pGL3/1967和pGL3/988重組載體的酶切鑒定Fig.2 Identification of pGL3/3049，pGL3/1967 and pGL3/988 by restriction enzyme digestion

2.4 雞Nanog基因啟動(dòng)子活性的定性分析

為檢測(cè)片段-3 049～+1 bp 是否具有啟動(dòng)子活性，將pEGFP-N1/3049、pEGFP-N1、pEGFP-N1-CMV-轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞。結(jié)果表明，pEGFP-N1/3049轉(zhuǎn)染的DF-1細(xì)胞表達(dá)GFP(圖3A)，但其熒光強(qiáng)度較強(qiáng)啟動(dòng)子CMV驅(qū)動(dòng)的陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pEGFP-N1弱(圖3B)，而缺失CMV的陰性對(duì)照質(zhì)粒pLinker-EGFP-在細(xì)胞中未檢測(cè)到GFP的表達(dá)(圖3C)。 因此，-3 049～+1 bp片段具有啟動(dòng)子活性。

圖3 雞Nanog基因啟動(dòng)子-3 049～+1 bp片段的活性檢測(cè) 40×Fig.3 The promoter activity detection of chicken Nanog -3 049-+1 bp 40×

用構(gòu)建的3個(gè)重組載體和pRL-SV40載體分別共轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，pGL3-Basic質(zhì)粒作為陰性對(duì)照，檢測(cè)各自啟動(dòng)子活性(圖4)。結(jié)果表明：與pGL3-Basic相比較，雞Nanog基因啟動(dòng)子系列缺失片段都表現(xiàn)出一定的活性，重組質(zhì)粒pGL3/1967的啟動(dòng)子活性最強(qiáng)，說(shuō)明Nanog基因啟動(dòng)子的-1 967～-998 bp和-3 049 ～-1 967 bp具有重要的調(diào)控元件。

圖4 Nanog基因啟動(dòng)子不同長(zhǎng)度片段在DF-1細(xì)胞中的活性Fig.4 Activity of different promoters of Nanog gene DF-1 cells

2.6 5-Azadc和TSA誘導(dǎo)對(duì)Nanog基因啟動(dòng)子活性的影響

由圖4可知，pGL3/1967的活性最高，因此選-1 967～+1 bp進(jìn)行誘導(dǎo)活性檢測(cè)。DF-1細(xì)胞經(jīng)pGL3/1967轉(zhuǎn)染后，采用不同濃度梯度(終濃度分別為1、5、10和15 μmol·L-1)的5-Azadc對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)，通過檢測(cè)雙熒光素酶活性確定最佳誘導(dǎo)濃度。不同濃度的誘導(dǎo)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，終濃度為10 μmol·L-1的5-Azadc的誘導(dǎo)效率最高(圖5A)。Nanog基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化檢測(cè)結(jié)果顯示，用5-Azadc處理后明顯降低了Nanog基因的甲基化水平。分別設(shè)置4個(gè)不同濃度梯度(0.1、0.5、1.0和1.5 μmol·L-1)的TSA進(jìn)行誘導(dǎo)，終濃度為1.0和1.5 μmol·L-1時(shí)可極顯著提高其啟動(dòng)活性(圖5B)。因此，選擇TSA的最佳誘導(dǎo)濃度為1.0 μmol·L-1。

用pGL3/1967轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞后，培養(yǎng)基中分別單獨(dú)添加或者聯(lián)合添加終濃度為10 μmol·L-15-Azadc、1.0 μmol·L-1TSA對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)。結(jié)果顯示，聯(lián)合添加5-Azadc和TSA后使-1 967～+1 bp片段的轉(zhuǎn)錄活性顯著高于單獨(dú)添加組(圖5 C)。

2.7 5-Azadc和TSA誘導(dǎo)激活Nanog基因維持ESC體外培養(yǎng)多能性的影響

取培養(yǎng)第3代純化后的ESC細(xì)胞進(jìn)行5-Azadc和TSA的誘導(dǎo)試驗(yàn)，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)6 d后，對(duì)照組細(xì)胞大量分化，細(xì)胞克隆無(wú)法維持，而5-Azadc和TSA誘導(dǎo)組克隆明顯，5-Azadc+TSA聯(lián)合誘導(dǎo)組細(xì)胞克隆數(shù)量顯著多于對(duì)照組；誘導(dǎo)至第10 天，對(duì)照組細(xì)胞完全分化，沒有細(xì)胞克隆，而誘導(dǎo)組存在大量細(xì)胞克隆，聯(lián)合誘導(dǎo)組克隆數(shù)量顯著多于其他3組(圖6A和B)。

取誘導(dǎo)至10 d 的細(xì)胞進(jìn)行SSEA-1間接免疫熒光試驗(yàn)，結(jié)果顯示，對(duì)照組沒有明顯的ESC克隆，而5-Azadc組和聯(lián)合組細(xì)胞克隆明顯(圖7)。實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組Nanog基因表達(dá)量隨著誘導(dǎo)天數(shù)延長(zhǎng)持續(xù)下降，而試驗(yàn)組Nanog基因維持相對(duì)穩(wěn)定的水平，進(jìn)一步表明，5-Azadc和TSA可有效地維持雞ESC在體外培養(yǎng)過程中的多能性。

A.5-Azadc最佳誘導(dǎo)濃度的篩選；B.TSA最佳誘導(dǎo)濃度的篩選;C.5-Azadc和TSA聯(lián)合誘導(dǎo)效果檢測(cè)A.The optimal induction concentration screening of 5-Azadc; B.The optimal induction concentration screening of 5-Azadc; C.The combination induction effect of 5-Azadc and TSA on Nanog gene promoter圖5 5-Azadc 和 TSA誘導(dǎo)對(duì)Nanog基因啟動(dòng)活性的影響Fig.5 Effects of 5-Azadc and TSA induction on Nanog promoter activity

A.不同誘導(dǎo)組ESC細(xì)胞克隆40×；B和C.第6和第10天不同誘導(dǎo)組ESC的克隆數(shù)量A.ESC cell clone of different induction group 40×;B and C.The number comparation of different group at the 6th and 10th induction圖6 5-Azadc和TSA誘導(dǎo)對(duì)ESC體外分化的影響Fig.6 The effect of 5-Azadc and TSA induction on the differentiation of ESC in vitro

圖7 SSEA-1間接免疫熒光(A 40×)和Nanog定量檢測(cè)(B)Fig.7 Immunofluorescence staining of SSEA-1(A 40×) and real time quantitative detection of Nanog(B)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)室一直致力于雞ESC向雄性生殖細(xì)胞分化的研究，由于ESC是原代細(xì)胞，在長(zhǎng)時(shí)間的體外培養(yǎng)過程中會(huì)發(fā)生老化和自發(fā)分化，致使其喪失多能性，嚴(yán)重影響體外遺傳修飾和定向誘導(dǎo)分化的效率。因此，如何在體外培養(yǎng)條件下使雞ESC較長(zhǎng)時(shí)期處于未分化狀態(tài)和維持多能性就顯得尤為重要。盡管許多研究表明添加LIF或BMP4 等細(xì)胞因子能夠維持ESC細(xì)胞的多能性[13-14]，但需將ESC生長(zhǎng)于飼養(yǎng)層細(xì)胞上或在培養(yǎng)基中添加細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素、胎牛血清或血清抽提物等。最新的研究結(jié)果表明，利用一些特定的小分子化合物和無(wú)任何生長(zhǎng)因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)基就能很好地維持ESC的不分化狀態(tài)和多能性，尤其是目前已從化學(xué)分子庫(kù)中篩選出一些小分子化合物，并且成功地應(yīng)用于ESC多能性維持的研究中，這些小分子化合物的應(yīng)用簡(jiǎn)化了試驗(yàn)步驟、無(wú)需制備飼養(yǎng)層細(xì)胞，且避免了動(dòng)物源性污染，使得培養(yǎng)體系的組分具體化，對(duì)延長(zhǎng)ESC在體外培養(yǎng)條件下多能性的維持具有重要的意義。

DNA甲基化(DNA methylation)是發(fā)現(xiàn)較早的一種重要的DNA表觀遺傳修飾方式。具體指的是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DMT)的催化作用下，生物體內(nèi)甲基被選擇性地添加到DNA序列的CG兩個(gè)核苷酸的胞嘧啶上，形成5-甲基胞嘧啶的過程。甲基化發(fā)生會(huì)導(dǎo)致核小體之間發(fā)生緊密結(jié)合從而使基因的表達(dá)受到抑制。但是，通過添加小分子化合物使基因發(fā)生去甲基化可使基因再次表達(dá)。5-Azadc就是一種臨床普遍應(yīng)用且效果極佳甲基化抑制劑，大量研究表明，對(duì)于因發(fā)生甲基化而造成表達(dá)沉默的基因，采用5-Azadc進(jìn)行處理后，基因能夠重新得到表達(dá)[15-16]。為了研究DNA甲基化對(duì)雞Nanog基因啟動(dòng)子活性及表達(dá)的影響，本研究對(duì)Nanog基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在-1 662～-1 764 bp和-2 892～-2 993 bp分別存在103和102 bp的CpG島，因此采用5-Azadc處理轉(zhuǎn)染pGL3/1967雙熒光素酶報(bào)告基因載體的DF-1細(xì)胞，檢測(cè)Nanog啟動(dòng)子的活性變化以分析DNA甲基化程度對(duì)啟動(dòng)子活性及表達(dá)的影響；與對(duì)照組相比較，經(jīng)5-Azadc處理后pGL3/1967的轉(zhuǎn)錄活性提高8倍，進(jìn)一步推測(cè)采用5-Azadc處理后抑制了Nanog基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化，從而促使其啟動(dòng)活性增強(qiáng)。由于Nanog基因的表達(dá)活性增強(qiáng)，有利于維持ESC的多能性，促使大量的ESC克隆出現(xiàn)。

組蛋白乙酰化是一個(gè)可逆的反應(yīng)，包含組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(Histone acetyltransferase，HAT)和組蛋白去乙?；?Histone deacetylase，HDAC)，二者相互進(jìn)行反應(yīng)。組蛋白的乙?；欣贒NA與組蛋白八聚體的解離，核小體結(jié)構(gòu)松弛，從而使各種轉(zhuǎn)錄因子和協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子能與DNA結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合，激活基因的轉(zhuǎn)錄。組蛋白的去乙?；?，使得其與帶負(fù)電荷的DNA緊密結(jié)合，染色質(zhì)致密卷曲，基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制。曲古抑菌素(Trichostin A，TSA)能夠與HDAC結(jié)合，抑制組蛋白去乙?；?，促進(jìn)基因表達(dá)[17-18]。R.Cotterman 等[19]研究證實(shí)，可以通過改變基因富集區(qū)域和已知基因遠(yuǎn)距離區(qū)域的組蛋白乙?；瘉?lái)調(diào)節(jié)整個(gè)基因組的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。本試驗(yàn)中，為進(jìn)一步驗(yàn)證Nanog基因的表達(dá)是否存在組蛋白修飾，采用組蛋白去乙酰化酶抑制劑TSA來(lái)誘導(dǎo)Nanog啟動(dòng)活性。分別探索了4個(gè)不同濃度梯度的TSA對(duì)Nanog基因啟動(dòng)活性的影響，發(fā)現(xiàn)終濃度為1.0和1.5 μmoloL-1時(shí)均可極顯著提高Nanog啟動(dòng)活性，表明Nanog基因存在組蛋白修飾作用。即通過TSA處理后，抑制了組蛋白的去乙?；龠M(jìn)Nanog基因的轉(zhuǎn)錄，使其在ESC的表達(dá)量增多，促使較多數(shù)目的ESC克隆出現(xiàn)，延長(zhǎng)ESC體外培養(yǎng)的多能性。

綜上表明，本研究成功構(gòu)建了pEGFP-N1/3049，對(duì)Nanog啟動(dòng)子活性進(jìn)行定性驗(yàn)證，證明其具有啟動(dòng)活性；通過構(gòu)建包含3個(gè)不同長(zhǎng)度Nanog基因啟動(dòng)子片段的熒光素酶報(bào)告載體，分別轉(zhuǎn)染了DF-1細(xì)胞，說(shuō)明Nanog基因啟動(dòng)子的-1 967～-998 bp具有正調(diào)控元件，而在-3 049～-1 967 bp具有負(fù)調(diào)控元件。根據(jù)對(duì)Nanog基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)添加5-Azadc后能明顯促進(jìn)Nanog基因的啟動(dòng)活性，進(jìn)一步表明該基因的啟動(dòng)受到甲基化水平的調(diào)控，這與CEF細(xì)胞和ESC細(xì)胞Nanog基因的甲基化檢測(cè)水平相一致，提示分化的細(xì)胞中Nanog低表達(dá)可能是由于甲基化修飾造成的。TSA的聯(lián)合添加進(jìn)一步提高了Nanog基因的啟動(dòng)活性，說(shuō)明Nanog基因的表達(dá)亦受到乙?；降恼{(diào)控，提示在后續(xù)的研究中，如果要在體外通過提高Nanog基因的表達(dá)量而延長(zhǎng)ESC細(xì)胞的多能性維持時(shí)間可通過添加誘導(dǎo)劑5-Azadc和TSA來(lái)實(shí)現(xiàn)。此外，本研究通過啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件Promoter Scan和TFSEARCH database預(yù)測(cè)分析后發(fā)現(xiàn)：在Nanog基因啟動(dòng)子的-3 049～-1 967 bp存在GCNF、Tcf3和P53等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，缺失該段導(dǎo)致Nanog的轉(zhuǎn)錄活性提高，因此，下一步將定點(diǎn)缺失該結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步驗(yàn)證Nanog的啟動(dòng)子活性，進(jìn)而闡明雞Nanog基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，為有效地提高Nanog的表達(dá)水平提供參考依據(jù)。

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(編輯 程金華)

Effects of 5-Azadc and TSA Induction on Promoter Activity ofNanogand Pluripotency Maintaining in Chicken

ZHANG Ya-ni，WANG Ying-jie，ZUO Qi-sheng，LI Dong，ZHANG Lei，TANG Bei-bei，LIAN Chao，BI Yu-lin，ZHANG Wen-hui，LI Bi-chun*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，KeyLaboratoryofAnimalBreedingReproductionandMolecularDesignforJiangsuProvince，Yangzhou225009，China)

The aim of this study was to cloneNanoggene promoter of chicken and construct the expression vector containing dual luciferase report gene to analyze the promoter activity，find out its core regulatory region，explore the effect of 5-Azadc(5-Aza-2′-deoxycytidine) and TSA(Trichostatin A)on its promoter activity and ESC pluripotent maintaininginvitrocondition，so as to elucidate preliminarily the regulating mechanisms ofNanoggene and provide the theory basis for the future research.The different length fragmentsNanoggene promoter was amplified by PCR technology and cloned into pGL3-basic vector or pEGFP-N1 directly to construct a recombinant vector.After the recombinant vector was transfected into DF-1 cells for 24 h and the protein was collected，the transcriptional activity ofNanoggene was measured by dual luciferase assay system to search for the basic transcriptional regulatory region；The recombinant vector was transfected into DF-1 cells，and methylation inhibitor 5-Azadc or histone deacetylase inhibitor TSA was added to detect its effect on the promoter activity.The third generation ESC was selected and grown into the medium supplemented with the optimum concentration of 5-Azadc and TSA，the cells were observed every 2 d to analyze the pluripotent maintaining of ESCinvitroculture condition，and indirect immune fluorescence of SSEA-1 was detected on the tenth days induction.The results showed that 3 dual luciferase report gene expression vector was constructed successfully.The strongest dual luciferase activity was shown by pGL3/1967；the transcription activity ofNanoggene was enhanced when 5-Azadc and TSA was added single or together.ESC was cultured in the medium with 5-Azadc and TSAinvitro，a great number of cells differentiated after 6 d of induction and cell colony was not maintained in control group，while the cell colony in 5-Azadc and TSA induction group was significant higher than the control group；On the tenth days induction，the cells in control group were fully differentiated，there were still a large number of cell clone in the 5-Azadc + TSA group，the number of colony were significantly more than the other 3 groups；the results of indirect immunofluorescence showed there was no cell colony in the control group，but more colonies were observed in the 5-Azadc and TSA induction group.It further showed that 5-Azadc and TSA could effectively maintain ESC pluripotence of chickeninvitroculture condition by increasing the expression ofNanoggene.

Nanog；promoter；5-Azadc；TSA；dual luciferase activity system

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.008

2015-02-11

國(guó)家自然科學(xué)基金(31301959；31272429；31472087)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20123250120009)；中國(guó)博士后基金((2012M511326))；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

張亞妮(1977-)，女，陜西渭南人，副教授，博士，主要從事動(dòng)物胚胎工程與遺傳工程研究，E-mail：ynzhang@yzu.edu.cn

*通信作者：李碧春，教授，博士，主要從事動(dòng)物胚胎工程與遺傳工程研究，E-mail：yubcli@yzu.edu.cn

S831.2

A

0366-6964(2015)12-2176-09