李鵬飛，孟金柱，劉 巖，黃 洋，陳建偉，姜曉龍，曹 霞，姚曉磊，趙妙妙，呂麗華*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，太谷 030801)

免疫共沉淀篩選牛卵泡CART相互作用蛋白的研究

李鵬飛1，孟金柱2，劉 巖2，黃 洋2，陳建偉2，姜曉龍2，曹 霞2，姚曉磊2，趙妙妙2，呂麗華2*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，太谷 030801)

旨在研究牛卵泡發(fā)育過程中可卡因-苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽(Cocaine-and amphetamine-regulated transcript，CART)相互作用蛋白(Protein-protein interaction，PPI)。選擇4頭10月齡同期發(fā)情的健康母牛，B超檢測卵泡達8～12 mm，屠宰并采集、分離卵泡顆粒細胞(Granulosa cells，GCs)后，進行總蛋白提取，兔抗CART一抗沉淀CART及其相互作用蛋白，經(jīng)Protein G-Agarose磁珠吸附分離，多次洗滌去除鹽分和雜蛋白，洗脫蛋白復(fù)合體并酶解，LC-ESI-Q-TOF質(zhì)譜分析(Mass spectrometry，MS)及數(shù)據(jù)庫比對。結(jié)果顯示：共鑒定蛋白質(zhì)組分111個；經(jīng)Cytoscape V3.1.0分析，有81個蛋白符合功能模塊，并構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖；同時對相互作用蛋白進行功能富集性分析，共分為3大類34組：其中分子功能占11.73%，生物學(xué)過程占46.93%，細胞組分占41.34%。α2巨球蛋白(A2M)和波形蛋白(VIM)與CART相互作用的相關(guān)系數(shù)最大； CART與NALP1、 SERPINH1和PDIA6具有負調(diào)控應(yīng)答的功能，提示可能參與牛卵泡發(fā)育過程的調(diào)控。

牛；CART；免疫共沉淀；質(zhì)譜分析；相互作用

在人和多種動物組織內(nèi)，CART已被成功克隆并測序，其均由2個內(nèi)含子和3個外顯子構(gòu)成。蛋白序列C端有3對二硫鍵維持空間結(jié)構(gòu)并保證CART活性，N端構(gòu)象缺乏規(guī)律性。本課題組在前期研究中，通過卵泡GCs體外培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，CART對牛[1-2]、豬[3]、綿羊[4]卵泡GCs的生長增殖及雌激素分泌具有抑制作用，進而對卵泡發(fā)育產(chǎn)生影響；免疫組化研究也表明，CART在牛[5]、豬[6]、綿羊[7]有腔卵泡的GCs和卵丘細胞層均有表達。本試驗通過Co-IP及MS技術(shù)對影響牛卵泡發(fā)育的CART及其相互作用蛋白進行研究，為探討CART對牛卵泡發(fā)育的調(diào)控機理，進一步明確牛卵泡發(fā)育過程及卵泡相關(guān)激素調(diào)節(jié)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料1.1.1 試驗動物及組織 本試驗牛卵泡GCs總蛋白提取材料來自北京大興區(qū)金維福仁肉牛屠宰場。選取4頭母牛(海福特雜交后代)，屠宰后采集雙側(cè)卵巢，投入4 ℃ DPBS中，實驗室進行卵泡GCs分離。 1.1.2 試劑 兔抗CART一抗(Phoenix pharmaceuticals，美國)，Western及IP細胞裂解液(Beyotime，上海)，Protein G-Agarose磁珠、蛋白酶抑制劑(Roche，瑞士)，酶解試劑盒(Pierce，美國)，色譜級甲醇、乙腈、無水乙醇、甲醛、氯仿、異丙醇、正己烷等均為國產(chǎn)分析純級試劑。

1.2 試驗方法

1.2.1 GCs的分離 母牛屠宰后采集雙側(cè)健康卵泡，眼科剪剪取8～12 mm透明或呈黃色的卵泡，無菌DPBS沖洗兩次后，刮刀刮取卵泡內(nèi)膜GCs，并收集到表面皿的培養(yǎng)液中，2 000 r·min-1離心，棄上清，-80 ℃保存。

1.2.2 GCs總蛋白的提取 預(yù)冷PBS液將GCs沖洗兩次，GCs懸液轉(zhuǎn)移至滅菌離心管中，4 ℃ 1 000 r·min-1離心10 min，棄上清；低滲溶液重懸，4 ℃ 1 000 r·min-1離心5 min，棄上清；低滲溶液重懸沉淀，低溫溶脹35～40 min，4 ℃ 3 000 r·min-1離心15 min，棄上清；加入細胞裂解液，4 ℃孵育30 min；4 ℃ 20 000 r·min-1離心，上清液即為總蛋白溶液；-80 ℃EP管保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 總蛋白濃度測定 測定蛋白溶液280 nm/260 nm紫外吸收值，蛋白濃度=1.45×OD280 nm-0.74×OD260 nm(mg·mL-1)，即可算出蛋白溶液濃度。1.2.4 總蛋白溶液預(yù)處理 將洗脫柱放在離心管上，以每毫克初蛋白滴加80 μL Control Agarose Resin過柱；1 000 r·min-1離心1 min，棄上清；100 μL 1×Coupling Buffer洗柱；1 000 r·min-1離心1 min，棄上清；2 mg初蛋白過柱，4 ℃孵育1 h；離心分離獲得預(yù)處理的總蛋白。

1.2.5 CART一抗免疫沉淀 取等體積的總蛋白和Lysis Buffer及200 μL Protein G-Agarose磁珠于EP管中，1 mL PBS洗滌磁珠，4 ℃ 3 000 r·min-1離心3 min，棄上清，重復(fù)3次；Lysis Buffer清洗1次；總蛋白溶液中加30 μL磁珠，3 000 r·min-1離心3 min；取上清于無菌EP管中，加2 μL稀釋過的CART抗體，4 ℃搖床孵育過夜；加50 μL磁珠，4 ℃搖床孵育2～3 h；4 ℃3 000 r·min-1離心3 min；磁珠分別用500 μL PBS清洗3次，4 ℃3 000 r·min-1離心3 min，棄上清；加10 μL 5×Sample Buffer和20 μL Lysis Buffer，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?.2.6 Co-IP復(fù)合物洗脫及酶解 將Co-IP磁珠轉(zhuǎn)移至無菌EP管中，加入10 μL Elution Buffer洗滌磁珠，1 000 r·min-1離心1 min，收集洗脫液；洗脫柱中加50 μL Elution Buffer，室溫孵育5 min，1 000 r·min-1離心1 min；收集2次洗脫液，即為CART Co-IP復(fù)合物，核酸蛋白檢測儀測定蛋白濃度；0.25%胰酶進行酶解。

1.2.7 LC-ESI-Q-TOF質(zhì)譜分析 使用LC-ESI-Q-TOF質(zhì)譜分析儀，首先液相色譜(Liquid Chromatogram，LC)分離肽段，納流泵流速設(shè)定為0.3 μL·min-1；溶劑A(0.1%甲酸+98.9% ddH2O+1%乙腈)裝入HPLC-Chip富集柱1.5 min后反沖，RP分析柱梯度洗脫；毛細管泵流動相為99% ddH2O+1%乙腈，流速4.0 μL·min-1。

正離子模式下進行蛋白組分析，獲取的 MS/MS經(jīng)MassLynx軟件轉(zhuǎn)化為PKL文件。MASCOT v2.2軟件(www.matrixscience.com)進行數(shù)據(jù)庫搜索，參數(shù)設(shè)定：IPI(The international protein index)Mammalia database(Http：//www.ncbi.nl-m.nih.gov/)；固定修飾選擇Carbamoylmethylation(C)，可變修飾為Oxidation(M)，Trypsin切割，允許最大未酶切位點數(shù)為1，肽段質(zhì)量容差(Peptide Mass Tolerance)為±50 mg·L-1，碎片離子質(zhì)量容差(Fragment Mass Tolerance)為±0.05 u；肽段評分超過閾值[8]視為鑒定肽段，置信度大于95%。

1.2.8 CART相互作用蛋白分析 通過Cytoscape V3.1.0(插件ClusterViz V3.1.0)導(dǎo)入模塊，選擇Wikipathways、Reactome、GeneOntology、KEGG Pathway分析計算，并構(gòu)建蛋白網(wǎng)絡(luò)圖譜。

1.2.9 功能富集性分析 通過Cytoscape V3.1.0對CART相互作用蛋白進行基因功能富集性分析，選擇?；蚪M數(shù)據(jù)庫，超幾何分布檢驗及本杰明-哈氏假陽性率(False discovery rate，F(xiàn)DR)校正，設(shè)定參數(shù)P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 GCs總蛋白提取及定量

經(jīng)測定總蛋白濃度為1.78 μg·μL-1，樣品可用于Co-IP。

2.2 LC-ESI-Q-TOF質(zhì)譜鑒定

胰酶酶解的多肽混合溶液經(jīng)LC分離，質(zhì)譜儀檢測結(jié)果顯示：一級質(zhì)譜(MS)檢測獲得2 522個多肽信息，這些多肽經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離(CID)獲得7 018個碎片離子信息。

圖1為左側(cè)的誘餌庫與右側(cè)的目標(biāo)庫構(gòu)成混合數(shù)據(jù)庫，隨著峰值肽得分增加，肽段頻譜匹配(PSM)數(shù)呈下降趨勢(圖1a)；隨著峰值肽得分的增加，假陽性率明顯降低，母離子質(zhì)量誤差集中在10～30 mg·L-1，混合數(shù)據(jù)庫分界——峰值肽得分(-10lgP)控制在≥23.4(圖1b)；圖2為從頭測序(De Novo)肽段置信度分布，圖2a誘餌庫與目標(biāo)庫重合面積較圖2b要小，與目標(biāo)庫頻譜匹配肽段非重合區(qū)置信度均在50%以上；圖2b為De Novo肽段數(shù)據(jù)庫賦值置信度分布，非重合區(qū)置信度均在79%以上。結(jié)果分析參考B.M.Balgley等[9]的方法，將FDR為1.0%時對應(yīng)的E值作為閾值來篩選Mascot搜索結(jié)果，最終確定肽段頻譜與數(shù)據(jù)庫匹配數(shù)為2 566個(表1)。

蛋白搜索使用 Mascot v2.2搜索引擎，以NCBI nr數(shù)據(jù)庫(35 149 712 sequences；12 374 887 350 residues)中哺乳動物(Mammalia，2 144 738 sequences)數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，設(shè)定匹配評分≥20，單肽段匹配數(shù)≥1，匹配置信度≥50%；顯著性閾值(Significance threshold)P<0.05。結(jié)果顯示，在2 566條頻譜匹配肽段中，對應(yīng)蛋白質(zhì)組分111個(表1)。

表1 篩選結(jié)果統(tǒng)計

Table 1 Statistics of filtered result

項目Filtereditem結(jié)果ResultPeptide?spectrummatches2566Peptidesequences489Proteingroups111Proteins645Proteins(#UniquePeptides)140(>2)；83(=2)；422(=1)FDR(Peptide?spectrummatches)1．0%FDR(Peptidesequences)4．1%FDR(Protein)0．0%Denovoonlyspectra1109

圖1 肽段頻譜匹配(PSM)得分分布Fig.1 Peptide-spectrum matches(PSM)score distribution

圖2 從頭測序結(jié)果確認——肽段置信分布Fig.2 De novo result validation.Distribution of residue local confidence

2.3 CART相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

經(jīng)Cytoscape V3.1.0(插件ClusterViz V3.1.0)導(dǎo)入111個蛋白組分，其中有81個功能模塊符合構(gòu)建CART相互作用網(wǎng)絡(luò)圖譜(圖3)。結(jié)果表明，α2巨球蛋白(A2M)和波形蛋白(VIM)與CART相互作用的相關(guān)系數(shù)最大。

圖3 CART相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Protein interaction network diagram on CART

2.4 蛋白功能富集性分析

經(jīng)Cytoscape V3.1.0導(dǎo)入111個蛋白組分對應(yīng)的基因，進行基因功能富集性分析，結(jié)果見圖4，共分為3大類34組：其中分子功能占11.73%，生物學(xué)過程占46.93%，細胞組分占41.34%。在卵泡發(fā)育過程中，CART主要抑制卵泡GCs的增殖及E2的分泌，從而發(fā)揮其負調(diào)控的功能，功能富集性分析結(jié)果顯示，CART與NALP1、SERPINH1和PDIA6的負調(diào)控應(yīng)答(Negative regulation of response)功能提示，這些基因或蛋白可能對卵泡的發(fā)育產(chǎn)生重要影響。

圖4 CART相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Protein interaction network diagram on CART

3 討 論

蛋白質(zhì)組學(xué)從蛋白質(zhì)整體作用關(guān)系來研究生物有機體[10-11]，而PPI作為細胞調(diào)節(jié)和信號傳導(dǎo)的基本要素，對蛋白功能的實現(xiàn)發(fā)揮決定作用[12-13]。陳娟[14]應(yīng)用細菌雙雜交技術(shù)對CART的PPI做過研究。在本試驗中，采用Co-IP技術(shù)獲得CART蛋白復(fù)合體，經(jīng)酶解及質(zhì)譜分析對CART的PPI進行研究，Protein G瓊脂糖磁珠Co-IP是利用細菌蛋白的“Protein G”作為抗原特異性結(jié)合抗體的Fc區(qū)段的原理而開發(fā)的方法；試驗過程中涉及到抗體及總蛋白的純度、抗體-Agarose beads的特異性結(jié)合、復(fù)合物洗滌效果及質(zhì)譜分析結(jié)果的鑒定，均會影響到研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。

由相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)圖可知，A2M和VIM與CART的相關(guān)系數(shù)最大。A2M基因全長4 900 bp，定位于牛第5號染色體，為α-巨球蛋白家族的一員，在動物體內(nèi)通過對內(nèi)外源蛋白酶活性的調(diào)節(jié)來執(zhí)行其生理功能[15]。VIM(Vimentin)為波形蛋白，在間質(zhì)組織廣泛表達，對細胞完整性的維持及細胞應(yīng)激反應(yīng)的產(chǎn)生具有重要作用[16]；研究也表明，在許多疾病尤其是一些惡性腫瘤發(fā)生過程中，均有VIM的異常表達，造成癌細胞的生長、遷移加速，預(yù)后效果較差[17]。僅通過功能及相關(guān)系數(shù)還不能確定三者的關(guān)系，還有待進一步研究。

通過對CART相互作用蛋白的功能富集性分析表明，CART與NALP1、SERPINH1、PDIA6具有負調(diào)控應(yīng)答的功能，可能通過啟動GCs凋亡程序進而影響了卵泡的正常發(fā)育。NALP1為NOD樣受體超家族蛋白，在動物體內(nèi)誘導(dǎo)細胞凋亡體的形成；整個過程中，caspse-2、caspase-3和caspase-9通過與NALP1相互作用，進一步加速凋亡體的形成。F.Liu等[18]在HELA細胞體外培養(yǎng)研究中證實，NALP1通過誘導(dǎo)激活caspase-3促進HELA細胞的凋亡；C.F.Frederick Lo等[19]通過基因重組技術(shù)瞬時表達重組NALP1的神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)，該神經(jīng)元細胞誘導(dǎo)caspase-3活化并促進細胞凋亡，表明NALP1在受損神經(jīng)元內(nèi)可能參與細胞凋亡蛋白酶活化的調(diào)節(jié)。SERPINH1屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族蛋白，通過對該蛋白功能的研究發(fā)現(xiàn)：SERPINH1與腫瘤細胞的生長和成骨不全癥的形成有關(guān)。在人和小鼠體內(nèi)SERPINH1基因發(fā)生變異，可導(dǎo)致蛋白裝配、折疊和分泌過程異常，導(dǎo)致胎兒發(fā)育受阻及骨骼形成異常[20-22]；Y.Y.Yu等[23]應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，SERPINH1基因沉默后對模型小鼠的腫瘤生長有促進作用，即SERPINH1具有腫瘤抑制作用；PDIA6分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體中心區(qū)域，目前，PDIA6與細胞生長調(diào)節(jié)的相關(guān)性主要體現(xiàn)在腫瘤研究方面，PDIA6通過信號通路激活及蛋白折疊反應(yīng)激活，促進腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲[24-25]。

為了確定CART的受體，前人已做了大量研究[26-28]，到目前基本明確了CART受體的相關(guān)特性，但受體蛋白仍未確定。本研究通過Co-IP技術(shù)對CART相互作用蛋白進行研究，為進一步確定CART受體奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究經(jīng)Co-IP及質(zhì)譜分析共獲得111個CART相互作用蛋白并構(gòu)建CART相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)，其中CART與A2M和VIM的相關(guān)系數(shù)最大；功能富集性分析發(fā)現(xiàn)：CART與NALP1、SERPINH1和PDIA6具有負調(diào)控應(yīng)答的功能，提示可能參與牛卵泡發(fā)育過程的調(diào)控。

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(編輯 程金華)

Screening Proteins Interacting with Cocaine-and Amphetamine-Regulated Transcript in Bovine Follicles by Co-immunoprecipitation

LI Peng-fei1，MENG Jin-zhu2，LIU Yan2，HUANG Yang2，CHEN Jian-wei2，JIANG Xiao-long2，CAO Xia2，YAO Xiao-lei2，ZHAO Miao-miao2，Lü Li-hua2*

The study is focused on screening the proteins interacting with cocaine-and amphetamine-regulated transcript(CART) during follicle development in bovine.Four 10-month-old healthy cows，treated for estrus synchronization，were monitored by B-ultrasonic machine to find the ovarian follicles with the diameter of 8-12 mm，which were collected followed by cows being slaughtered.The granulosa cells(GCs) were isolated from those ovarian follicles and then total protein was extracted.CART and the binding protein were deposited by primary antibodies(Rabbit anti CART) using Protein G-Agarose magnetic beads，followed by salt and miscellaneous protein being removed by washing repeatedly.Protein complexes was analyzed by LC-ESI-Q-TOF mass spectrometry(MS) and alignment followed by being eluted and digested by trypsin.Results showed that 111 proteins were identified，in which 81 proteins were functional in conformity with the interaction network modules by Cytoscape V3.1.0 analysis.For the function enrichment analysis，those 81 proteins were classified into 34 groups in 3 categories：molecular function(11.73%)，biological processes(46.93%)，cell component(41.34%).The correlation coefficient of the interaction between A2M，VIM and CART was maximum.It was also found CART was negatively regulated by NALP1，SERPINH1 and PDIA6，which suggested that they might participate in regulating follicle development in bovine.

bovine；CART；co-immunoprecipitation；mass spectrometry；interaction

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.007

2015-03-26

國家自然科學(xué)基金(31172211)；農(nóng)業(yè)部948項目(2010-Z43)；山西省橫向協(xié)作與委托項目(2010HX54)；山西省回國留學(xué)人員科研資助項目(2014-重點5)；山西省科技攻關(guān)項目(20130311027-2)；山西省人事廳人才引進項目；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)引進人才博士科研啟動費(2014ZZ04)；科研管理費資助重大項目和標(biāo)志性成果培育項目(71060003)

李鵬飛(1978-)，男，山西偏關(guān)人，博士，副教授，主要從事動物生殖生理方面的研究，E-mail：adamlpf@126.com

*通信作者：呂麗華，E-mail：lihualvsxau@126.com

S823.2

A

0366-6964(2015)12-2169-07

(1.CollegeofLifeScience，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China；2.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China)