宋志琦，趙文杰，楊利峰，王運(yùn)盛，朱 婷，程廣宇，周向梅，趙德明*

( 1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，國(guó)家動(dòng)物海綿狀腦病實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450000)

BAT3過(guò)表達(dá)緩解由PrP106-126毒性多肽誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡

宋志琦1#，趙文杰2#，楊利峰1，王運(yùn)盛1，朱 婷1，程廣宇1，周向梅1，趙德明1*

( 1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，國(guó)家動(dòng)物海綿狀腦病實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450000)

擬檢測(cè)BAT3蛋白過(guò)表達(dá)對(duì)由PrP106-126毒性多肽引起的神經(jīng)元凋亡現(xiàn)象的影響。首先通過(guò)免疫熒光、CCK8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒和免疫印跡檢測(cè)帶FITC標(biāo)簽的PrP106-126-FITC毒性多肽的生物學(xué)毒性。分別用PrP106-126-FITC和PrP106-126神經(jīng)毒性多肽處理原代神經(jīng)元和Neuro2a細(xì)胞，通過(guò)免疫熒光技術(shù)和免疫印跡方法分別檢測(cè)受刺激后的原代神經(jīng)元和Neuro2a細(xì)胞中BAT3表達(dá)的變化情況。通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將已經(jīng)構(gòu)建好的pcDNA-3.1-HA-BAT3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入原代神經(jīng)元，用CCK8檢測(cè)細(xì)胞活性；以同樣方式將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞系Neuro2a，用TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒分析經(jīng)BAT3轉(zhuǎn)染或?qū)φ战M的N2a細(xì)胞的凋亡水平；Western blot檢測(cè)PrP106-126神經(jīng)毒性多肽處理前后，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞色素C和Bcl-2的變化，進(jìn)一步了解BAT3在神經(jīng)元凋亡中發(fā)揮作用的機(jī)制。結(jié)果顯示，PrP106-126-FITC和PrP106-126神經(jīng)毒性多肽具有相似的神經(jīng)毒性。受到多肽刺激之后，無(wú)論在原代神經(jīng)元還是傳代細(xì)胞系Neuro2a中，BAT3都發(fā)生核輸出現(xiàn)象，BAT3從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。BAT3的過(guò)表達(dá)使受到PrP106-126毒性多肽刺激的神經(jīng)元的細(xì)胞活性有所提高，Neuro2a的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象減輕，同時(shí)抑制了由PrP106-126毒性多肽引起的細(xì)胞色素C的過(guò)度釋放并且維持細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2的穩(wěn)定。BAT3蛋白的表達(dá)緩解PrP106-126毒性多肽對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成的凋亡現(xiàn)象，為進(jìn)一步闡釋該蛋白質(zhì)對(duì)朊病毒引起的神經(jīng)元損失的治療作用機(jī)制提供了依據(jù)。

BAT3；PrP106-126毒性多肽；神經(jīng)凋亡；傳染性海綿狀腦病；原代神經(jīng)元

朊病毒病(prion disease)是一組累及人類和動(dòng)物的傳染性神經(jīng)退行性疾病，隨著瘋牛病和人類變異性克雅病(variant Creutzfeldt-Jacob disease，vCJD)的出現(xiàn)，該類疾病對(duì)公共衛(wèi)生和人類健康的威脅日益顯著[1-2]。組織病理學(xué)病變局限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)，以神經(jīng)元空泡化、灰質(zhì)海綿狀病變、神經(jīng)元喪失、神經(jīng)膠質(zhì)和星狀細(xì)胞增生、病原因子PrPSc蓄積和淀粉樣蛋白質(zhì)斑塊為特征[3]。PrP106-126是細(xì)胞性朊蛋白的一個(gè)多肽片段，位于朊蛋白的N端，最早報(bào)道于 1993 年[4-5]，其具有類似于 PrPSc的生化特性，例如富含β-折疊以及具有蛋白酶抗性等，該多肽在體外對(duì)神經(jīng)元具有神經(jīng)毒性，同時(shí)該多肽的神經(jīng)毒性在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)也得到證實(shí)，其為淀粉樣病變形成的重要參與分子。正由于其特殊的性質(zhì)，現(xiàn)在 PrP106-126 已成為在體外研究朊病的朊病毒模型，被廣泛應(yīng)用于朊病的致病機(jī)制的研究。人類白細(xì)胞抗原B相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3(BAT3)，于1990年被發(fā)現(xiàn)位于人類6號(hào)染色體上，屬于主要組織相容性復(fù)合物(MHC)第三族的成員。BAT3是一個(gè)多功能蛋白，其中一項(xiàng)重要的功能是其對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用[6-8]。但是BAT3在神經(jīng)細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)對(duì)由PrP106-126毒性多肽引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的緩解作用尚未有人研究與報(bào)道過(guò)。BAT3本身可能成為藥物的研究靶點(diǎn)，對(duì)朊病及相關(guān)神經(jīng)退行性疾病的治療有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

BAT3鼠源單克隆抗體，細(xì)胞色素C兔源多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；HA標(biāo)簽鼠源單克隆抗體，Bcl-2(P65)兔源多克隆抗體，β-actin兔源多克隆抗體，Lamin B1鼠源單克隆抗體，GAPDH兔源多克隆抗體，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自Bioworld公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠二抗，Alexa Fluor594標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗購(gòu)自中杉金橋公司；FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗和Cy5標(biāo)記的山羊抗兔二抗，兔源TUBB3/betaIII tubulin(神經(jīng)元標(biāo)記物)購(gòu)自博奧森公司，神經(jīng)元III族-β-Tubulin(Tuj1)抗體，DAPI二氫氯化物和碘化丙啶(PI)，免疫熒光染色用的免疫固定液、免疫洗滌液，免疫封閉液購(gòu)自碧云天公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000和無(wú)血清培養(yǎng)基Opti-MEM購(gòu)自Invitrogen公司；細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)提取試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司；多肽：朊蛋白多肽片段(KTNMKHMAGA AAAGAVVGGLG；PrP106-126)由上海生物公司合成；FITC標(biāo)記的PrP106-126毒性多肽購(gòu)自FANBO生化制劑公司；TUNEL試劑盒購(gòu)自Roche公司；2 mmol·L-1多肽以PBS配制，存儲(chǔ)于-20 ℃；電泳儀、電轉(zhuǎn)儀均為美國(guó)BIO-RAD產(chǎn)品。

1.2 Neuro2a細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)

1.3 原代神經(jīng)元的分離與培養(yǎng)

出生24 h內(nèi)的SD乳鼠75%酒精浸泡消毒5～10 min，浸于無(wú)菌水中清洗，取頭置無(wú)菌平皿中，小剪刀沿大腦中部將皮膚剪開(kāi)，露出顱骨。眼科剪沿著顱骨中縫剪開(kāi)，用小止血鉗去除顱骨，暴露出大腦皮質(zhì)和小腦，小心分離出大腦，置4 ℃ DMEM液中(冰上)，在解剖顯微鏡下分離出雙側(cè)大腦皮層，仔細(xì)剝除軟腦膜和血管，然后沉淀洗滌分離出的組織5～6次(每次靜止2 min，棄上清)，將分離的大腦皮質(zhì)部分剪碎成1～2 mm3的小組織塊。將組織懸液置于無(wú)菌的瓶中消化，加入終質(zhì)量濃度3 mg·mL-1木瓜蛋白酶+適量(0.05 mg·mL-1)DNA酶。37 ℃培養(yǎng)箱消化30～40 min，每10 min稍微搖動(dòng)一下。加入少許血清終止反應(yīng)，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入3～4 mL DMEM。用大口徑吸管(配合槍頭吹打)輕輕吹打組織塊使細(xì)胞均勻分散為初細(xì)胞懸液。對(duì)初級(jí)細(xì)胞懸液經(jīng)75 μm的不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min(差速去雜細(xì)胞)后，臺(tái)盼藍(lán)染色后細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞1 000 r·min-1離心5 min，用10%胎牛血清的DMEM/F12+0.5%B27培養(yǎng)液懸起細(xì)胞沉淀。將初細(xì)胞懸液經(jīng)計(jì)數(shù)稀釋到2×106·mL-1，接種到預(yù)先經(jīng)50 μg·mL-1多聚左旋賴氨酸包被的培養(yǎng)板中，12孔板500 μL，置CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h換液，每孔加1 mL培養(yǎng)基，24 h后半量換液，加入10 μmol·L-1的阿糖胞苷以抑制膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)，以后每隔48 h半量換液1次。培養(yǎng)6～7 d使用細(xì)胞。

1.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

收獲處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的N2a細(xì)胞或原代神經(jīng)元細(xì)胞，以2×105·孔-1接種于12孔培養(yǎng)板中，37 ℃，5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%融合，按轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑的比例為2 μg∶3 μL，轉(zhuǎn)染過(guò)程使用Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后5 h換為正常細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的10%FBS培養(yǎng)基。用于Western blot檢測(cè)的細(xì)胞分為陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HA空載體)和試驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HA-BAT3重組質(zhì)粒)。用于免疫熒光試驗(yàn)的細(xì)胞接種于之前鋪好爬片的12孔培養(yǎng)板中。轉(zhuǎn)染48 h后收集蛋白質(zhì)進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)。

1.5 免疫熒光試驗(yàn)

教學(xué)任務(wù)是數(shù)學(xué)教學(xué)的載體，學(xué)生的學(xué)習(xí)很大程度上受任務(wù)的影響．在創(chuàng)造性數(shù)學(xué)課堂中，教師選擇的任務(wù)類型及教學(xué)策略不僅影響學(xué)生如何感知數(shù)學(xué)這門(mén)創(chuàng)造性學(xué)科，還影響學(xué)生數(shù)學(xué)創(chuàng)造性潛能的發(fā)展．

用潔凈的蓋玻片種入細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼在蓋玻片上生長(zhǎng)良好后，進(jìn)行過(guò)表達(dá)或用毒性多肽處理。前期試驗(yàn)結(jié)束后，進(jìn)行免疫熒光染色。免疫染色固定液室溫固定30 min以上。然后用免疫染色洗滌液洗滌2次，每次5 min。加入免疫染色封閉液，封閉60 min。按照適當(dāng)比例用稀釋一抗： BAT3抗體為1∶100、HA抗體為1∶1 000、TUBB3/beta III tubulin神經(jīng)元標(biāo)記物為1∶100、Tuj1為1∶250。吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，37 ℃孵育2 h。 之后棄去一抗，洗滌液洗滌5 min，共洗滌3次。按照適當(dāng)比例稀釋二抗：Alexa Fluor 594標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗、FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗和Cy5標(biāo)記的山羊抗兔二抗稀釋比例都為1∶100。吸盡洗滌液后，立即加入稀釋好的二抗，37 ℃孵育1 h。 之后加入免疫染色洗滌液，洗滌5 min，共洗滌3次。最后加入DAPI染核3 min，洗滌5 min，共洗滌3次。用抗淬滅劑封片，在正置激光共聚焦顯微鏡(Olympus，日本)下觀察。

1.6 CCK8細(xì)胞活力檢測(cè)試驗(yàn)

依照CCK8檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)不同試驗(yàn)組進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)，各組細(xì)胞接種到96孔板中，經(jīng)過(guò)前期試驗(yàn)處理后，每組加入10 μL WST-8試劑，之后將96孔板放回細(xì)胞培養(yǎng)箱，在 37 ℃、5% CO2的條件下孵育2 h。樣品檢測(cè)時(shí)的吸光度為450 nm，以空白組作為對(duì)照。

1.7 TUNEL試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將培養(yǎng)好的細(xì)胞調(diào)整到2×105·mL-1，加入鋪好爬片的12 孔培養(yǎng)板上。首先進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別將BAT3重組質(zhì)粒和空載體轉(zhuǎn)染入N2a細(xì)胞，然后將室溫處理過(guò)的終濃度為 200 μmol·L-1PrP106-126作用于經(jīng)轉(zhuǎn)染的N2a細(xì)胞以及設(shè)立未轉(zhuǎn)染對(duì)照組，每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)24 h后按照試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行TUNEL檢測(cè)，最后用PI染核，以顯示所有細(xì)胞數(shù)目。使用正置激光共聚焦顯微鏡(Olympus，日本)觀察。

1.8 Western blot檢測(cè)細(xì)胞色素C、Bcl-2、BAT3

細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白質(zhì)的提取按照試劑盒(武漢博士德公司)說(shuō)明書(shū)操作。提取各試驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)，將樣品調(diào)成相同的濃度，加入5×SDS凝膠加樣緩沖液，沸水煮10 min，用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，將膜與一抗4 ℃ 孵育過(guò)夜，一抗的稀釋濃度：兔抗HA標(biāo)簽抗體1∶3 000稀釋；鼠抗BAT3抗體1∶100稀釋；兔抗細(xì)胞色素C抗體1∶500稀釋；兔抗Bcl-2抗體1∶500稀釋；兔源β-actin 抗體1∶3 000稀釋。用TBST洗膜3次，每次5 min，再與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠源(1∶5 000)或兔源(1∶5 000)二抗在室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，用化學(xué)發(fā)光液室溫孵育5 min，曝光。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)元細(xì)胞的鑒定

用兩種神經(jīng)元特異性抗體對(duì)分離的神經(jīng)元進(jìn)行鑒定，如圖1所示，兩種抗體的熒光染色都顯示所分離的神經(jīng)元純度很高。

圖1 神經(jīng)元細(xì)胞的鑒定(比例尺=20 μm)Fig.1 The identification of the primary cultures of rat cortical neurons(bar=20 μm)

2.2 PrP106-126-FITC在細(xì)胞中的定位和細(xì)胞毒性的檢測(cè)

用免疫熒光的方式對(duì)PrP106-126-FITC進(jìn)行亞細(xì)胞定位，如圖2所示，PrP106-126-FITC被神經(jīng)元細(xì)胞吞噬之后，主要在細(xì)胞質(zhì)中核周?chē)嬖凇Ｓ肅CK8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒對(duì)各試驗(yàn)組進(jìn)行細(xì)胞活力測(cè)定，結(jié)果表明PrP106-126-FITC與PrP106-126有相似的細(xì)胞毒性；隨后免疫印跡方法驗(yàn)證同樣的結(jié)果，PrP106-126-FITC與PrP106-126相似，可以引起細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的釋放(圖2)。

A.PrP106-126-FITC亞細(xì)胞定位(比例尺=10 μm)；B、C.CCK8和WB對(duì)細(xì)胞毒性的檢測(cè)A.Subcellular localization of PrP106-126-FITC(Scale bars=10 μm)；B，C.Cytotoxicity assay by CCK8 and WB圖2 PrP106-126-FITC和PrP106-126具有相似的細(xì)胞毒性Fig.2 PrP106-126-FITC has similar cytotoxicity to PrP106-126

2.3 用PrP106-126毒性多肽刺激原代神經(jīng)元或N2a細(xì)胞后，BAT3從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)

用免疫熒光和免疫印跡兩種方法分別檢測(cè)PrP106-126刺激細(xì)胞后，BAT3的亞細(xì)胞定位情況。如圖3(A)所示，在未受刺激的細(xì)胞中，BAT3主要在細(xì)胞核中存在，PrP106-126-FITC刺激之后，BAT3向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移。PrP106-126刺激后，收獲不同時(shí)間段的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核蛋白質(zhì)，用GAPDH和Lamin B分別作為內(nèi)參蛋白質(zhì)，圖3(B)顯示，PrP106-126刺激后，3～24 h，細(xì)胞質(zhì)中的BAT3逐漸增加，經(jīng)過(guò)檢測(cè)細(xì)胞核BAT3蛋白的變化，我們了解到，這種變化是由于蛋白質(zhì)從胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)。

用FITC標(biāo)記的PrP106-126毒性多肽刺激原代神經(jīng)元24 h，用免疫熒光染色試驗(yàn)證實(shí)，多肽刺激之后，BAT3從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)(圖3A)。Western blot證實(shí)PrP106-126毒性多肽刺激N2a細(xì)胞后，BAT3蛋白從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移。分別收獲不同時(shí)間段的細(xì)胞，提取細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核BAT3蛋白，分別用β-actin和Lamin B1作為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的內(nèi)參蛋白質(zhì)，經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)相對(duì)密度分析，證實(shí)BAT3蛋白的核輸出(圖3B、C)。

2.4 BAT3過(guò)表達(dá)后可以緩解由PrP106-126毒性多肽引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡

分別用CCK8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒(圖4A)和TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(圖4C)檢測(cè)BAT3的過(guò)表達(dá)對(duì)受PrP106-126刺激的細(xì)胞的影響。TUNEL試驗(yàn)證實(shí)BAT3過(guò)表達(dá)之后，與只攻毒組以及轉(zhuǎn)染空載體+攻毒組相比，神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平明顯下降。Western blot檢測(cè)BAT3在對(duì)應(yīng)組別中的表達(dá)量(圖4B)。兩個(gè)試驗(yàn)結(jié)果相似，都說(shuō)明BAT3過(guò)表達(dá)后可以緩解由PrP106-126毒性多肽引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

2.5 用PrP106-126毒性多肽刺激Neuro2a細(xì)胞引起細(xì)胞色素C向細(xì)胞質(zhì)中的釋放以及Bcl-2抗凋亡蛋白水平下調(diào)

進(jìn)一步了解BAT3對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用的機(jī)制。首先驗(yàn)證經(jīng)典通路，作者用PrP106-126刺激Neuro2a細(xì)胞，收獲細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)，檢測(cè)細(xì)胞色素C和Bcl-2的變化情況。結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道相符合，如圖5(A 和B)所示，受到刺激后，隨著刺激時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C逐漸增多，Bcl-2逐漸減少。2.6 BAT3過(guò)表達(dá)后可以抑制細(xì)胞色素C向細(xì)胞質(zhì)的釋放，同時(shí)穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)中Bcl-2抗凋亡蛋白的水平

進(jìn)一步了解BAT3過(guò)表達(dá)后，PrP106-126刺激對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞中這兩種蛋白質(zhì)的影響。BAT3過(guò)表達(dá)后，即使PrP106-126刺激24 h，與只經(jīng)受PrP106-126孵育的細(xì)胞相比，細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的釋放量明顯減少，Bcl-2的表達(dá)量明顯增加(圖6A)。并且細(xì)胞色素C的釋放量與BAT3的轉(zhuǎn)染劑量成反比關(guān)系減少(圖6B)。隨著B(niǎo)AT3表達(dá)量的增加，細(xì)胞色素C的釋放量逐漸減少。

圖3 受到PrP106-126刺激后，BAT3的核輸出(比例尺=5 μm)Fig.3 PrP106-126 stimulation induces BAT3 export from nucleus to cytoplasm(Scale bars=5 μm)

圖4 BAT3過(guò)表達(dá)后可以緩解由PrP106-126毒性多肽引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡(比例尺=5 μm)Fig.4 BAT3 overexpression increases cell viability and suppresses PrP106-126-induced neuronal apoptosis(Scale bars=5 μm)

3 討 論

3.1 PrP106-126-FITC和PrP106-126具有相似的細(xì)胞毒性

首次對(duì)FITC標(biāo)記的PrP106-126毒性多肽在神經(jīng)元中進(jìn)行定位和細(xì)胞毒性檢測(cè)。PrP106-126-FITC主要分布在神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞核周?chē)植?。它具有和PrP106-126相似的細(xì)胞毒性，攻毒后可以誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的釋放。因?yàn)镻rP106-126-FITC帶有熒光標(biāo)記的FITC標(biāo)簽，使作用后的定位可視化，便于研究中直接、準(zhǔn)確地觀察攻毒前后的變化。

3.2 對(duì)BAT3在由PrP106-126毒性多肽引起的神經(jīng)元凋亡中作用的深入研究填補(bǔ)了BAT3作為抗凋亡蛋白，在海綿狀腦病中發(fā)揮作用機(jī)制研究的空白

人類白細(xì)胞抗原B相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3(BAT3)，于1990年被發(fā)現(xiàn)位于人類6號(hào)染色體上，屬于主要組織相容性復(fù)合物(MHC)第三族的成員。BAT3是一個(gè)多功能蛋白質(zhì)，其中一項(xiàng)重要的功能是其對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用[9]。BAT3含有一段核定位信號(hào)(NLS)和一段核輸出信號(hào)(NES)，表明它具有核輸出功能。蛋白通過(guò)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)間的穿梭調(diào)節(jié)凋亡，維持轉(zhuǎn)錄因子的基本活動(dòng)。BAT3作為細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)穿梭蛋白早有報(bào)道，它可以通過(guò)此過(guò)程調(diào)節(jié)由結(jié)核抗原ESAT-6(早期分泌抗原靶點(diǎn)-6)、喜樹(shù)堿(CPT)-a拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、乳頭瘤病毒綁定因子(PBF)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[8，10-12]。與此前的報(bào)道相一致的是，作者的研究發(fā)現(xiàn)，N2a細(xì)胞受到PrP106-126毒性多肽刺激之后，BAT3表現(xiàn)為時(shí)間依賴性核輸出。之前有報(bào)道表明，BAT3的轉(zhuǎn)移至少有部分原因來(lái)自于其伴侶分子TRC35(跨膜區(qū)識(shí)別復(fù)合物35)對(duì)NLS信號(hào)的覆蓋[13]。作者推測(cè)，受到PrP106-126毒性多肽刺激后，BAT3蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的瞬時(shí)增加可能為細(xì)胞對(duì)凋亡的抵御機(jī)制，但是之后由于蛋白酶系統(tǒng)或其他的動(dòng)力學(xué)機(jī)制，BAT3可能被降解而失去抗凋亡作用。因?yàn)樽鳛锽AG蛋白家族成員之一，BAG3在受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡過(guò)程中會(huì)被蛋白酶降解。為了深入了解BAT3

A、B.PrP106-126誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的釋放和Bcl-2的減少；C.外源BAT3和PrP106-126的共定位(比例尺=5 μm)A，B.PrP106-126 induced Cytochrome C release and Bcl-2 protein decrease in the cytoplasm；C.The exogenous BAT3 colocalized with PrP106-126 in the cytoplasm(Scale bars=5 μm)圖5 PrP106-126毒性多肽刺激Neuro2a細(xì)胞引起細(xì)胞色素C以及Bcl-2的變化Fig.5 PrP106-126 induced changes of cytochrome C release and Bcl-2 protein in the cytoplasm of Neuro2a

圖6 過(guò)表達(dá)全長(zhǎng)BAT3抑制由PrP106-126誘導(dǎo)的細(xì)胞色素C的釋放和Bcl-2的減少Fig.6 Overexpression of full-length BAT3 inhibits PrP106-126-induced cytochrome C release and stabilizes the Bcl-2 protein

在此過(guò)程中的作用機(jī)制，作者過(guò)表達(dá)BAT3，探索BAT3作為藥物靶點(diǎn)可能發(fā)揮的作用。之前有報(bào)道指出，Bcl-2本身可以通過(guò)抑制細(xì)胞色素C的釋放抑制細(xì)胞凋亡[14]，另一方面，BAT3(BAG6)屬于BAG蛋白家族，擁有一組保守的BAG蛋白區(qū)域，該家族其他成員，比如BAG1、BAG3、BAG4可以通過(guò)BAG區(qū)域與Bcl-2相關(guān)聯(lián)[15]。與之前的研究相一致的是，試驗(yàn)結(jié)果表明，BAT3的過(guò)表達(dá)可以緩解由PrP106-126毒性多肽誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，并且這一

過(guò)程是通過(guò)抑制細(xì)胞色素C的釋放和穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)中Bcl-2的含量所發(fā)揮的作用。

3.3 由PrP106-126毒性多肽引起神經(jīng)元凋亡作用機(jī)制的新思路，為相關(guān)疾病的研究提供新思路，拓展新思維，為相關(guān)藥物研發(fā)提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)

BAT3為一個(gè)多功能蛋白質(zhì)，在蛋白酶體系統(tǒng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白質(zhì)降解、錯(cuò)誤折疊和錯(cuò)誤蛋白質(zhì)降解中也發(fā)揮重要作用。其在朊病毒和神經(jīng)退行性疾病中的作用可能不止如此，還有待進(jìn)一步研究。

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(編輯 白永平)

Overexpression of BAT3 Alleviates Prion Protein Fragment PrP106-126-Induced Neuronal Apoptosis

SONG Zhi-qi1#，ZHAO Wen-jie2#，YANG Li-feng1，WANG Yun-sheng1，ZHU Ting1，CHENG Guang-yu1，ZHOU Xiang-mei1，ZHAO De-ming1*

(1.StateKeyLaboratoriesforAgrobiotechnology，KeyLabofAnimalEpidemiologyandZoonosis，MinistryofAgriculture，NationalAnimalTransmissibleSpongiformEncephalopathyLaboratory，CollegeofVeterinaryMedicine，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China；2.CollegeofAnimalHusbandaryandVeterinaryScience，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450000，China)

The objective of this study was to investigate the interactions between BAT3 and prion protein and the potential role of BAT3 in PrP106-126-induced apoptosis.Immunofluorescence，the CCK-8 assay kit and western blotting were used to test the cytotoxicity of PrP106-126-FITC.After the stimulation of PrP106-126-FITC or PrP106-126，the location of BAT3 was tested by immunofluorescence and western blotting in the neurons.BAT3 was overexpressed in Neuro2a or primary neuronal cells by transfection with pcDNA3.1-HA-BAT3 expression plasmids.The effect of BAT3 on PrP106-126-induced cytotoxicity and apoptosis were detected by the CCK-8 assay and TUNEL assay.The expression of cytochrome c and Bcl-2 were examined by western blotting.Results were as follows：PrP106-126-FITC has similar cytotoxicity with PrP106-126.BAT3 interacted with prion protein and enhanced PrP expression.After PrP106-126 peptide treated，BAT3 was transported from the nucleus to cytoplasm，increased cell viability and protected neurons from PrP106-126-induced apoptosis through stabilizing the level of Bcl-2 protein and inhibiting the release of cytochrome c to cytoplasm.Our present data showed a novel molecular mechanism of PrP106-126-induced apoptotic process regulation through the overexpression of BAT3，which may be important for the basic regulatory mechanism of neuron survival in prion diseases and associated neurodegenerative diseasesinvivo.

BAT3；PrP106-126；neuronal apoptosis；transmissible spongiform encephalopathies；primary cortical neurons

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.022

2014-09-04

國(guó)家自然科學(xué)基金(31272532)

宋志琦(1989-)，女，內(nèi)蒙古赤峰人，博士生，主要從事動(dòng)物海綿狀腦病致病機(jī)制和獸醫(yī)病理學(xué)方面工作，E-mail:songzhiqi1989@gmail.com；趙文杰(1990-)，女，山東人，研究生，主要從事動(dòng)物海綿狀腦病致病機(jī)制和獸醫(yī)病理學(xué)方面工作，E-mail:hnndwenjiezhao@163.com。二者為共同第一作者

*通信作者：趙德明，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：zhaodm@cau.edu.cn

S852.659.7

A

0366-6964(2015)05-0841-08